生物发光共振能量转移

BRET 生物发光共振能量转移

技术简介：

生物发光共振能量转移（BRET）技术是近10年来出现的一种新的检测蛋白质-蛋白质相互作用的技术.它的最大优势是能在活细胞中实时进行检测，因此能够进行相互作用动力学的研究。在应用这个系统研究感兴趣的蛋白前，首先需要将Rluc或者EYFP 融合到每个蛋白或者他们的辅蛋白上。在细胞中，融合蛋白共表达，然后和荧光素酶和其底物腔肠素反应，当能量供体Rluc，能量受体EYFP 之间距离比较近的时候(10-100Å)，那么光将从Rluc(峰值480nm发射)传递到EYFP，形成它的激发，并且发射一个波长在530nm 的发射光，BRET 量化的程度以发射光530nm 和480nm 的比率表示。

实验流程

1、用于BRET的表达质粒构建；

2、融合蛋白表达检测；

3、BRET实验；

4、实验结果分析及提交实验报告

客户提供

1、目的基因cDNA（也可由我公司提供基因克隆）

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2、用于实验细胞（如果我公司细胞库有可不需提供）

公司提供

详细实验步骤、使用仪器、及结果分析等详细实验报告。

服务周期和价格

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荧光共振能量转移（FRET）

荧光共振能量转移-FRET（Fluorescent Resonance Energy Transfer）

指两个荧光发色基团在足够靠近时，当供体分子吸收一定频率的光子后被激发到更高的电子能态，在该电子回到基态前，通过偶极子相互作用，实现了能量向邻近的受体分子转移。

（1）FRET发生条件：

能量匹配：供体分子的发射光谱可以被受体分子吸收并产生荧光信号。供体分子的发射光谱应与受体分子的激发光谱必须有显著重叠（>30%）；

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作用距离：供体分子与受体分子的作用距离为1-10nm；

FRET效率公式：用于计算分子/基团间作用距离R

偶极-偶极作用：供体分子与受体分子作用时的向量必须满足一定条件。

（2）FRET的应用：

通过FRET技术可以获得有关两个蛋白分子之间相互作用的空间信息（作用距离、作用方向、能量传递效率）。常用于解决如下问题：蛋白分子的共定位；蛋白分子聚合体；转录机制；转化途径；分子运动；蛋白折叠等生物学问题。

（3）FRET常见的供体-受体荧光分子对：

荧光蛋白类：

染料类：

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FRET检测HIV附属蛋白与细胞膜CD分子相互作用

摘自：A Flow Cytometry-Based FRET Assay to Identify and Analyse Protein-Protein Interactions in Living Cells

Carina Banning, Jo¨ rg Votteler, et al.

图释：流式细胞仪FACSAria检测FRET信号。（a）活的293T细胞分别单独转入CFP、YFP、CFP/YFP 、CFP/YFP融合蛋白作为对照，确定最好的圈门方式为CFP/FRET。（b）293T细胞经过2%PFA处理后，YFP荧光强度出现明显下降。

筛选有相互作用的未知蛋白质的流程

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图释：流式细胞仪FACSAria进行FACS-FRET高通量筛选感兴趣蛋白相互作用的未知蛋白。（a）FACS-FRET筛选流程。（b）在活的293T细胞中转入Vpu-YFP作为诱饵，与等量的CFP融合蛋白（蛋白的cDNA库）相互作用36小时后，分选FERT+细胞。

FRET研究蛋白酶功能

摘自：Detection of Infective Poliovirus by a Simple, Rapid, and Sensitive Flow Cytometry Method Based on Fluorescence Resonance Energy Transfer Technology

Jason L. Cantera et al. Applied and environmental microbiology, Jan. 2010, p. 584-588

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图释：流式细胞仪 FACSAria检测脊髓灰质炎病毒（PV1）10倍感染BGM-PV细胞，8小时后上机检测。A~C病毒浓度分别为0.4~0.004，D为阴性对照。

双分子荧光互补技术BiFC（Bimolecular Fluorescence Complementation）

是将荧光报告蛋白按照规则分成没有荧光的两段，分别与诱饵蛋白和捕获蛋白融合，只有在诱饵蛋白和捕获蛋白发生相互作用的情况下，两段不完整的荧光报告蛋白才会形成完整的报告蛋白，发出荧光。活细胞收集后，在流式细胞仪中的检测是实时进行的，只要细胞中有荧光产生就会被捕捉到信号，因此，不论是亲和力较弱的结合还是暂时性的结合都不会被遗漏。

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双分子荧光互补技术原理示意图

(a) 诱饵和捕获蛋白分别携带CYFP和NYFP两段YFP荧光蛋白片段(b) 诱饵和捕获蛋白结合同时CYFP与NYFP形成YFP (c) 形成的YFP发出荧光

（1）BiFC检测的特点：

活细胞分析；

可以用于研究2种或2种以上的启动子调控之下的蛋白质相互作用；

具有很高的信噪比，弱蛋白相互作用也可以检测到（>7nm）。

（2）可用于BiFC的荧光蛋白：

GFP、BFP、CFP、YFP，生理条件可用的黄色的Venus和citrine，青色的cerulean；

红色系统：mRFP2Q66T、mCherry；

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Venus（EYFP的变体）是目前用于 BiFC分析最多的荧光蛋白，因为其荧光强且背景敏感度降低，是BiFC分析理想的荧光蛋白。

常见的用于双分子荧光互补技术的荧光蛋白

BiFC研究复合体中亚基间的相互作用

摘自：Detection and Characterization of Influenza A Virus PA-PB2 Interaction through a Bimolecular Fluorescence Complementation Assay

Joseph N. Hemerka, Dan Wang,et al. JOURNAL OF VIROLOGY, Apr. 2009, p. 3944-3955

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图释：流式细胞仪 FACSCalibur检测流感病毒复合体中亚基PA-PB2间的相互作用。（B）流式检测同时转入PA/PB2的COS-1细胞及单转入PA-VC的细胞的Venus荧光信号，显示转入24小时后的荧光强度。（C）萤火虫荧光蛋白酶显示，转入单或双质粒的细胞，萤火虫荧光蛋白酶活性一致。

BiFC研究信号传导通路中蛋白质间的相互作用

摘自：Characterization of the latent membrane protein 1 signaling complex of Epstein-Barr virus in the membrane of mammalian cells with bimolecular fluorescence complementation

Pooja Talaty, Amanda Emery, et al. Virology Journal 2011, 8:414

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图释：流式细胞仪FACSLSRII检测BiFC信号。LMP1-NYFP和LMP1-NYFP突变体分别与CYFP-TRAF2、CYFP-TRAF3转入细胞内，检测其相互作用。曲线蓝色部分为出现YFP的荧光阳性表达，表明LMP1与CYFP、CYFP均存在相互作用。

科普一下SCI

《科学引文索引》（Science Citation Index, 简称 SCI ）于1957 年由美国科学信息研究所（Institute for Scientific Information, 简称 ISI）在美国费城创办，是由美国科学信息研究所(ISI)1961年创办出版的引文数据库。SCI(科学引文索引 )、EI(工程索引 )、ISTP(科技会议录索引 ) 是世界著名的三大科技文献检索系统，是国际公认的进行科学统计与科学评价的主要检索工具。

1976 年，ISI 在 SCI 基础上引出期刊引用报告（journal citation report,JCR），提供了一套统计数据，展示科学期刊被引用情况、发表论文数量以及论文的平均被引用情况。在 JCR 中可以计算出每种期刊的影响因子（Impact Factor,IF）。影响因子的高低，在一定程度上可以反应一个期刊的影响力。

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（百度百科）

期刊的影响因子(Impact factor；IF)计算方式：

IF 2014 = (该杂志2012-2013年发表文章在2014年被引用的次数 / (该杂志2012-2013年发表文章的总数)

附件是最近两年的SCI期刊列表，2014年植物学类我红色标注了部分，不过期刊名都是缩写， 2013年的是全称期刊名。影响因子从高到低排列，大体代表了期刊的水平档次。

三大国际顶尖期刊CNS， 指CELL， NATURE， SCIENCE。

国际植物学专业期刊中，最好的研究论文期刊是Plant Cell （ IF2004=9.338），当然今年新创刊的NATURE PLANTS估计不久的将来会后来居上。最好的3本综述类期刊是Annual Review of Plant Biology，TRENDS IN PLANT SCIENCE和CURRENT OPINION IN PLANT BIOLOGY。

中国主办的期刊中，生物类最高的是CELL RESEARCH （CELL RES， IF2004=12.413），植物类最高的是Molecular Plant （MOL PLANT，IF2014=6.337）。

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