BCA 蛋白定量中文说明thermo

说明书

Pierce®BCA Protein Assay Kit （PierceBCA 蛋白定量分析试剂盒）

®

NCI3225CH NCI3227CH

2436.0

目录号 描述

NCI3225CH Pierce BCA Protein Assay Kit（Pierce BCA 蛋白定量分析试剂盒），试剂可用于 500 次试管或

5000 次微孔板分析 NCI3227CH Pierce BCA Protein Assay Kit（Pierce BCA 蛋白定量分析试剂盒），试剂可用于 250 次试管或

2500 次微孔板分析

试剂盒组分：

BCA 试剂 A， 1000mL（产品目录号 NCI3225CH）或 500mL（产品目录号 NCI3225CH)。含有 溶解于 0.1M 氢氧化钠中的碳酸钠、碳酸氢钠、二喹啉甲酸（BCA）以及酒石酸钠。 BCA 试剂 B，25mL，含有 4%的硫酸铜

白蛋白标准品，2mg/mL， 10  1mL 安瓿，包含浓度为 2mg/mL 的牛血清白蛋白（BSA）和 0.05%的叠氮化钠，溶解于 0.9%生理盐水中。 储存：在收到试剂盒后将其储存于室温。常温运输。

注：如果在寒冷天气进行运输，或在保存期间，试剂 A 或试剂 B 发生沉淀，可通过对溶液进行 温和加热和搅拌，将沉淀溶解。当试剂盒发生变色，或证明有微生物污染时，请将试剂丢弃。

目录

产品简介 ..................................................................................................................................................................................... 2 标准品和工作液的制备（两种检测方案均适用）.................................................................................................................. 3 试管检测方案（样品与工作液的比例=1:20） ........................................................................................................................ 4 微孔板检测方案（样品与工作液的比例=1:8） ...................................................................................................................... 6 常见问题及解决方案 ................................................................................................................................................................. 7 Thermo Scientific 相关产品 ........................................................................................................................................................ 8 附加信息 .....................................................................................................................................................................................9

参考文献 ..................................................................................................................................................................................... 11

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产品简介

Thermo Scientific Pierce BCA 蛋白定量分析试剂盒是一种基于二喹啉甲酸（BCA），利用比色法测定总蛋白浓

度的蛋 白定量试剂盒，可与去污剂兼容。本方法将双缩脲反应和显色反应结合在一起：前者为在碱性介质中，蛋白质可将 Cu2+还原成 Cu1+ 的反应，后者为使用含有二喹啉甲酸（BCA）1 的独特试剂，利用比色法检测 Cu1+，具有高灵敏度 和高选择性的特点。此检测方法中产生的紫色显色物质是由两分子的 BCA 和一分子的亚铜离子螯合而形成的。该水 溶性复合物在 562nm 处具有很强的吸光值，在很宽的蛋白质浓度范围（20-2000g/mL）内，吸光值和蛋白质浓度具 有良好的线性关系。BCA 法并不是真正的终点检测，实验中颜色将会持续变化。但是，在孵育结束后，颜色继续变 化的速率非常慢，足以同时检测大量的样品。

据报道，蛋白质的大分子结构、肽键的数量以及四种特定氨基酸（半胱氨酸、胱氨酸、色氨酸和酪氨酸）的

存在与 BCA 产生颜色反应相关 2。对二肽、三肽和四肽的研究表明，整体蛋白产生颜色的强度要高于单个显色基团所产生 的颜色的简单加和 2。 因此，一般采用常见蛋白质诸如牛血清白蛋白（BSA）作为参照标准品，来确定目标蛋白质 的浓度。首先，需要制备经过梯度稀释的、浓度已知的一组蛋白质标准品，然后将其与未知浓度的待测蛋白质一起 检测，根据绘制出的标准曲线对每个未知浓度的样品进行蛋白浓度的计算。如果要求对未知蛋白浓度进行精确的定 量分析，则建议选择一个与未知蛋白质的特性相类似的蛋白质标准品；例如，在分析免疫球蛋白样品时，可以使用 牛γ球蛋白（BGG）作为标准品（参见“Thermo Scientific 相关产品”章节）。

本手册介绍了两种检测方案。在这两种方案中，试管检测方案要求蛋白质样品的体积较大（0.1mL）；但是，

由于 该方案中使用的样品与工作液之间的比例为 1:20（v/v），因此最大程度地降低了干扰物质的影响。微孔板方案操作 样品更加方便，且需要的蛋白样品的体积较小（10-25L），但是，由于所使用的样品与工作液之间的比例为 1:8（v/v）， 因此该方法与试管法相比，在克服干扰物质对测定结果的影响方面灵活度低、且检测浓度较低的蛋白样品不如试管法灵敏。

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标准品和工作液的制备（两种检测方案均适用）

A. 梯度稀释牛血清白蛋白（BSA）标准品

按照表 1 制备一组蛋白质标准品。将一安瓿的牛血清白蛋白标准品（BSA）稀释到几个干净的小瓶中，最好

使用与 待测样品相同的稀释液。每一个 1mL 安瓿的 2mg/mL 牛血清白蛋白标准品足够用于制备表 1 中所列出的任意一组稀 释范围的标准品；每个稀释浓度的标准品的体积足够用于 3 次重复检测。

表 1. 系列稀释牛血清白蛋白（BSA）标准品

用于标准方案的稀释方法（检测范围= 20-2,000g/mL）

瓶号 A B C D E F G H I

稀释液的体积 (L)

0 125 325 175 325 325 325 400 400

BSA 的体积和来源 (L) 300L 原液 375L 原液 325L 原液 175L B 瓶稀释液 325L C 瓶稀释液 325L E 瓶稀释液 325L F 瓶稀释液 100L G 瓶稀释液

0 BSA 的体积和来源 (L) 100L 原液 400L 瓶 A 稀释液 300L 瓶 B 稀释液 400L 瓶 C 稀释液 100L 瓶 D 稀释液

0

BSA 终浓度(g/mL)

2000 1500 1000 750 500 250 125 25 0 =空白 BSA 终浓度(g/mL)

250 125 50 25 5 0 = 空白 用于试管增强方案的稀释方法（检测范围= 5–250g/mL）

瓶号 A B C D E F

稀释液的体积 (L)

700 400 450 400 400 400

B. 制备 BCA 工作液（WR）

1. 使用下述公式来确定所需的工作液的总体积：

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(标准品的个数 + 待测蛋白质样品的个数)  ( 实验重复次数)  (用于每个样品的工作液的体积) =所需的工作

液总体积

举例：在标准试管检测方案下，检测三个待测蛋白质样品，且每个样品进行两次重复实验：

(9 个标准品+ 3 个待测蛋白质样品)  (2 次重复实验)  (2mL) = 48mL 工作液 注：在试管方案中，每个

样品需要 2.0mL 的工作液，而在微孔板方案中，每个样品仅需要 200µl 工作液。

2. 将 50 份 BCA 试剂 A 与 1 份 BCA 试剂 B 混合（试剂 A 与试剂 B 的比率=50:1），制备工作液。上述示例中，将

50mL 试剂 A 和 1mL 试剂 B 混合即可。

注：当试剂 B 加入到试剂 A 中时，开始可观察到有浑浊产生，经搅拌后浑浊会迅速消失，得到绿色澄清工作 液。根据所要分析的样品数量，配制足够体积的工作液。工作液储存于密闭容器中，在室温下可稳定保存数 天。

实验方案小结（标准试管方案）

试管方案（样品与工作液的比例=1:20）

1. 取各个稀释浓度的蛋白质标准品和待测蛋白质样品各 0.1mL，加入到做好标记的试管中。

2. 在每个试管中加入 2.0mL 工作液，充分混合。

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3. 将试管密封，根据不同实验方案，选择相应温度和时间进行孵育：

  注：

 延长孵育时间或升高温度将会增加单次检测在 562nm 处的绝对吸光值，也会降低试剂的最低检测下限以及该

方案的检测范围。

标准方案（37°C 下孵育）或者增强方案（60°C 下孵育），建议使用水浴来加热试管。细菌培养箱传热不均 匀，可能会导致显色上的明显误差。

4. 将所有试管冷却至室温。

标准方案： 增强方案：

37°C，30 分钟（检测范围= 20-2000g/mL） 60°C，30 分钟（检测范围= 5-250g/mL）

 室温方案： 室温，2 小时（检测范围= 20-2000g/mL）



5. 将分光光度计设定在 562nm，使用一只仅装有水的比色皿将仪器调零。然后，在 10 分钟内依次检测所有样品的

吸光值。

注：由于 BCA 分析方法并没有达到真正的终点，因此，在冷却至室温以后仍然会继续显色。但是，在室温时的 显色速率比较慢，如果在 10 分钟内完成所有样品的检测，则不会产生明显的误差。

6. 将各个标准品和待测蛋白质样品在 562nm 处的吸光值减去空白标准品在 562nm 处的平均吸光值。

7. 将 BSA 标准品在 562nm 处经过空白校正的吸光值对其浓度（µg/mL）作图，绘制标准曲线。使用该标准曲线来

确定每个待测蛋白质样品的蛋白质浓度。

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微孔板方案（样品与工作液的比例=1:8）

1. 取各个稀释浓度的蛋白质标准品和待测蛋白质样品各 25L ，加入到微孔板中（检测范围= 20-

2000g/mL）。

注：如果样品有限，则可取标准品和待测未知样品 10L（样品与工作液的比例为 1:20）。然而，在这种情况 下，定量分析的检测范围将被限制在 125-2000g/mL。

2. 在每一个孔中加入 200L 工作液，并在震荡器上震荡 30 秒，使其充分混合。

3. 将微孔板密封，在 37°C 孵育 30 分钟。

4. 将微孔板冷却到室温。使用微孔板读数仪，测量样品在 562nm 或该波长附近的吸光值。

注：

 该方法在波长 540-590nm 范围内均可成功得到结果。

由于微孔板酶标仪的光路长度比使用比色皿的分光光度计短，因此微孔板方案要求样品与工作液的比例 更高，才能获得与试管标准方案相同的灵敏度。如果想要得到较高的 562nm 处的吸光值，则需将孵育 时间增加到 2 小时。



 延长孵育时间或升高温度将会增加样品在 562nm 处的吸光值，也会降低试剂的最低检测下限和该方案 的检测范围。如果对标准品和待测样品均用相同方式处理，上述这些调整可能会改进实验结果。

5. 将各个标准品和待测蛋白质样品在 562nm 处的吸光值减去空白标准品在 562nm 处的平均吸光值。

6. 将 BSA 标准品在 562nm 处经过空白校正的平均吸光值对其浓度（µg/mL）作图，绘制标准曲线。注：如果

使用与微孔板读数仪相关联的曲线拟合算法，四参数（二次方程）或最佳曲线拟合将会比简单的线性拟合 提供更加准确的结果。如果手工对这些结果作图，对于标准曲线上的各个点，采取点对点描画曲线的方 法，比直接进行线性拟合的结果更好。

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常见问题及解决方案

问题 试管未显色 可能的原因 样品中含有铜离子螯合试剂 解决方案 对样品进行透析、脱盐或稀释处理； 增加工作液中铜离子的浓度（例如：试 剂 A 与试剂 B 的比例调整至 50:2）； 使用目录号为 23215 的产品来除去样品 中的干扰物质 空白试管吸光值正常，但是标准 品和待测样品所显示的颜色比预 计值低 样品显色比预计的颜色深 缓冲液溶剂为强酸或强碱，改变 了工作液的 pH 值。 检测吸光度时使用的波长不对 蛋白质浓度太高 样品含有脂质或脂蛋白 对样品进行透析、脱盐或稀释 在 562nm 处检测吸光值 稀释样品 在样品中添加 2%的 SDS 以消除来自脂质 的干扰 3 使用目录号为 23215 的产品来除去样品 中的干扰物质 所有试管（包括空白试管）都呈 现暗紫色 缓冲液中含有还原剂 缓冲液中含有巯基 缓冲液中含有 生物胺（儿茶酚 胺） 对样品进行透析或稀释； 使用目录号为 23215 的产品来除去样品 中的干扰物质 需要在另一波长处检测吸光值 分光光度计或微孔板读数仪不具 备 562nm 滤光片 尽管标准曲线的斜率以及定量分析的总 体灵敏度会降低，但在 540nm 至 590nm 之间的任意波长都可能检测到颜色变 化。

A. 干扰物质

已知有些物质会干扰 BCA 定量分析，包括还原性物质、螯合剂以及强酸或强碱。因为即使浓度很低，这些物质也 会干扰蛋白质的定量，所以要避免缓冲液中含有下述物质：

维生素 C 儿茶酚胺 肌酐 半胱氨酸

EGTA 低纯度 甘油 过氧化 氢 酰肼

铁离子 脂类 蜜二糖 酚红

低纯度蔗糖 色氨酸 酪氨酸 尿酸

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另外一些物质对 BCA 定量分析方法的干扰程度较低，当其在原始样品中含量低于某特定浓度时，仅对结果造成微

小影响（可耐受）。表 2 列出了在试管标准方案中，一些物质的最大可兼容浓度（参见本说明书最后一页）。在试 管标准方案中，如果由于一定浓度的某物质的存在，而引入的蛋白质浓度估算误差≤10%，则认为当该物质低于此 浓度时，该物质与 BCA 定量分析方法兼容。检测这些物质所使用的工作液都是新鲜配制的，即配制完工作液后立 即进行测试。我们将经过空白校正的 562nm 处的吸光值（使用 1000µg/mL BSA 标准品+干扰物质）与在 0.9%生理 盐水中制备的相同标准品在 562nm 处的吸光值进行比较。在样品与工作液的比例为 1:8（v/v）的微孔板方案中，对 这些物质的最大可兼容浓度将会变低。

此外，多种干扰物质可能产生加和作用，例如当样品缓冲液中含有多种干扰物质时，即使其中单一干扰物质的浓度 低于以下列表中的可兼容浓度，总体仍有可能对蛋白质的定量分析产生干扰。

B. 消除或最小化干扰物质影响的策略

在 Pierce BCA 蛋白定量分析中，可以通过下述几种方法中的一种来消除或克服干扰物质的影响：   

用丙酮或三氯乙酸（TCA）沉淀样品中的蛋白质。将含有干扰物质的液体成分丢弃，蛋白质沉淀可被轻松地溶 解在超纯水中，或直接溶解在碱性 BCA 工作液中 4。请访问 www.piercenet.com ，查看该方案的详细步骤。或 者，也可以使用目录号为 23215 的产品去除干扰物质（参见相关的 Pierce 产品）。 

增加工作液中铜离子的含量（试剂 A 与试剂 B 的以 50:2 或 50:3 的比例混合制备工作液），这种方法可以消除 铜螯合剂导致的干扰。

注：为了获得最高的准确度，必须对蛋白质标准物质和待测样品进行相同的处理。

对样品进行稀释，直到该物质不再产生干扰为止。只有当起始蛋白质浓度足够高，在稀释以后，其浓度仍能保 持在定量分析的范围内时，这种方法才有效。 通过透析或凝胶过滤来除去干扰物质。

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相关的 Thermo Scientific 产品

15041 15075 15036 23209

Pierce 96-Well Plates （Pierce 96 孔微孔板）， 100 个/包。 Reagent Reservoirs（加样槽）， 200 个/包。

Sealing Tape for 96-Well Plates（96 孔板密封条），100 个/包。

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Pre-Diluted Protein Assay Standards: Bovine Serum Albumin (BSA) Set（预稀释的蛋白定量分 析标准品：牛血清白蛋白（BSA）套装）， 7  3.5mL

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Pierce Micro BCA Protein Assay Kit （Pierce Micro BCA 蛋白定量分析试剂盒）， 检测范围 0.5-20g/mL

Coomassie Plus (Bradford) Assay Kit（Coomassie Plus (Bradford) 定量分析试剂盒），检测范 围 1-1500g/mL

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Pierce BCA Protein Assay KitReducing Agent Compatible（Pierce BCA 蛋白定量分析试剂盒- 还原剂兼容型）

23208 23212 23213 23235 23236 23215 23250

附加信息

A. 关于下述事项的更多信息，请访问我们的网站：

 

常见问题解答

操作技巧：如何从 BCA 蛋白定量待测样品中去除干扰物质

B. 总蛋白定量分析试剂的其它产品 如果样品中包含的还原物质或金属离子螯合剂所引起的干扰无法克服，请尝试使用 Thermo Scientific Coomassie Plus (Bradford) 定量分析试剂盒（产品目录号 23236），该产品对这些物质的敏感度较低。

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C. 清洗和重复使用玻璃器皿

重复使用玻璃器皿时需要特别注意。必须将所有玻璃器具进行清洗，并用超纯水进行彻底的最后冲洗。

D. 对不同蛋白质的反应特性 每一种常见的总蛋白定量分析方法在检测不同的蛋白质时，其反应特性是不同的。这些差异可能与蛋白质的氨基酸 序列、pI、蛋白质结构，以及能够引起蛋白颜色反应产生显著变化的侧链或辅基等有关。大多数蛋白定量分析方法

使用 BSA 或免疫球蛋白（IgG）作为标准品，来确定待测样品中蛋白质的浓度（参见图 1）。然而， 如果对蛋白定

量的准确度要求非常高，请使用纯化的目标蛋白绘制标准曲线。

表 3.不同蛋白质之间的差异性。使用标准试管 方案得到的待测蛋白质相对于 BSA 的吸光值的 比例（562nm）

比例 = (蛋白质样品的平均吸光度) / (BSA 的平均吸光值)

比例

Albumin, bovine serum（牛血清白蛋白） 1.00 Aldolase, rabbit muscle（兔肌肉醛缩酶） 0.85 -Chymotrypsinogen, bovine（牛-胰凝 乳蛋白酶原）Cytochrome C, horse heart （马心肌细胞 C

Gamma globulin, bovine（牛丙种球蛋

白）

被检测的蛋白质样品

1.14

0.83

1.11

图 1：使用试管标准方案（37°C/30 分钟孵育）时 BSA 和 BGG 的颜色反应曲线

IgG, bovine（牛免疫球蛋白） IgG, human（人免疫球蛋白） IgG, mouse（小鼠免疫球蛋白） IgG, rabbit（兔免疫球蛋白） IgG, sheep（绵羊免疫球蛋白） Insulin, bovine pancreas（牛胰腺胰岛 Myoglobin, horse heart（马心肌肌红蛋

白）

Ovalbumin（卵白蛋白） Transferrin, human（人转铁蛋白）

标准差 变异系数

1.21 1.09 1.18 1.12 1.17 1.08 0.74 0.93 0.89 1.02

0.15 14.7%

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表 3 列出了不同蛋白质之间显色反应的差异性。所有的蛋白质浓度均为 1000g/ml，使用 30 分钟/37°C 试管方案进 行定量。将 BSA 的平均吸光值归一化设为 1.00，其它待测蛋白的数据则用其平均吸光值与 BSA 平均吸光值的比例 表示。

引用参考文献

1. 2. 3.

Smith, P.K., et al. (1985). Measurement of protein using bicinchoninic acid. Anal. Biochem. 150:76-85.

Wiechelman, K., et al. (1988). Investigation of the bicinchoninic acid protein assay: Identification of the groups responsible for color formation. Anal Biochem. 175:231-7.

Kessler, R. and Fanestil, D. (1986). Interference by lipids in the determination of protein using bicinchoninic acid. Anal. Biochem. 159:138-42. Brown, R., et al. (1989). Protein measurement using bicinchoninic acid: elimination of interfering substances. Anal. Biochem. 180:136-9.

4.

产品参考文献

Adilakshami, T. and Laine, R.O. (2002). Ribosomal protein S25 mRNA partners with MTF-1 and La to provide a p53-mediated mechanism for survival or

death. J. Biol. Chem. 277:4147-51.

Fischer, T., et al. (1999). Clathrin-coated vesicles bearing GAIP possess GTPase-activating protein activity in vitro. Proc. Nat. Acad. Sci. 96:6722-7. Prozialeck, W.C., et al. (2002). Chlamydia trachomatis disrupts N-cadherin-dependent cell-cell junctions and sequester -catenin in human cervical

epithelial cells. Infection and Immunity 70:2605-13.

Roberts, K.P., et al. (2002). A comparative analysis of expression and processing of the rat epididymal fluid and sperm-bound forms of proteins D and E.

Biology of Reproduction 67:525-33.

Triton® 是 Rohm & Haas Co.的注册商标

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表 2. BCA 蛋白定量分析中干扰物质的兼容浓度（详情请参见正文）§

兼容浓度

物质

盐/缓冲液

物质 去污剂** 25mM 1.5M 1mM 20mM 33mM 未稀释 未稀释 10mM 未稀释 100mM 100mM

Brij-35 5.0% Brij-56, Brij-58 1.0% CHAPS, CHAPSO 5.0% Deoxycholic acid 5.0% Octyl -glucoside 5.0% Nonidet P-40 (NP-40) 5.0% Octyl -thioglucopyranoside 5.0% SDS 5.0% Span20 1.0% ® TritonX-100 5.0% Triton X-114, X-305, X-405 1.0% ®Tween -20, Tween-60, Tween-80 5.0% ® ®兼容浓度

ACES, pH 7.8

Ammonium sulfate Asparagine Bicine, pH 8.4 Bis-Tris, pH 6.5

Borate (50mM), pH 8.5 (# 28384) B-PERReagent (#78248) Calcium chloride in TBS, pH 7.2

Na-Carbonate/Na-Bicarbonate (0.2 M), pH 9.4 (# 28382)

Cesium bicarbonate CHES, pH 9.0

®

Zwittergent3-14 1.0% 螯合剂 EDTA EGTA Sodium citrate 还原剂&含硫醇剂 N-acetylglucosamine in PBS, pH 7.2 10mM Ascorbic acid Cysteine Dithioerythritol (DTE) Dithiothreitol (DTT) Glucose Melibiose 2-Mercaptoethanol Potassium thiocyanate Thimerosal 其它试剂&溶剂 Acetone Acetonitrile Aprotinin DMF, DMSO DMSO Ethanol Glycerol (Fresh) Hydrazides Hydrides (Na2BH4 or NaCNBH3) Hydrochloric Acid Leupeptin 10% 10% 10mg/L 10% 10% 10% 10% -------- -------- 100mM 10mg/L -------- -------- 1mM 1mM 10mM -------- 0.01% 3.0M 0.01% 10mM -------- 200mM ® Na-Citrate (0.6 M), Na-Carbonate (0.1 M), pH 9.0 1:8 稀释液* (# 28388)

Na-Citrate (0.6 M), MOPS (0.1 M), pH 7.5 (#28386) 1:8 稀释液* Cobalt chloride in TBS, pH 7.2 EPPS, pH 8.0

Ferric chloride in TBS, pH 7.2 Glycine•HCl, pH 2.8 Guanidine•HCl

HEPES, pH 7.5 Imidazole, pH 7.0 MES, pH 6.1

MES (0.1 M), NaCl (0.9%), pH 4.7 (#28390) MOPS, pH 7.2

Modified Dulbecco’s PBS, pH 7.4 (#28374) Nickel chloride in TBS, pH 7.2

PBS; Phosphate (0.1 M), NaCl (0.15 M), pH 7.2 (# 28372)

PIPES, pH 6.8

RIPA lysis buffer; 50mM Tris, 150mM NaCl, 0.5% DOC, 1% NP-40, 0.1% SDS, pH 8.0 Sodium acetate, pH 4.8 Sodium azide Sodium bicarbonate Sodium chloride

Sodium citrate, pH 4.8 or pH 6.4 Sodium phosphate Tricine, pH 8.0

Triethanolamine, pH 7.8 Tris

0.8mM 100mM 10mM 100mM 4M 100mM 50mM 100mM 未稀释 100mM 未稀释 10mM 未稀释 100mM 未稀释 200mM 0.2% 100mM 1M 200mM 100mM 25mM 25mM 250mM

TBS; Tris (25mM), NaCl (0.15 M), pH 7.6 (# 28376) 未稀释 Tris (25mM), Glycine (192mM), pH 8.0 (# 28380)

* 用超纯水稀释。

1:3 稀释液*

** 测试去污剂时，使用了高纯度的 Thremo Scientific Surface-Amps 产品，该产品的过氧化物含量较低。

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