醛固酮在乳鼠心肌细胞表达肿瘤坏死因子-α中的作用

维普资讯 http://www.cqvip.com 心肺血管病杂志２００８年７月第２７卷第４期　ＪｏｕｍＭ　ｏｆ　Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｈｒ＆Ｐｕｌｍｏｎｍ＇ｙ　Ｄｉｓｅａｓｅｓ，Ｊｕｌｙ　２００８，Ｖｏ！．２１　１　．　２３５　・基础研究・　醛固酮在乳鼠　心肌细　胞表达肿瘤　坏死因子一　中的作用＊　李世英　邱劲　刘国仗　颜红兵　鲁晓春　（摘要］　目的：观察醛固酮对培养心肌细胞表达肿瘤坏死因子（ＴＮＦ－ａ）的影响。方法：在原代培养　的新生大鼠心肌细胞，采用免疫组化和ＲＴ　ＰＣＲ，评价１０　Ｍ、１０　Ｍ醛固酮及１０Ｉ５　Ｍ醛固酮拮抗剂螺　内酯对心肌细胞表达ＴＮＦ．ａ的影响。用凝胶滞留实验（ＥＭｓＡ）验证ＮＦ－ｘＢ是否参与ＴＮＦ－ａ的转录调控，　筛选ＴＮＦ．ａ可能启动子的位点。结果：ＴＮＦ－ａ的免疫组化染色在对照组心肌细胞呈阴性，１０Ｉ５和１０　Ｍ　醛固酮作用心肌细胞４８ｈ，心肌细胞胞浆中出现棕色颗粒，１０Ｉ５　Ｍ醛固酮与螺内酯共同孵育的心肌细胞　内ＴＮＦ－ａ染色呈阴性。与单纯培养的对照组心肌细胞相比，１０　Ｍ，１０　醛固酮刺激心肌细胞２４ｈ致心　肌细胞ＴＮＦ．ａ表达的ｍＲＮＡ显著增高，与螺内酯共同培养的心肌细胞中ＴＮＦ－ａｍＲＮＡ水平与对照组相比　没有明显差异。醛固酮组心肌细胞的核蛋白与ＴＮＦ－ａ上游含有潜在ＮＦ－ｘＢ结合位点的２段寡核苷酸　（一６１９　一５９１　ａｎｄ…５０８　４８１）的结合强于对照组，螺内酯能阻断这一效应。结论：正常情况下培养　的新生鼠心肌细胞内无ＴＮＦ－ａ合成，醛固酮通过醛固酮受体促使培养的心肌细胞表达ＴＮＦ－ａ，ＮＦ－ｘＢ核　转移是醛固酮激活心肌细胞表达ＴＮＦ－ａ的一条通路。　（关键词］　醛固酮；肿瘤坏死因子ａ；心肌　（中图分类号］Ｒ３９２．１２　［文献标识码］Ａ　（文章编号］　１００７．５０６２（２００８）０４．２３５．０４　Ｔｈｅ　ｒｏｌｅ　ｏｆ　Ａｌｄｏｓｔｅｒｏｎｅ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｔｕｎ］ｏｒ　Ｎｅｃｒｏｓｉｓ　Ｆａｃｔｏｒ・Ⅱｉｎ　ｃｕｌｔｕｒｅｄ　ｃａｒｄｉａｃ　ｍｙ￣ｙｔｅｓ　ｏｆ　ｎｅｏｎａｔａｌ　ｒａｔ　１２　Ｓｈ　ｎｇ，ＱＩＵ　Ｊｉｎ，Ｌ１Ｕ　Ｇｕｏｚｈａｎｇ，　ⅣＨｏｎｇｂｉｎｇ，ＬＵ　Ｘｉａｏｃｈｕｎ　Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｗａｒｄ　２８ｔｈ，　Ｃａｐ／ｔａ／Ｕｎｉｖｅｒｓ　ｏｆＭｅｄｉｃａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　ａｆｉｌｉａｔｅｄ　Ｂｅｉｊｉｎｇ　Ａｎｚｈｅｎ　Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｂｅｉｊｉｎｇ　１０００２９，Ｃｈｉｎａ　［Ａｂｓｔｒａｃｔ】　Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：Ｔｏ　ｏｂｓｅｒｖｅ　ｔｈｅ　ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｔｕｍｏｒ　Ｎｅｃｒｏｓｉｓ　Ｆａｃｔｏｒ－ａ（ＴＮＦ－￣）ｉｎ　ｃａｒｄｉａｃ　ｍｙｏｃｙｔｅｓ　ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ａｌｄ￣ｔｅｒｏｎｅ．Ｍｅｔｈｏｄ：Ｔｏ　ｅｘａｍｉｎｅ　ｔｈｅ　ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｏｎ　ｏｆ　ａｌｄｏｓｔｅｒｏｎｅ　ｔｏ　ＴＮＦ－ａ　ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，　ｍａｒｙ　ｃｕｌｔｕｒｅｄ　ｒａｔ　ｍ３，ｏｃｙｔｅｓ　ｗａｓ　ｉｎｃｕｂａｔｅｄ　ｉｎ　１０＿。。Ｍ　ａｌｄｏｓｔｅｒｏｎｅ．１０＿’Ｍ　ａｌｄｏｓｔｅｒｏｎｅ　ａｎｄ　１０＿’Ｍ　ａｌｄｏｓｔｅｒｏｎｅ　ｗｉｔｈ　１０一　Ｍ　ｓｐｉｏｒｎｏｌａｃｔｏｎｅ（ａｎ　ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ　ｏｆ　ａｌｄｏｓｔｅｒｏｎｅ）ｆｏｒ　４８　ｈｏｕｒｓ．Ｔｈｅｎ　ＴＮＦ－ａ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ａｎｄ　ｍＲＮＡ　Ｗａｓ　ｄｅｔｅｃｔｅｄ　ｂｙ　ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ａｎｄ　ＲＴ－ＰＣＲ　ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｅｌｅｃｔｏｒｐｈｏｒｅｔｉｃ　ｍｏｔｉｆ　ｓｈｉｆｔ　ａｓｓａｙ（ＥＭＳＡ）Ｗａｓ　ｐｅｒｆｏｒｍｅｄ　ｔｏ　ｄｅｔｅｃｔ　ｗｈｅａｔｈｅｒ　ｔｈｅｒｅ　ｉｓ　ＮＦ－ＪｃＢ　ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ　ｔｏ　ｔｈｅ　ｎｕｃｌｅａｒ　ａｎｄ　ｔｏ　ｓｃｒｅｅｎ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｐｒｏｂａｂｌｅ　ｐｒｏｍｏｔｅｒ　ｏｆ　ＴＮＦ－ａ．Ｒｅｓｕｌｔ：ＴＮＦ－ａ　ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ｓｔａｉｎｉｎｇ　Ｗａｓ　ｎｅｇａｔｉｖｅ　ｉｎ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｍｙｏｃｙｔｅｓ，ｂｕｔ　ｉｔ　Ｗａｓ　ｐｏｓｉｔｉｖｅ　ｉｎ　ｍｙｏｃｙｔｅｓ　ｔｒｅａｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ｌａｄｏｓｔｅｒｏｎｅ　ｆｏｒ　４８　ｈｏｕｒｓ　ａｎｄ　Ｗａｓ　ａｂｏｌｉｓｈｅｄ　ｂｙ　ｓｐｉｏｒｎｏｌａｃｔｏｎｅ．ＴＮＦ－ａ　ｍＲＮＡ　ｌｅｖｅｌ　Ｗａｓ　ｄｅｔｅｃｔｅｄ　ｂｙ　ＲＴ－ＰＣＲ　ｉｎ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅｓ，ｔｈｅ　ｏｐｔｉｃａｌ　ｄｅｎｓｅ　ｒａｔｉｏ　ｏｆ　ＴＮＦ－ａ　ＰＣＲ　ｐｒｏｄｕｃｔ　Ｗａｓ　ｏｂｖｉｏｕｓｌｙ　ｉｎｃｒｅａｓｅｄ　ｉｎ　ｍｙｏｃｙｔｅｓ　ｔｅｒａｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ｌａｄｏｓｔｅｒｏｎｅ　ｆｏｒ　２４　ｈｏｕｒｓ．ＥＭＳＡ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ　ｔｈｅ　ｂｉｎｄｉｎｇ　ｂｅｔｗｅｅｎ　ｎｕｃｌｅａｒ　ｅｘｔｒａｃｔ　ｏｆ　ｍｙｏｃｙｔｅｓ　ｔｅｒａｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ｌａｄｏｓｔｅｒｏｎｅ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｐｏｔｅｎｔｉｌａ　ＮＦ－ＪｃＢ　ｂｉｎｄｉｎｇ　ｓｉｔｅｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｕｐｓｔｒｅａｍ　ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ　ｏｆ　ＴＮＦ－ａ（一６１９－一５９１　ａｎｄ　一５０８一一４８１）ｗａｓ　ｉｎｃｒｅａｓｅｄ．Ｓｐｉｏｒｎｏｌａｃｔｏｎｅ　ｃｏｕｌｄ　ａｂｏｌｉｓｈ　ｔｈｅ　ａｄｖｅｒｓｅ　ｅ　ｃｔ　ｏｆ　ａｌｄｏｓｔｅｒｏｎｅ．Ｔｈｅ　ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ＮＦ－ＪｃＢ　ｔｏ　ｔｈｅ　ｎｕｃｌｅａｒ　ｗａｓ　ｅｌｅｖａｔｅｄ　ｉｎ　ｍｙｏｃｙｔｅｓ　ｔｒｅａｔｅｄ　ｗｉｈｔ　ａｌｄｏｓｔｅｒｏｎｅ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：Ｔｈｅ　ＴＮＦ－ａ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｌｅｖｅｌ　Ｗａｓ　ｎｅｇａｔｉｖｅ　ｉｎ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｃａｒｄｉｏｍｙｏｅｙｔｅｓ，ａｎｄ　ｔｈｅ　ｍＲＮＡ　ｌｅｖｅｌ　Ｗａｓ　ｖｅｒｙ　ｌｏｗ，ｂｕｔ　ｉｔ　ｗａｓ　ｏｂｖｉｏｕｓｌｙ　ｉｎｃｒｅａｓｅｄ　ｉｎ　ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅｓ　ｔｅｒａｔ￣：ｄ　ｗｉｔｈ　ａｌｄｏｓｔｅｒｏｎｅ，ｗｉｈｔ　ＮＦ－ＪｃＢ　ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ　ｔｏ　ｔｈｅ　ｎｕｃｌｅａｒ，ｗｈｉｃｈ　ｍａｙ　ｂｅ　ａ　ｐａｔｈｗａｙ　ｌｅａｄｉｎｇ　ｔｏ　ｔｈｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ＴＮＦ－ａ．　［Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ］　Ａｌｄｏｓｔｅｒｏｎｅ；Ｔｕｍｏｒ　ｎｅｃｏｒｓｉｓ　ｆａｃｔｏｒ－ａ；Ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅｓ　本研究受国家自然基金项目资助（３０６００２３６）　作者单位：１０００２９北京首都医科大学附属北京安贞医院心肺血管疾病抢救中心２８病房（李世英颜红兵）北京　协和医学院阜外心血管病医院高血压中心（邱劲刘国仗）中国人民解放军总医院心血管南楼一科（鲁晓春）　维普资讯 http://www.cqvip.com ２３６　心肺血管病杂志２００８年７月第２７卷第４期Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆＣａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ＆Ｐｕｌｍｏｎａｒｙ　Ｄｉｓｅａｓｅｓ，Ｊｕｌｙ　２００８，Ｖｏ１．２７，Ｎｏ．４　在心力衰竭形成和发展的过程中，肾素一血管　紧张素一醛固酮系统（ＲＡＡＳ）是其中重要的中介因　素，血管紧张素转化酶抑制剂、血管紧张素ＩＩ．１型　上游５　．ＣＡＡＡＧ　ｒｒＧＴＣＡＴＧＧＡＴＧＡ．３　，下游引物５　．　ＣＣＡＴＧＧＡＧＡＡＧＧＣＴＧＧＧ．３　，长度１９４　ｂｐ。ＴＮＦ．ａ引　物：上游５　．ＣＡＣＧＣＴＣ　ｒｒＣＴＧＴＣＴＡＣＴＧＡ．３　，下游３　．　ＧＧＡＣＴＣＣＧＴＧＡＴＧＴＣＴＡＡＧＴ－３　，长度５４６　ｂｐ。９４℃　（ＡＴ．１）受体拮抗剂在一定程度上减缓了病情的进　展，降低心力衰竭患者的死亡率。醛固酮（Ａｉｄ）作为　肾素．血管紧张素．醛固酮系统（ＲＡＡＳ）的终末环节，　通过醛固酮受体作用于心肌细胞和心肌间质细胞。　临床试验证实醛固酮拮抗剂进一步加强了上述药物　５　ｍｉｎ，５８℃２　ｍｉｎ，７２℃２　ｍｉｎ，１个循环；９４ｏＣ　３０　Ｓ，　５８℃３０　Ｓ，７２℃４５　Ｓ，３０个循环；７２℃７　ｍｉｎ。ＧＡＰＤＨ　为２５个循环，ＴＮＦ－￣ｘ为３０个循环。　凝胶滞留实验（ＥＭＳＡ）：对处理因素培养２４　ｈ　治疗心力衰竭的效果，使死亡率进一步下降…。最　近另一影响心力衰竭发展的因素——肿瘤坏死因子　（ＴＮＦ．ａ）与ＲＡＡＳ的关系逐渐引起了人们的关注，本　研究试图观察醛固酮是否促进心肌细胞表达ＴＮＦ．ａ　及其信号传导途径。　．　资料与方法　动物与试剂：新生二级１～３　ｄ　ＳＤ大鼠（中国药　品生物制品检定所），醛固酮（Ａｉｄ）（Ｓｉｇｍａ公司），螺　内酯（Ｓｐｒｉ）（美国Ｓｉｇｍａ公司），山羊抗鼠的ＴＮＦ＿ａ多　克隆抗体（来自Ｓａｎｔａ　Ｃｒｕｚ），ＴＲＩＺＯＬ（美国ＧＩＢＣＯ．　ＢＲＬ公司），ＭＭ　ＭＬＶ反转录酶（美国Ｐｒｏｍｅｇａ公司），　Ｇｅｌｂｉｎｄｉｎｇ　ａｓｓａｙ　ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ公司）ｏ　细胞培养：心肌原代培养参照Ｓｉｍｐｓｏｎ　ａｎｄ　Ｓａｖｉｏｎ　方法：取１～３　ｄ　ＳＤ大鼠乳鼠，无菌条件下开　胸取出心脏，清洗后０．０８％胰蛋白酶的溶液３７℃反　复消化，离心，１０％胎牛血清的ＤＭＥＭ悬浮细胞，差　速贴壁法去除成纤维细胞，用六孑Ｌ板接种细胞，１０６／　孑Ｌ，５％ＣＯ，，３７ｏＣ培养。在原代培养的第３～４　ｄ施　加干预因素，分４组：阴性对照；１０　Ｍ醛固酮；１０　Ｍ醛固酮；１０　Ｍ醛固酮＋ｌ０　Ｍ螺内酯，分别培　养２４、４８　ｈ。　免疫组织化学染色：取出培养４８　ｈ的心肌细胞　爬片，ＰＢＳ冲洗，４％多聚甲醛固定，ＰＢＳ冲洗后加入　１％兔血清封闭；采用抗ＴＮＦ．ａ的多克隆抗体（Ｓａｎｔａ　Ｃｒｕｚ　Ｃｏ．ＵＳＡ），工作液浓度１：５０，染色系统用亲和　素生物素标记的过氧化物酶系统，呈色底物二氨基　联苯胺。　ＲＴ－ＰＣＲ：干预培养２４　ｈ的心肌细胞及其对照，　按ｒＩ’ＲＩＺＯＬ（ＧＩＢＣＯ）说明书提取总ＲＮＡ，用紫外分光　光度计测ＯＤ猢，确定ＲＡＮ的浓度。以ＯｌｉｇｏＴ。　为引　物，按照２　ｔｔｇ　ＲＮＡ＋０．５　ｇ　ＯｌｉｇｏＴｌ　（反转录引物）的　比例在０．２　ｍＬ　ＰＣＲ管内混合样品，总体积＜９　ｔｔＬ，　置７０℃水浴５　ｍｉｎ，立即置于冰上，ＭＭ—ＭＬＶ反转录　酶进行逆转录：４２℃１　ｈｒ一９９℃２　ＩＴｌｉｎ一４℃５　ｍｉｎ。　ｃＤＮＡ产物为模板进行ＰＣＲ。内参照ＧＡＰＤＨ，引物：　的心肌细胞及其对照，参照Ａｂｍａｙｒ等　的方法提取　核蛋白，将细胞转移到破膜缓冲液（１０　ｍｍｏｌ／Ｌ　ＨＥＰＥＳ　ＰＨ：７．９，１　ｍｍｏｌ／Ｌ　ＥＤＴＡ，６０　ｍｍｏｌ／Ｌ　ＫＣ１，１　ｍｍｏｌ／Ｌ　ＤＴＹ，１　ｍｍｏｌ／Ｌ　ＰＭＳＦ，１　ｇ／ｍＬ　ｌｅｕｐｅｐｔｉｎｅ，２０　ｇ／ｍＬ　ａｐｒｏｔｉｎｉｎ，０．５％ＩＧＥＰＡＬ　ＣＡ一６３０）中，０℃３０　ｍｉｎ，３　０００　ｒｐｍ离心，沉淀，加入核提取缓冲液（２５０　ｍｍｏｌ／Ｌ　Ｔｒｉｓ—ＨＣ１　ＰＨ：８．０，６０　ｍｍｏｌ／Ｌ　ＫＣＬ，１　ｍｍｏｌ／Ｌ　Ｄ１　，１　ｍｍｏｌ／Ｌ　ＰＭＳＦ，１　ｔｔｇ／ｍＬ　ｌｅｕｐｅｐｔｉｎｅ，２０　ｔ，ｓ／ｍＬ　ａｐｒｏｔｉｎｉｎ），一７０℃和３７℃反复冻溶３次，１５　０００　ｒｐｍ　离心１５　ｍｉｎ，取上清，采用Ｂｒａｌｆｏｒｄ法进行蛋白定量。　探针选自ＴＮＦ．ａ转录起始位点上游两段寡核苷酸序　列，一６１９～一５９１（ｃａｔ　ｔｃｃ　ｃｔｃ　ｔｇｇ　ｇｇｃ　ｔｇｃ　ＣＣＣ　ａｔｔ　ｃｔｃ　ｃｔｃ）ａｎｄ一５０８～一４８１（ｃｔｃ　ａｇａ　ｅａａ　ｇｇｇ　ｇｇｃ　ｔｔｔ　ＣＣＣ　ｔｃｃ　ｔｅａ　ａｃ），采用凝胶滞留实验观察核蛋白与这两段寡　核苷酸结合的情况，用冷探针竞争确定核蛋白与寡　核苷酸结合的特异性，冷探针是标记探针的５０倍，　用ｐ６５抗体确定与ＴＮＦ．ａ上游序列结合的核蛋白中　含有ＮＦ．　。　统计学分析：计量资料用均数±标准差表述，组　间差异采用ｔ检验，Ｐ＜０．０５有统计学差异。　结　果　１．醛固酮促进心肌细胞ＴＮＦ．ａ合成增加：对照　心肌细胞的ＴＮＦ－￣ｘ免疫组化颜色呈阴性，ｌ０　Ｍ和　ｌ０　Ｍ醛固酮作用心肌细胞４８　ｈ后，心肌细胞胞浆　中出现棕色颗粒，细胞核出现了空洞，染色质凝聚、　固缩、聚集于核膜边缘。ｌ０　Ｍ醛固酮与ｌ０　Ｍ螺　内酯共同作用４８　ｈ的心肌细胞中无ＴＮＦ－ａ染色的　棕色颗粒，细胞核形态正常（图１）。　２．醛固酮促进心肌细胞ＴＮＦ．ａ　ｍＲＮＡ增加：每　个培养样品获得的ｅＤＮＡ在相同的ＰＣＲ反应条件下　分别扩增ＧＡＰＤＨ和ＴＮＦ．ａ，以ＧＡＰＤＨ条带的亮度　为１００％，校正ＴＮＦ－ａ条带的亮度，进行半定量分析　（图２，图３）。与对照心肌细胞相比，１０　Ｍ，１０　Ｍ　醛固酮干预心肌细胞２４　ｈ均可导致心肌细胞ＴＮＦ．ａ　表达ｍＲＮＡ显著增高（分别是ｔ＝４．６１，Ｐ＜０．００１；ｔ　维普资讯 http://www.cqvip.com 心肺血管病杂志２００８年７月第２７卷第４期Ｊｏｕｒｎａｌ　０ｆ　Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ＆Ｐｕｌｍ０ｎａｒｙ　Ｄｉｓｅａｓｅｓ，Ｊｕｌｙ　２００８，Ｖｏ１．２７，Ｎｏ．４　２３７　一士０　《０　ＬＩｄｌ甲ａｃ）序列的结合相对于对照明显增强，高浓度冷探针　２　●可以竞争上述结合，ｐ６５抗体也可以竞争上述结合，　该抗体可以封闭核蛋白ＮＦ．　Ｂ与潜在ＮＦ。　Ｂ结合序　列相结合的位点，因此使醛固酮干预的心肌细胞核　蛋白这两段序列的结合被阻断。另外螺内酯可以中　图２心肌细胞ＴＮＦ－Ｑ和内参ＧＡＰＤＨ的ＲＴ－ＰＣＲ　Ｏ　５　Ｏ止这一效应提示心肌细胞核蛋白活化是醛固酮特异　产物条带辉度对比　１：对照；２：１０’　Ｍ醛固酮；３：１０’　Ｍ醛固酮；　４：１０　Ｍ醛固酮＋螺内酯　＝２．９７，Ｐ＝０．０１４）（表１，表２），在１０　Ｍ醛固酮与　１０　Ｍ螺内酯共同培养的心肌细胞，ＴＮＦ．ａ　ｍＲＮＡ　定量与对照相比没有明显差异（ｔ＝１．３８，Ｐ＞　０．０５），与１０　Ｍ醛固酮孵育的心肌细胞相比有明　显差异（ｔ＝３．８４，Ｐ＜０．０５）。　表１醛固酮促进培养心肌细胞ＴＮＦ．ａ　ｍＲＮＡ的表达　注：Ａｉｄ：醛固酮　表２螺内酯可以去除醛固酮促进心肌细胞表达ＴＮＦ．ａ的作用　注：Ａｉｄ：醛固酮；Ｓｐｉｒ：螺内酯　：ｌ０’　Ａｉｄ＋Ｓｐｉｔ组与１０一　Ａｉｄ组相比　有差异　ｊＬ　　。　，Ｃｏｎｔｒｏｌ　１０　Ａｉｄ　１０’Ａｉｄ　１０　Ａｉ豳．ｄ￣Ｓｐｉ　ｒ　图３心肌细胞ＴＮＦ．ｎ的ＲＴ－ＰＣＲ产物条带辉度对比　：与对照相比差异有显著性　：与１０　Ａｌｄ＋Ｓｐｉｒ与１０　Ｍ　Ａｌｄ　相比有明显差异　３．醛固酮促进心肌细胞核蛋白ＮＦ。　Ｂ与ＴＮＦ．ａ　上游序列的结合增加（图４）：１０　Ｍ，１０　Ｍ醛固酮　干预心肌细胞的核蛋白与ＴＮＦ．ａ转录起始位点上游　一６１９～一５９１（ｃａｔ　ｔｃｃ　ｃｔｃ　ｔｇｇ　ｇｇｃ　ｔｇｃ　ＣＣＣ　ａｔｔ　ｃｔｃ　ｃｔｃ）　ａｎｄ一５０８～一４８１　ｆ　ｃｔｃ　ａｇａ　ｃａａ　ｇｇｇ　ｇｇｃ　ｔｔｔ　ＣＣＣ　ｔｃｃ　ｔｃａ　的作用。　１　２　３　４　５　６　麟　■謦　嘲　Ａ　图４醛固酮促进ＮＦ．　Ｂ的活化与核转移　在对照细胞存在核蛋白与ＴＮＦ．ｎ上游的潜在ＮＦ．　Ｂ结合位点的　结合，醛固酮孵育的细胞核蛋白与上述位点的结合增强。Ａ．核　蛋白与寡核苷酸一６１９一一５９１（ｃａｔｔｃｃ　ｃｔｃｔｇｇ　ｇｇｃｔｇｃ　ＣＣＣ　ａｔｔ　ｃｔｃ　ｃｔｃ）　的结合；Ｂ．核蛋白与寡核苷酸一５０８一一４８１（ｅｔｃ　ａｇａ　ｅａａ　ｇｇｇ　ｇｇｃ　ｔｔｔ　ＣＣＣ　ｔｃｃ　ｔｃａ　ａｅ）的结合。１，２：对照心肌细胞；３，４：１０　Ｍ醛固酮孵　育的心肌细胞；２，４：一６１９一一５９１冷探针竞争；５：０６５抗体竞争：　６：１０　Ｍ醛固酮＋螺内酯；　讨　论　炎症是心力衰竭形成和发展中重要的病理过　程，ＴＮＦ。ａ是一个多功能的细胞因子，能够导致心肌　细胞肥大、抑制心肌收缩力和诱导心肌细胞凋亡。　在转基因小鼠，ＴＮＦ。ａ可以复制出类似扩张性心肌　病的动物模型［４　３，ＴＮＦ．ａ参与了心肌衰竭的发生和　发展。最近研究发现在关节炎的治疗中，醛固酮促　进ＴＮＦ—ａ的表达　，Ｍｉｕｒａ等　发现血管紧张素Ⅱ通　过ＡＴ１受体促进外周单核细胞表达ＴＮＦ．ａ，而螺内　酯可以阻断这一效应，说明血管紧张素Ⅱ通过醛固　酮和醛固酮受体促进ＴＮＦ。ａ的表达。这些研究提示　在ＲＡＡＳ系统与炎症因子ＴＮＦ．ａ之间存在相互影　响。本研究在心肌细胞中证明醛固酮促进ＴＮＦ。ａ的　表达，醛固酮拮抗剂螺内酯可以阻断这一效应。　本研究利用免疫组化观察到对照培养心肌细胞　维普资讯 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２３８　心肺血管病杂志２００８年７月第２７卷第４期　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　ｃａｒｄｉ０ｖａｓｃＩｌｌ　＆Ｐｕｌｍｏｎａｒｙ　Ｄｉ８ｅａ９ｅｓ。Ｊｕｌｙ　２００８，Ｖｏ１．２７，Ｎｏ．４　ＴＮＦ．ａ染色阴性。ＲＴ．ＰＣＲ可以检测到小量的ＴＮＦ．　ａｍＲＮＡ，认为ＴＮＦ．ａ在正常生理状况下是持续低量　转录的，转录后调节影响ＴＮＦ．ａ蛋白质水平和生物　参考文献　［１］Ｐｉｔｔ　Ｂ，￣ｎｎａｄ　Ｆ，Ｒｅｍｍｅ　ＷＪ。ｅｔ　ａ１．Ｔｈｅ　ｅｆｅｃｔ　ｏｆ　ｓｐｉｒｏｎｏｌａｃｔｏｎｅ　ｏｎ　ｍｏｒｂｉｄｉｔｙ　ａｎｄ　ｍｏｒｔａｌｉｔｙ　ｉｎ　ｐａｔｉｅｎｔｓ　ｗｉｔｈ　ｓｅｖｅｒｅ　ｈｅａｒｔ　ｆａｉｌｕｒｅ．Ｒａｄｏｍｉｚｅｄ　Ａｌｄａｃｔｏｎｅ　Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ　Ｓｔｕｄｙ　学效应。用醛固酮干预，可以使心肌细胞表达的　ＴＮＦ－ａ，在ｍＲＮＡ和蛋白水平均显著增高。以上结果　提示醛固酮可以促进ＴＮＦ－ａ的表达。我们既往的研　Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｏｒｓ．Ｎ　Ｅｎｇｌ　Ｊ　Ｍｅｄ，１９９９，３４１：７０９－７１７．　究证明血管紧张素Ⅱ促进培养的新生鼠心肌细胞表　［２］Ｓｉｍｐｓｏｎ　Ｐ，ＭｃＧｒａｔｈ　Ａ。Ｓａｖｉｏｎ　Ｓ．Ｍｙｏｃｙｔｅ　ｈｙｐｅｒｔｒｏｐｈｙ　ｉｎ　・　ｎｅｏｎａｔａｌ　ｒａｔ　ｈｅａｒｔ　ｃｕｌｔｕｒｅｓ　ａｎｄ　ｉｔｓ　ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ　ｂｙ　ｓｅｒｕｍ　ａｎｄ　达ＴＮＦ．ａ¨　，由于血管紧张素Ⅱ和醛固酮在心肌组　ｂｙ　ｃａｔｅｃｈｏｌａｍｉｎｅｓ．Ｃｉｒｃ　Ｒｅｓ，１９８２，５１：７８７－８０１．　织中存在自分泌和旁分泌反馈效应，血管紧张素Ⅱ　［３］　Ａｂｍａｙｒ　ＳＭ，Ｗｏｒｋｍａｎ儿，Ｒｏｅｄｅｒ　ＲＧ．Ｔｈｅ　ｐｓｅｕｄｏｒａｂｉｅｓ　促进醛固酮和醛固酮受体的合成，醛固酮也能促进　ｉｍｍｅｄｉａｔｅ　ｅａｒｌｙ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｓｔｉｍｕｌａｔｅｓ　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉＯｎ　ｂｙ　血管紧张素ＡＴ１受体的合成，该效应的放大作用将　ｆａｃ／ｌｉｔａｔｉｎｇ　ＪＤ　ｐｒｏｍｏｔｅｒ　ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ．Ｇｅｎｅｓ＆Ｄｅｖ．　进一步增强心肌ＴＮＦ－ａ表达。　１９８８，２：５４２－５５３．　用醛固酮诱导ＴＮＦ－ａ表达，其心肌细胞核蛋白　［４］Ｆａｔｉｍａ　Ｆ，Ｇａｌｌ　ＤＴ。Ｂｒｅｔｔ　Ｇ，ｅｔ　ａ１．Ｍａｇｎｅｔｉｃ　ｒｅ＇ｓｏｎｎａｃｅ　抽提物与ＴＮＦ－ａ转录起始位点上游一６１９　一５９１　ｉｍａｇｉｎｇ　ａｎｄ　ｉｎｖａｓｉｖｅ　ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　ｏｆ　ｈｅａｒｔ　（ｃａｔ　ｔｃｃ　ｃｔｃ　ｔｇｇ　ｇｇｃ　ｔｇｃ　ＣＣＣ　ａｒｔ　ｃｔｃ　ｃｔｃ）和一５０８～一４８１　ｆａｉｌｕｒｅ　ｉｎ　ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ　ｍｉｃｅ　ｗｉｈｔ　ｍｙｏｃａｒｄｉｌａ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　（ｃｔｃ　ａｇａ　ｃａａ　ｇｇｇ　ｇｇｃ　ｔｔｔ　ＣＣＣ　ｔｃｃ　ｔｃａ　ａｃ）结合增强，这两　ｔｕｍｏｒ　ｎｅｃｒｏｓｉｓ　ｆａｃｔｏｒ－ａ．Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，１９９９，９９：４４８－４５４．　段序列都是ＮＦ．ＫＢ的潜在结合位点，ＮＦ－ｔｃＢ的特异　［５］Ｂｅｎｄｔｚｅｎ　Ｋ。Ｈａｎｓｅｎ　ＰＲ，Ｒｉｅｎｅｃｋ　Ｋ．Ｓｐｉｒｏｎｏｌａｅｔｏｎｅ／　性抗体可以封闭核蛋白与该序列的结合，说明醛固　Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ　Ｓｔｕｄｙ　Ｇｒｏｕｐ．［Ｓｐｉｒｏｎｏａｌｃｔｏｎｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｓ　ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｐｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ　ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ，ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ　ｔｕｍｏｒ　ｎｅｃｒｏｓｉｓ　ｆａｃｔｏｒ－　酮诱导ＮＦ－￣Ｂ的活化、核转移。一６１９　一５９１和　ｌａｐｈａ　ａｎｄ　ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ—ｇａｍｍａ　ａｎｄ　ｈａｓ　ｐｏｔｅｎｔｉａｌ　ｅｆｆｅｃｔ　ｉｎ　ｔｈｅ　…５０８　４８１这两段序列位于ＴＮＦ．ａ转录起始位点　ｔｅｒａｔｍｅｎｔ　ｏｆ　ａｒｔｈｒｉｔｉｓ］Ｕｇｅｓｋｒ　Ｌａｅｇｅｒ，２００４，１０５：３２０３－　上游，在ＴＮＦ－ａ转录增强的同时与核蛋白的结合增　３２ｏ７．　强，并且因为它是ＮＦ．　Ｂ结合位点，提示其可能含有　［６】Ｍｉｕｒａ　Ｒ，Ｎａｋａｍｕｒａ　Ｋ，Ｍｉｕｒａ　Ｄ，ｅｔ　ａ１．Ａｌｄｏｓｔｅｏｒｎｅ　ＴＮＦ．ａ转录调控的启动子序列，为明确它们启动子　ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　ａｎｄ　ｃｙｔｏｋｉｎｅ　ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｉｎ　ｈｕｍａｎ　ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ　ｂｌｏｏｄ　的功能尚需用报告基因的方法进一步验证。　ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ　ｃｅｌｌｓ．Ｊ　Ｐｈａｒｍａｃｏｌ　Ｓｃｉ，２００６，１０２：２８８．２９５．　醛固酮作用于心肌细胞４８ｈ可以诱导心肌合成　［７］李世英，倪新海，陈曦，等．血管紧张素Ⅱ促进培养的　ＴＮＦ－ａ，同时出现心肌细胞核固缩、染色质边集在核　新生鼠心肌细胞表达ＴＮＦ．ａ．高血压杂志，２００３，１１：　膜内侧显新月形、核碎裂，提示细胞凋亡，螺内酯作　１６１．１６４．　用的心肌细胞没有出现ＴＮＦ．ａ的合成及上述细胞凋　［８］　Ｂｕｒｎｉｓｔｏｎ　ＪＧ，Ｓａｉｎｉ　Ａ，Ｔａｎ　ＬＢ，ｅｔ　ａ１．Ａｌｄｏｓｔｅｏｒｎｅ　ｉｎｄｕｃｅｓ　ｍｙｏｃｙｔｅ　ａｐｏｐｔｏｓｉｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｈｅａｒｔ　ａｎｄ　ｓｋｅｌｅｔａｌ　ｍｕｓｃｌｅｓ　ｏｆ　ｒａｔｓ　ｉｎ　亡表现。Ｂｕｒｎｉｓｔｏｎ等　发现醛固酮可以诱导心肌细　ｖｉｖｏ．Ｊ　Ｍｏｌ　Ｃｅｌｌ　Ｃａｒｄｉｏｌ，２００５，３９：３９５－３９９．　胞凋亡，但醛固酮是否通过ＴＮＦ．ａ产生细胞凋亡的　（本文图ｌ见封三页）　作用还有待进一步研究。　（２００７—１２—０４收稿；２００８—０２—０３修回）　・致作者・　编排规范字“黏＂与“粘＂和“惟＂与“唯＂的用法　根据最新版《新华字典》和《现代汉语词典》，对“黏”与“粘”字的使用规范为：在发“ｎｉａｎ”音时一律用“黏”字，在发“ｚｈａｎ”音　时用“粘”字。关于“惟”与“唯”字的使用，二字均表示单单、只是等含义，但用在惟一、惟独、惟有、惟恐、惟命是听、惟利是图等　词汇时，一律用“惟”字；用在唯物主义、唯心主义、唯理论、唯名论等词汇时，用“唯”字。　本刊编辑部　维普资讯 http://www.cqvip.com 醛固酮在乳鼠心肌细胞表达肿瘤坏死因子一OL中的作用(正文见235页)原代BMSCs培养8d相邻集落互相融合成片细胞呈纺锤形梭形多角形还有，、、一，种有更强的折光性的小圆形细胞BMSCs。第六代EC显BMSCs，培养4d细胞形态呈均一的成纤维状小而圆的细胞显著减少，。图6的Cx43免疫细胞化学染，色)棕红色阳性物质主要在细胞浆表达图7阴性对照组免疫细胞化学染色(PBS代替Cx43)细胞浆中无阳性物图5体外培养骨髓问充质干细胞的超微结构，浆内的糖原颗粒(白色箭头)和相邻细胞间缝隙连接(黑色箭头)BaE质tLl、胞质内细胞器丰富(白色箭头处为溶酶体)Bar=200nm；2．处于相对活跃期的大鼠BMSCs，，，核呈不规．，。r=21xm；3．处于相对静止期的大鼠BMSCs核椭圆形核质比大胞细胞器较少Bar=。Bar=21tm．；4．细胞浆内的粗面内质网(黑色粗箭头)线粒体(白色箭头)核相邻细胞间的紧密连接(黑色细箭、200nm