隋志伟;刘晓夏;王晶;傅博强;薛蕾;刘思章;郝林
【摘 要】粘质沙雷氏菌是生物防护评价的指示菌.对粘质沙雷氏菌营养琼脂平板涂布法进行了方法验证和协同实验验证以及不确定度分析.结果显示,该方法重复性和复现性均较好,室内重复性相对标准偏差为8.93％,室间相对标准偏差为14.95％.经统计分析,营养琼脂平板涂布法相对扩展不确定度为12.60％(k=2),适用于粘质沙雷氏菌定量测量.
【期刊名称】《计量学报》
【年(卷),期】2018(039)004
【总页数】5页(P588-592)
【关键词】计量学;粘质沙雷氏菌;平板涂布法;营养琼脂;协同实验验证
【作 者】隋志伟;刘晓夏;王晶;傅博强;薛蕾;刘思章;郝林
【作者单位】中国计量科学研究院,北京100029;中国计量科学研究院,北京100029;山西农业大学 食品科学与工程学院,山西太谷030800;中国计量科学研究院,北京100029;中国计量科学研究院,北京100029;中国计量科学研究院,北京100029;中国计量科学研究院,北京100029;吉林农业大学 生命科学学院,吉林长春130118;山西农业大学 食品科学与
工程学院,山西太谷030800
【正文语种】中 文
【中图分类】TB99
1 引 言
近年来，SARS、 高致病性禽流感、埃博拉等新发传染病不断出现[1,2]，使得生物安全问题引起了人们的广泛关注[3,4]。为了保障病原实验室的生物安全，均要求按标准对人员防护装备[5～10]进行微生物防护性能测试。不同标准中使用的指示细菌不同，不能对测试结果进行有效比对。毕建军等通过研究发现，综合考虑培养周期、雾化和冲击耐受性、消毒剂敏感性和菌落特征等因素，粘质沙雷氏菌(serratia marcescens)更适宜作为一种生物检测的指示菌[11]，并在生物安全柜等设备[12,13]性能评价应用中取得了良好的效果。粘质沙雷氏菌作为生物防护评价的指示菌，其量值准确可以保证人员防护装备防护性能评价的有效性和可比性。
本研究针对粘质沙雷氏菌营养琼脂平板涂布法进行了方法验证，同时选择8家实验室进行协同实验验证，建立了粘质沙雷氏菌测量方法，为人员防护装备防护性性能评价提供了计量技术支撑。
2 材料与方法
2.1 试剂与仪器
2.1.1 材料与试剂
粘质沙雷氏菌标准菌株(ATCC，菌株编号8039)由军事医学科学院微生物流行病研究所菌种保藏库提供；粘质沙雷氏菌样品由中国计量科学研究院研制。
主要试剂有：营养肉汤、营养琼脂培养基、磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline，PBS)，购自北京陆桥技术有限责任公司。
2.1.2 仪器与设备
HVE-50高压灭菌锅，日本Hirayama公司；HWS-400恒温培养箱，上海精宏实验设备有限公司； Milli-Q Advantage纯水仪，美国Millipore公司；CP225D电子天平，德国Sartorius公司；移液器 (1 000 μL、100 μL、200 μL)，德国Eppendorf公司。
2.2 方 法
采用营养琼脂平板涂布法测量粘质沙雷氏菌样品的活菌浓度。
2.2.1 培养基制备
将营养琼脂培养基粉末加于蒸馏水中，煮沸溶解，调节pH 7.2±0.2。分装锥形瓶,每瓶分装 100 mL，121 ℃高压灭菌15 min。使用时加热溶化，摇匀后倾注平板。灭菌后
的培养基在4 ℃冰箱储存不超过48 h。
2.2.2 样品的稀释
将待测粘质沙雷氏菌冻干样品从-20 ℃冰箱取出后，在室温下放置5 min，用移液器加入2 mL无菌的磷酸盐缓冲液作为稀释液进行复水溶解，充分混匀后制备成样品匀液S0。再用1 mL 移液器吸取1 mL样品匀液S0，沿管壁缓慢注于盛有9 mL稀释液的无菌试管中(吸头尖端不可触及稀释液面)，振摇试管或换用1支1 mL无菌吸头反复吹打使其混合均匀，制成1:10的样品匀液S1。再用稀释液对充分溶解后的样品S1在经灭菌后的试管中进行10倍系列稀释，分别为S2、S3、S4、…、Sn，每递增稀释一次，换用一次1 mL无菌吸头，混匀要充分。
2.2.3 样品的接种
选择3个适宜稀释度的样品匀液，每个稀释度分别吸取0.2 mL样品匀液接种于营养琼脂平板，然后用无菌L棒涂布整个平板，注意不要触及平板边缘。因粘质沙雷氏菌如不涂布均匀会出现粘连成片的情况，涂布时平板表面的样品液体应全部吸收，每个稀释度重复3个平板。
2.2.4 培 养
涂布后，将平板静置10 min后，再将其倒置于培养箱，在30 ℃±1 ℃温度下培养12～24 h。
2.2.5 典型菌落计数和确认
粘质沙雷氏菌的菌落基本上是凸起，中心不透明，边缘不规则，均产生红色色素。选择有典型的粘质沙雷氏菌菌落的平板，且菌落数在15～150 CFU之间的平板，计数典型菌落数和记录稀释因子。菌落计数以菌落形成单位(colony-forming units，CFU)表示，实验结果以活菌浓度(CFU/mL)表示。
1)若只有一个稀释度平板的菌落数在15～150 CFU之间且有典型菌落，计数该稀释度平板上的典型菌落，按式(1)计算结果。
(1)
式中：C为粘质沙雷氏菌活菌浓度；N为某一平板上粘质沙雷氏菌典型菌落的总数；a为适宜范围菌落数的平板数；d为稀释因子；v为平板上粘质沙雷氏菌悬浮液接种体积。
2) 若有2个连续稀释度的平板菌落数均在15～150 CFU 之间，按式(2)计算结果。
(2)
式中：a为第一稀释度(低稀释倍数)平板个数；b为第二稀释度(高稀释倍数)平板个数。
2.3 营养琼脂平板涂布法重复性验证
按照2.2节方法中描述的实验步骤对粘质沙雷氏菌样品采用营养琼脂平板涂布法进行
测量。重复性验证时，每天重复测试样品9次，连续测试5天，共得到45个测定结果，同时用无菌磷酸盐缓冲液做空白对照，培养后观察结果。标准偏差s采用式(3)计算:
(3)
式中：s为营养琼脂平板涂布法重复性标准偏差；Q为实验总天数；e为每日重复次数；xqi为第q天第i次重复结果；为第q天所有重复结果的均值。
重复性相对标准偏差RSD采用式(4)计算:
(4)
式中：为总平均值。
2.4 营养琼脂平板涂布法协同验证实验
按照GB/T 6379.2—2004《测量方法与结果的准确度(正确度与精密度)第2部分：确定标准测量方法重复性与再现性的基本方法》[14]，选择通过ISO 17025或CNAS-CL01:2006认可，或经计量认证的8家实验室,全部采用经实验组织方确认了的粘质沙雷氏菌营养琼脂平板涂布法进行方法的协同验证实验。8家实验室通过预实验的分析合格后，每家实验室收到由组织实验室发放的5瓶粘质沙雷氏菌样品和标准操作程序(SOP)以及填写结果报告的表格后，按照2.2节方法中的描述分别开展协同验证实验，并选择3位具有微生物实验操作经验的工作人员分别单独计数平板上出现的典型粘质沙雷氏菌菌落，取平均值作为该平板的实验结果。通过计算将实验结果返回实验组织方后统计分析，先对各家
实验室数据采用格拉布斯准则进行离群值检验[15]，再用科克伦(Cochran)法检查各组数据之间是否等精度[16]，采用式(4)计算室内标准偏差sr，采用式(5)～式(7)计算室间标准偏差sR，采用式(8)和式(9)计算方法的重复性r和复现性R。
(5)
式中：m为实验室个数；n为样品个数；xij为第i个实验室第j个样品的结果；为第i个实验室所有样品测量结果的均值。
(6)
(7)
(8)
(9)
式中：：sl为室间变动性标准偏差。
2.5 营养琼脂平板涂布法的不确定度评定
粘质沙雷氏菌营养琼脂平板涂布法的不确定度uchar由两部分组成: 第1部分是测量方法的A类标准不确定度uA;第2部分是测量方法的B类标准不确定度uB。
3 结 果
3.1 营养琼脂平板涂布法室内重复性分析
采用建立的营养琼脂平板涂布法，重复测试粘质沙雷氏菌样品9次，连续测定5天，共得到45个测定结果，同时用无菌磷酸盐缓冲液做空白对照，统计实验结果。按照式(3)和式(4)计算，结果见表1。表中的为第q天所有重复结果的均值。由表1可知，该方法的室内重复性RSD为8.93%，满足微生物定量测量方法<30%的要求[18]，说明粘质沙雷氏菌营养琼脂平板涂布法具有很好的重复性，能够对粘质沙雷氏菌进行准确的定量测量。
表1 粘质沙雷氏菌营养琼脂平板涂布法测量重复性结果(Q=5，e=9) ×1010 CFU/mLq
重
复
性
结
果
123456789xq
第第第第
第2345
1
天天天天天
1.001.011.071.051.061.161.061.121.251.090.941.160.871.061.251.241.251.191.091.121.101.011.221.250.971.051.021.121.141.101.121.181.241.070.910.951.071.121.251.10
1.191.251.071.231.071.171.211.121.251.17x1.12s0.10RSD(%)8.93
3.2 营养琼脂平板涂布法协同实验分析
将参与测量方法协同验证实验的8家实验室的数据，分别采用格拉布斯准则进行离群值检验，再将各实验室测量结果的平均值视为一组新的数据，进行正态分布分析，再对各家实验室测量结果的平均值采用格拉布斯准则进行离群值检验，经过检验并没有发现离群
值。按照式(5)～(9)计算，粘质沙雷氏菌营养琼脂平板涂布法协同实验结果见表2。表中的RSDi为第i个实验室所有样品测量结果的相对标准偏差。该方法的实验室内标准偏差sr为0.11×1010 CFU/mL，方法的重复性r为0.31×1010 CFU/mL，室内相对标准偏差RSDr为10.13%，实验室间标准偏差sR为0.16×1010 CFU/mL，方法的复现性R为0.45×1010 CFU/mL，室间相对标准偏差RSDR为14.95%，可以达到微生物定量测量方法精度<30%的要求[18]。
表2 粘质沙雷氏菌营养琼脂平板涂布法协同实验结果 ×1010 CFU/mL实验室编号实验
结
果
12345xisiRSDi/(%)11.101.121.061.121.201.120.054.4620.970.940.850.981.040.960.077.2930.940.900.980.901.020.950.055.2640.981.230.911.000.901.000.1313.0051.431.381.201.371.251.330.107.5261.351.271.071.330.981.200.1714.1770.920.910.930.851.060.930.088.6081.321.120.951.100.951.090.1513.76sr0.11r0.31RSDr/(%)10.13sR0.16R0.45RSDR/(%)14.95
3.3 营养琼脂平板涂布法不确定度评定结果
粘质沙雷氏菌营养琼脂平板涂布法测量的不确定度主要由A类不确定度和B类不确定度组成[19]。
3.3.1 A类相对标准不确定度urel(A)
A类不确定度分量uA是通过测量方法的标准偏差、测量次数及所要求的置信水平按
统计方法计算得出,结果见表3。采用营养琼脂平板涂布法对粘质沙雷氏菌样品重复测量9次。对测量数据采用格拉布斯准则进行离群值检验和正态性分析后，再用科克伦(Cochran)法检查各数据符合等精度要求，计算测量结果的算术平均值，采用式(11)计算：
(11)
式中：为平均值的标准偏差；为平均值； Xi为每次测量数据；c为测量次数。可得uA为0.02×1010 CFU/mL。
A类相对标准不确定度用式(12)计算：
(12)
可得 urel(A)为1.91%。
表3 粘质沙雷氏菌营养琼脂平板涂布法A类不确定度评定 ×1010 CFU/mL样品测量结果123456789XsXuAurel(A)/(%)Xi1.03 1.09 1.14 0.99 1.18 1.18 1.11 1.09 1.09 1.100.020.021.91
3.3.2 B类相对标准不确定度urel(B)
由式(1)或(2)以及对测量过程的分析，B类相对标准不确定度主要来源包括：a)移液器带来的相对标准不确定度urel(v)；b) 样品稀释因子带来的相对标准不确定度urel(d)。按照式(13)合成B类相对标准不确定度，结果见表4。
(13)
3.3.3 合成相对不确定度urel(char)和相对扩展不确定度Urel
考虑到两部分标准不确定度相互独立，测量方法的相对合成不确定度urel(char)用式(14)计算，相对扩展不确定度Urel用式(15)计算，结果见表4。
(14)
Urel=k·urel(char)
(15)
表4 营养琼脂平板涂布法不确定度评定结果
urel(A)urel(B)urel(char)Urel1.91%6.00%6.30%12.60%
4 结 语
本文针对营养琼脂平板涂布法进行了方法的室内验证和多家实验室协同验证，室内重复性相对标准偏差为8.93%，室间相对标准偏差为14.95%，均达到了微生物定量测量方法精度<30%的要求，说明粘质沙雷氏菌营养琼脂平板涂布法具有很好的重复性和复现性，其相对扩展不确定度为12.60%。该方法适用于粘质沙雷氏菌定量测量，对于人员防护装备防护性能评价具有重要意义。
致谢： 感谢中国检验检疫科学研究院、中国科学院武汉病毒研究所、北京市疾病预防控制中心、北京市朝阳区疾病预防控制中心、山东省医疗器械产品质量检验中心、北京市理化分析测试中心、北京出入境检验检疫局检验检疫技术中心对协同验证实验研究工作的支持。
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