乙酰丁香酮对不同糯玉米受体系统遗传转化的影响

２０１３年２６卷３期　西南农业学报　Ｖ０１．２６　Ｎ　３　Ｓｏｕｔｈｗｅｓｔ　Ｃｈｉｎａ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ　文章编号：１００１—４８２９（２０１３）０３—０８９９—０４　乙酰丁香酮对不同糯玉米受体系统遗传转化的影响　郭新梅　，车昕明　，裴玉贺　，宋希云ｈ　（１．青岛农业大学农学与植物保护学院，山东青岛２６６１０９；２．山东登海种业股份有限公司／山东省玉米育种与栽培技术企业重点　实验室，山东莱州２６１４４８）　摘要：乙酰丁香酮（ＡＳ）对农杆菌介导的遗传转化有着重要的影响，为提高糯玉米遗传转化率，本试验以莱农糯３８的茎尖和幼胚　愈伤组织为受体材料，比较悬浮培养基的ｐＨ，乙酰丁香酮添加方式及浓度对格玉米遗传转化的影响。结果表明：悬浮培养基ｐＨ　为５．２，在伤口处滴加２　浓度为１５０　ｐ．ｍｏｌ／Ｌ的Ａｓ能显著提高糯玉米茎尖转化的效率。玉米愈伤转化中，在侵染液中添加５　ｍｓ／　Ｌ的ＡＳ能显著提高抗性愈伤率。　关键词：受体系统；乙酰丁香酮；添加方式；转化率　中图分类号：￥５１３　文献标识码：Ａ　Ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　Ａｃｅｔｏｓｙｒｉｎｇｏｎｅ　ｏｎ　Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｒｅｃｅｐｔｏｒ　Ｓｙｓｔｅｍ　ｏｆ　Ｄｉｆｅｒｅｎｔ　Ｗａｘｙ　Ｍａｉｚｅｓ　ＧＵＯ　Ｘｉｎ－ｍｅｉ　・　，ＣＨＥ　Ｘｉｎ—ｍｉｎｇ　，ＰＥＩ　Ｙｕ－ｈｅ‘，ＳＯＮＧ　Ｘｉ—ｙｕｎ　（１．ＣｏＨｅｇｅ　ｏｆＡｇｒｏｎｏｍｙ　ａｎｄ　Ｐｌｎａｔ　Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ，Ｑｉｎｇｄａｏ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｓｈａｎｄｏｎｇ　Ｑｉｎｇｄａｏ　２６６１０９，Ｃｈｉｎａ；２．Ｓｈａｎｄｏｎｇ　Ｐｒｏｖｉｎｃｉａｌ　Ｋｅｙ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｏｆ　Ｃｏｍ　Ｂｒｅｅｄｉｎｇ　ａｎｄ　Ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓｈａｎｄｏｎｇ　Ｄｅｎｇｈａｉ　Ｓｅｅｄｓ　Ｃｏ．Ｌｔｄ，Ｓｈａｎｄｏｎｇ　Ｌａｉｚｈｏｕ　２６１４４８，Ｃｈｉｎａ）　Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ａｃｅｔｏｓｙｒｉｎｇｏｎｅ（ＡＳ）ｐｌａｙｓ　ａｎ　ｉｍｐｏｒｔａｎｔ　ｒｏｌｅ　ｏｎ　ｍａｉｚｅ　ｇｅｎｅｔｉｃ　ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｏｆｔｈｅ　ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ—ｍｅｄｉａｔｅｄ　ｇｅｎｅｔｉｃ　ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｓｙｓｔｅｍ．Ｉｎ　ｏｒｄｅｒ　ｔｏ　ｉｍｐｒｏｖｅ　ｔｈｅ　ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ　ｏｆｗａｘｙ　ｍａｉｚｅ．ｔａｋｅｎ　ｔｈｅ　ｃａｌｌｕｓ　ａｎｄ　ｓｈｏｏｔ　ｔｉｐｓ　ｏｆＬａｉｎｏｎｇｎｕｏ３８　ａｓ　ｒｅｃｅｐｔｏｍ　ｍａｔｅｒｉ・　ａｌ８，ｔｈｅ　ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ｐＨ　ｖａｌｕｅ　ｏｆ　ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ　ｍｅｄｉｕｍ，ａｄｄｉｎｇ　ｗａｙｓ　ａｎｄ　ｄｏｓａｇｅｓ　ｏｆ　ＡＳ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｇｅｎｅｔｉｃ　ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｗａｘｙ　ｍａｉｚｅ　ｗｅｒｅ　ｓｔｕｄｉｅｄ．　Ｔｈｅ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ　ｗｈｅｎ　ｐＨ　ｖａｌｕｅ　ｗ８８５．２　ｉｎ　ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ　ｍｅｄｉｕｍ，ｄｒｏｐｐｉｎｇ２　ＡＳ（ｗｉｔｈ　ａ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ　ｆｏ　１５０　ｐ．ｍｏｌ／Ｌ）ｏｎ　ｔｈｅ　ｗｏｕｎｄ　ｏｆ　ｓｈｏｏｔ　ｔｉｐｓ，ｔｈｅ　ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｆ￣［ｕｅｎｃｙ　ｏｆ　ｓｈｏｏｔ　ｔｉｐｓ　ｗａｓ　ｓｉｇｎｉｉｆｃａｎｔｌｙ　ｅｎｈａｎｃｅｄ，ｗｈｉｌｅ　ｄｕｒｉｎｇ　ｃａｌｌｕｓ　ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ，ａｄｄｉｎｇ５　ｍｇ／Ｌ　ＡＳ　ｔｏ　ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ　ｍｅｄｉｕｍ　ｏｆ　ｃａｌｌｕｓ，ｔｈｅ　ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ　ｏｆ　ｅｒｓｉｓｔａｎｔ　ｃａｌｌｕｓ　ｗａｓ　ｓｉｇｎｉｉｆｃａｎｔｌｙ　ｅｎｈａｎｃｅｄ．　Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：Ｒｅｃｅｐｔｏｒ　ｓｙｓｔｅｍ；Ａｃｅｔｓｏｙｒｉｎｇｏｎｅ；Ａｄｄｅｄ　ｍｅｔｈｏｄ；Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ　根癌农杆菌介导的遗传转化是最经济有效的遗　移所必需的，并能提高其转化频率。至此，ＡＳ被广　传转化手段之一。研究证明，农杆菌对酚类化合物　泛使用在农杆菌侵染的遗传转化体系中。　具有趋化性，而且叶子的受伤部分与非受伤部分对　ＡＳ在促进植物转化率方面，不同的植物或相同　比有明显的诱导作用¨－２］。１９８８年Ｏｗｅｎｓ等　混　植物的不同植株或不同组织间，其促进作用不近相　合农杆菌菌株与酚类化合物转化大豆细胞，发现酚　同。究其原因，除了ＡＳ浓度不同、植物基因型差异　类化合物的加入能够提高大豆细胞的转化率。许耀　和农杆菌菌株致毒力强弱外，植物个体差异也会给　等ｌ４　证明受ＡＳ等创伤诱导分子激活的ｖｉｒ区基因　研究结果产生很大影响　Ｊ。在农杆菌侵染玉米的　的活化和高效表达是农杆菌Ｔｉ质粒向宿主细胞转　遗传转化中通常在菌液、共培养基以及在菌液和共　收稿日期：２０１２—０８一Ｏｌ　培养基中共同加入１００￣ｍｏｌ／Ｌ　ＡＳ－６－７］。王宏伟　基金项目：“十二五”国家科技支撑计划（２０１１ＢＡＤ３５Ｂ０１）；山东　等　认为共培养基中添加２００　ｐ￣ｍｏＬ／Ｌ乙酰丁香酮　省泰山学者岗位（作物栽培与育种学）；山东省现代农业产业技　术体系创新团队项目；青岛市科技计划基础研究项目（１２一１．４－５－　（ＡＳ）对提高玉米愈伤组织的转化率是必要的。梁　（１１）－ｊｃｈ）；青岛农业大学高层次人才启动基金项目（６３０７４０）；　广东　研究表明自交系ＫＩＯ玉米芽尖在乙酰丁香　山东省玉米育种与栽培技术企业重点实验室　作者简介：郭新梅（１９７８一），女，河南鲁山人，博士，主要从事玉　酮浓度为ｌＯ０　ｐ￣ｏｌ／Ｌ、０．０５个大气压下真空处理时　米生物技术育种研究工作，・为通讯作者，Ｅ—ｍａｉｌ：ｓｏｎｇｘｙ＠ｑａｕ．　转化率最高。姬丹丹Ｈ　研究证明大豆萌动胚浸在　ｅｄｕ．ｅｎ。　含２００　ｐ￣ｍｏｌ／Ｌ乙酰丁香酮的农杆菌悬浮培养液时，　西南农业学报　２６卷　转化率较高。杨秀荣等¨　在双子叶植物甘薯中比　较了３种常用的ＡＳ使用方式后，发现在甘薯茎段　两端处各滴加２　Ｉｘｌ　２００　ｉ￣ｍｏｌ／Ｌ　ＡＳ能提转化频率提　中添加０、５、ｌ０、１５和２０　ｍｇ／Ｌ乙酰丁香酮，浸泡愈　伤组织１０　ｍｉｎ，２５℃共培养３　ｄ后，转入筛选培养基　进行培养，观察玉米愈伤组织的生长情况，统计抗性　高１．７５倍。本实验以玉米茎尖和幼胚愈伤组织为　转化受体，研究了悬浮培养基ｐＨ值及乙酰丁香酮　的处理方式及浓度对提高遗传转化率的影响，以期　建立和优化高效的农杆菌介导的糯玉米的遗传转化　愈伤组织率。每个处理接种３Ｏ个Ⅱ型愈伤组织，３　次重复。　．　－１．２．５转化植株的ＰＥＲ检测用ＣＴＡＢ法提取转　基因玉米再生植株及对照自交系基因组ＤＮＡ，进行　技术方法和体系。　１材料与方法　１．１供试材料　本试验所用的材料为糯玉米自交系莱农糯３８；　农杆菌菌株为ＥＨＡ１０５；表达载体为ｐＡＴＣ９４０（由中　国农业科学院王斌教授惠赠），以Ｋａｎ抗性基因作　为抗性筛选基因。　１．２试验方法　１．２．１　受体材料的制备玉米芽尖的制备及农杆　菌的培养参照文献［１２］，幼胚愈伤组织的培养参考　文献［１３］。　１．２．２　悬浮培养基的制备悬浮培养基为ＭＳ培　养基＋２％蔗糖＋１％葡萄糖＋水解酪蛋白０．２　ｇ／　Ｌ，ｐＨ值分别为５．０、５．１、５．２、５．３、５．４、５．６。　１．２．３玉米茎尖转化中ＡＳ的添加方式（ａ）悬浮　培养基中添加不同浓度的Ａｓ。农杆菌培养至ＯＤ６００　为０．７时，收集菌体，重新悬浮在添加了０、２０、４０、　６Ｏ、８０、１００和１２０　ｍｇ／Ｌ　ＡＳ的悬浮培养基中，制备　成侵染液１。将玉米茎尖浸泡在侵染液１中，１０—　１３　ｒａｉｎ后转入２８℃共培养３　ｄ，再转入ＭＳ筛选培　养基进行培养，２周后统计抗性植株数。（ｂ）农杆菌　培养过程中添加不同浓度的ＡＳ。农杆菌培养过程　中在培养基内添加０、２０、４０、６０、８０、１００、１２０　ｍｇ／Ｌ　的Ａｓ，当其菌液浓度ＯＤ咖为０．７时，收集菌体用　ｐＨ为５．２的悬浮培养基重悬制备成侵染液２。将　玉米茎尖浸泡在侵染液２中，１０—１３　ｍｉｎ后转入２８　℃共培养３　ｄ，再转人ＭＳ筛选培养基进行筛选，２周　后统计抗性植株数。（ｃ）农杆菌侵染后在伤口处滴　加Ａｓ。农杆菌培养至ＯＤ６ｏ０为０．７时，收集菌体，重　新悬浮在ｐＨ为５．２的悬浮培养基中，制备成侵染　液３。将玉米茎尖浸泡在侵染液３中，１０—１３　ｍｉｎ　后在伤口处滴加２　ｌ浓度为０、５０、１００、１５０、２００、　２５０￣ｍｏｌ／Ｌ即０、９．８１、１９．６２、２９．４３、３９．２４和４９．　０５　ｍｇ／Ｌ的ＡＳ进行共培养３　ｄ。转入ＭＳ筛选培养　基进行筛选，２周后统计抗性植株数。　１．２．４愈伤组织转化中ＡＳ的添加浓度农杆菌　培养至ＯＤ鲫为０．７时，收集菌体，重新悬浮在ｐＨ　为５．２的悬浮培养基中，制备成侵染液４，在侵染液　ＰＣＲ扩增。引物由上海生工生物技术有限公司合　成，序列如下。　５　引物：ｎ　ＧＥＴ　ＡＣＧ　ＧＧＡ　ＴＧＣ　ＴＡＧ　ＧＣ；３　引　物：ＴＣＡ　ＴＡＣ　Ｉ’ＩＩＡ　ＧＡＣ　ＴＧＴ　ＣＡＧ　ＴＣ。　２结果与分析　２．１悬浮培养基ｐＨ值对遗传转化效率的影响　悬浮培养基的ｐＨ值对Ａｓ的诱导效果有很大　的影响，不同的ｐＨ值产生不同的诱导效果（图１）。　随着悬浮培养基ｐＨ值的升高，抗性植株的数量不　断增加，ｐＨ值为５．２时，抗性植株率最大，达到４．７　％；当ｐＨ大于５．２后，抗性植株数不断降低，在ｐＨ　值为５．６时，产生抗性植株的数量显著减少。　２．２茎尖转化中ＡＳ的不同添加方式及浓度对转　化效果的影响　ＡＳ属酚类化合物，添加适量的ＡＳ可促进农杆　菌对植物细胞的附着，也可激活农杆菌质粒上的Ｖｉｒ　基因活化和表达，提高转化率。在农杆菌培养过程　中添加ＡＳ，农杆菌生长缓慢。仅在ＡＳ添加浓度为　０、２０　ｍｇ／Ｌ时，产生少量抗性植株，随着添加ＡＳ浓　度的升高，获得抗性植株的数量迅速减少，在ＡＳ浓　度为４０　ｍｇ／Ｌ时，不能获得任何抗性植株（图２）。　农杆菌悬浮培养液中加入ＡＳ后，随着ＡＳ浓度　不断升高获得抗性植株数量显著增加，在ＡＳ浓度　为６０　ｍｇ／Ｌ时，获得的抗性植株数量最多，抗性植株　率达到５％；之后随着ＡＳ浓度的增大获得抗性植　株的数量显著降低，当ＡＳ浓度为１２０　ｍｇ／Ｌ时，不　产生抗性植株（图２）。　图中大写字母表示ｌ％水平差异显著性。下表、图相同　图１悬浮培养基ｏＨ值对转化效率的影响　Ｆｉｇ．１　Ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆｐＨ　ｖａｌｕｅ　ｏｆｔｈｅ　ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ　ｍｅｄｉｕｍ　ｏｎ　ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ　３期　６　５　郭新梅等：乙酰丁香酮对不同糯玉米受体系统遗传转化的影响　１０００　ｂｐ　９Ｏ０　ｂｐ　静４　疑１　０　Ｍ．ＤＮＡ　Ｍａｒｋｅｒ；１．空白；２．质粒ＤＮＡ；３—４．非转化植株；５．阳性　转化植株　图３抗性植株ＰＣＲ检测　图２　ＡＳ的不同添加方式及浓度对遗传转化的影响　Ｆｇ．２　Ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ａｄｄｉｎｇ　ｍｅｔｈｏｄ　ｏｆ　ＡＳ　ｏｎ　ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ　Ｆｉｇ．３　ＰＣＲ　ａｓｓａｙ　ｏｆ　ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ　ｐｌａｎｔｓ　在农杆菌侵染后的芽尖伤口处滴加不同浓度　以植株总ＤＮＡ为模板，以质粒ＤＮＡ为阳性对照，未　转化玉米植株ＤＮＡ为阴性对照，利用农杆菌质粒　ＡＳ能够明显提高抗性植株的数量。ＡＳ浓度为Ｏ一　１５０　Ｉ．Ｌｍｏｌ／Ｌ时，随着ＡＳ浓度升高抗性植株数量增　加，转化效率显著增大，在Ａｓ浓度为１５０　Ｉ￣ｍｏｌ／Ｌ　时，获得的抗性植株数量极显著高于其它处理浓度，　抗性植株率达到６％；之后随着ＡＳ浓度的增大获　得抗性植株的数量随之减少，当ＡＳ浓度为２５０　ｐ￣ｏＬ／Ｌ时，仅产生少量抗性植株（表１）。　２．３幼胚愈伤组织转化中ＡＳ浓度对转化效果的　影响　玉米愈伤组织的遗传转化中，在侵染液加入不　同浓度的ＡＳ，抗性愈伤组织数不同（表２）。ＡＳ浓度为　５　Ｌ时，抗性愈伤最多，抗性愈伤诱导率极显著地高　于其他处理浓度，达到１５．５６％；当ＡＳ浓度大于５　ｍｇ／　Ｌ，抗性愈伤诱导率随ＡＳ浓度升高而下降。　２．４转基因植株的ＰＣＲ检测　将得到的莱农糯３８的抗性植株提取总ＤＮＡ，　表１玉米伤口处滴加ＡＳ对遗传转化的影响　Ｔａｂｌｅ　１　Ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ａｄｄｉｎｇ　ＡＳ　ｉｎ　ｍａｉｚｅ　ｗｏｕｎｄ　ｏｎ　ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ　表２　ＡＳ浓度对愈伤遗传转化效率的影响　Ｔａｂｌｅ　２　Ｅ　ｔ８　０ｆ　ＡＳ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ　Ｏｎ　ｃａｌｌＵ８　ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ＰＣＲ反应体系对获得的抗性植株基因组ＤＮＡ进行　ＰＣＲ扩增检测，检测结果（图３）表明，阳性对照和阳　性植株扩增出９００　ｂｐ的目的条带，阴性对照没有扩　增出相应条带，初步证明外源基因已经导人莱农糯　３８。　３讨论与结论　３．１　悬浮培养基ｐＨ值对遗传转化效率的影响　Ｈｏｌｆｏｒｄ等　研究表明，ＡＳ的诱导效果与培养　基的ｐＨ值有关，ｐＨ值为５．２时转化效果最好。同　时，毕瑞明等　引、郝贵霞等ｎ引、凌键等　’　的研究中　也有类似报道，认为ＡＳ在较低的ｐＨ值环境中，可　使农杆菌及其内含的质粒产生一系列反应，诱导并　激活Ｖｉｒ区基因，使其表达，从而导致了转化事件的　发生，提高转化效率。本试验中，悬浮培养基ｐＨ为　５．２时转化率最高，与前人结果一致。　３．２　ＡＳ的不同添加方式及浓度对转化效果的影响　Ｓｔａｃｈｅｌ等发现烟草叶子的受伤部分比非受伤　叶子具有明显的诱导作用，并从受伤植物细胞中分　离提取出了ＡＳ，还证明了它是　基因天然的诱导　剂－２　Ｊ。双子叶植物在农杆菌侵染时自身细胞可以　诱导产生大量的ＡＳ，实现Ｔ—ＤＮＡ成功的导人，而单　子叶植物需要加人外源的酚类物质ＡＳ，才能激活　ｖｉｒ区的基因。　本试验比较了糯玉米遗传转化中常用的２种受　体系统，研究发现茎尖转化中，侵染液中添加６ｏ　ｍｇ／Ｌ　ＡＳ能够显著提高抗性植株率，而玉米愈伤组　织的遗传转化中，侵染液中添加５　ｍｇ／Ｌ的ＡＳ能显　著提高抗性愈伤率。本研究认为，不同的受体材料　对外源物质的耐受程度不同。愈伤组织是经脱分化　产生的细胞聚集体，对外界环境及添加物的变化较　敏感，因而其ＡＳ的最适添加量低于茎尖受体。另　外，在茎尖转化体系中，采用农杆菌侵染后在伤口处　滴加２　ｌ　１５０　ｐＬｍｏｌ／Ｌ　ＡＳ比在侵染液中添加Ａｓ有　更好的转化效率。因此，不同的受体材料，ＡＳ的添　加方式和浓度不同，应根据实验材料采用不同的方　西南农业学报　２６卷　法。　［７］孙传波，曲文利，姜志磊，等．农杆菌介导向玉米茎尖导入ＨＡＬ　１　基因的初步研究［Ｊ］．玉米科学，２００９，１７（６）：３２—３４．　［８］王宏伟，梁业红，史振声，等．共培养环境对玉米遗传转化的影　响［Ｊ］．西北农业学报，２０１１，２０（９）：４０－４２．　在对ＡＳ使用浓度对玉米遗传转化率的影响中　发现，当其使用浓度低于最佳浓度时，抗性植株的数　量随着ＡＳ浓度的增大而增加，当其使用浓度高于　［９］梁广东，卢翠华，王振华，等．农杆菌侵染玉米芽尖转化Ｂｃ－　ＷＲＫＹ１转录因子基因的初报［Ｊ］．玉米科学，２０１１，１９（３）：５６—　５８．　最佳浓度时，抗性植株的数量随着ＡＳ浓度的增大　而减小。这可能是在侵染过程中，通过添加适当浓　度ＡＳ可以诱导侵人玉米愈伤的农杆菌陆基因表　达，显著提高玉米抗性植株的诱导率，由于ＡＳ是一　种酚类物质，浓度过高不仅影响农杆菌活性，对植物　［１０］姬丹丹，王鹏，向凤宁．大豆外源基因转化体系建立及条件　平，等．乙酰丁香酮对根癌农杆菌介导的　优化研究［Ｊ］．山东大学学报（理学版），２０１１，４６（５）：１１６—１２２．　［１１］杨秀荣，陈永文，方甘薯遗传转化的影响［Ｊ］．西南师范大学学报（自然科学版），　外植体细胞亦有一定损伤，因而，当ＡＳ浓度过高时　导致转化效率下降。　参考文献：　［１］Ｓｈａｗ　Ｃ　Ｈ，Ｗａｔｓｏｎ　Ｍ　Ｄ，Ｃａｒｔｅｒ　Ｇ　Ｈ，ｅｔ　１ａ．Ｔｈｅ　ｉｒｇｈｔ　ｈａｎｄ　ｃｏｐｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｎｏｐａｌｉｎｅ　Ｔｉ－ｐｌａｓｍｉｄ　２５　ｂｐ　ｒｅｐｅａｔ　ｉｓ　ｒｅｑｕｉｒｅｄ　ｆｏｒ　ｔｕｍｏｕｆｆｏｒｍａｔｉｏｎ　［Ｊ］．Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ，１９８４，１２（１５）：６０３１—６０４１．　［２］Ｓｔａｃｈｅｌ　Ｓ　Ｅ，Ｍｅｓｓｅｎｓ　Ｅ，ｖａｎ　Ｍｏｎｔａｇｕ　Ｍ　Ｖ，ｅｔ　ａ１．Ｉｄｅｎｔｉｉｆｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｓｉｇｎａｌ　ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ　ｐｒｏｄｕｃｅｄ　ｂｙ　ｗｏｕｎｄｅｄ　ｐｌｎａｔ　ｃｅｌｌｓ　ｔｈａｔ　ａｃｔｉｖａｔｅ　Ｔ－　ＤＮＡ　ｔｒａｎｓｆｅｒ　ｉｎ　Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａｅｉｅｎｓ［Ｊ］．Ｎａｔｕｒｅ，１９８５，３１８　（６０４７）：６２５—６２９．　［３］Ｏｗｅｎｓ　Ｌ　Ｄ，Ｓｍｉｇｏｅｋｉ　Ａ　Ｃ．Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｓｏｙｂｅａｎ　ｃｅｌｌｓ　ｕｓｉｎｇ　ｍｉｘｅｄ　ｓｔｒａｉｎｓ　ｏｆ　Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ　ａｎｄ　ｐｈｅｎｏｌｉｃ　ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ　［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ　Ｐｂｙｓｉｄ．，１９８８，８８（３）：５７０—５７３．　［４］许耀，贾敬芬，郑国铝．酚类化合物促进根癌农杆菌对植物离　体外植体的高效转化［Ｊ］．科学通报，１９８８，３３（２２）：１７４５—１７４８．　［５］董喜才，杜建中，王安乐，等．乙酰丁香酮在植物转基因研究中的　作用［Ｊ］．中国农学通报，２０１１，２７（０５）：２９２—２９９．　［６］巩健，杨芳．单子叶植物表达载体的构建及农杆菌介导的玉　米遗传转化的研究［Ｊ］．生物技术，２００７，１７（３）：２—５．　２００２，２７（５）：７５１—７５４，７５８．　［１２］李国圣，张卿伟，张举仁，等．玉米丛生芽体系的建立及抗除草　剂转基因植株再生［Ｊ］．中国科学（ｃ辑：生命科学），２００１，３１　（５）：３８５—３９１．　［１３］郭新梅，张晓东，韩立新，等．不同基因型玉米幼胚愈伤组织培　养特性的研究［Ｊ］．西北农林科技大学学报（自然科学版），２００７，　３５（４）：６８—７２．　［１４］Ｈｏｆｏｒｄ　Ｐ，ＨｅｍａｎｄｅｚＮ，ＮｅｗｂｕｗＨ　Ｊ．Ｆａｃｔｏｒｓｉｎｆｌｕｅｎｃｉｎｇｔｈｅｏｆ－　ｉｆｃｉｅｎｃｙ　ｏｆ　Ｔ・ＤＮＡ　ｔｒａｎｓｆｅｒ　ｄｕｒｉｎｇ　ＣＯ・ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ａｎｔｉｒｒｈｉｎｕｍ，，ｌ　ｗｉｔｈ　Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　Ｉｌ　Ｉ　ｓ［Ｊ］．Ｐｌｎａｔ　Ｃｅｌｌ　Ｒｅｐ，１９９２，ｌ１：１９６—　１９９．　［１５］毕瑞明，高峰．甘薯遗传转化几个因素的研究［Ｊ］．生物技术，　２００７，１７（４）：５５—５８．　［１６］郝贵霞，朱祯，朱之悌．豇豆蛋白酶抑制剂基因转化毛白杨　研究［Ｊ］．植物学报，１９９９，４１（１２）：１２７６—１２８２．　［１７］凌键，陈永文，龚一富，等．甘薯离体遗传转化体系的优化　［Ｊ］．西南师范大学学报（自然科学版），２００４，２９（３）：４６６—４７Ｏ．　（责任编辑李山云）