流式细胞分析仪(BD Calibur)
工作指南
暨南大学生物医药研究院：周玉英
2012年06月
第一章 流式细胞仪管理使用守则
1. 优先权原则：
本流式细胞分析分选仪器由暨南大学“211”重点学科“生物技术与生物工程 药物”学科组所用并使用，故在同一时间段内：
● 本校优先于外校使用； ● 学科组优先于外单位使用；
● 学科组内各单位使用优先权采用轮流制，相关单位优先权周可优先使用。
2. 专人使用原则：
● 流式细胞分析仪（Calibur）必须由已培训合格的的实验技术老师或学生严
格按照操作规程进行操作。
● 对于流式分选仪Influx，只能由培训合格的课题组负责老师操作，严禁学生
操作。
● 课题组负责老师或学生需定期接受培训，培训后合格后若两个月之内未使
用仪器，必须再次培训合格后才可使用流式仪。
3. 预约原则：
● 请与操作老师沟通后至少提前一天预约，预约时先提交有导师签字的预约表，再
由管理人员统一在网上预约。
● 不能按预约时间使用流式时，至少提前一天取消预约，否则将正常收费。 ● 不接受提前超过2周以上的预约。
4. 做好使用登记：
仪器使用完毕后，切记进行仪器使用记录登记，管理人员会核对是否与预约记 录的一致性。
5. 随时保持清洁：
● 进入流式房请更换拖鞋，离开流式房时，请将拖鞋放回鞋柜内。 ● 禁止随手乱放杂物（如一次性手套、塑胶手套，用完的样品等）。 ● 走前请带走制造的垃圾（包括细胞垃圾、耗材垃圾和生理盐水瓶等）。 ● 实验老师在课题组的优先权周实验老每周二、周五下午清洁流式房卫生，包括清
洁地面、桌面、倒掉除湿机水箱中的水。
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7. 刻录数据：
刻录数据只能用一次性的CD盘或DVD盘，严禁用自备U盘或可擦写光盘进行 数据刻录。
8. 安全使用原则：
● 必须严格按照培训时的流式使用规程操作仪器，严禁违规操作。
● 对有毒或者有污染的样品需提前对操作老师说明，严禁随处乱放有毒、有污
染的样品。
● 仪器使用完毕后，离开房间时，一定要锁好门窗，包括流式房门和725房间
的玻璃门。
6. 处罚措施：
请遵守上述规则，管理人员将对使用者进行监督和规范，对违规将进行登记并通 报，连续三次违规者，停用整个课题组使用权一周。
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第二章 流式细胞分析仪（Calibur）操作手册）
1. 仪器参数介绍
可检测四色，FL1通道用来检测FITC、AlexaFluor 488荧光信号，FL2可检测PE、PI荧光信号，FL3可检测7-AAD、Percp、Pe-Cy7、Percp-Cy5.5，FL4可以检测APC、Alexfluor 647荧光信号
2. 准备工作：
● 检查鞘液桶中鞘液是否足够，若鞘液不足，先将气阀位置扳到VENT状态，打
开鞘液桶桶盖，添加鞘液至鞘液桶体积的4/5，并确保旋紧桶盖，以防漏气造成无法提供上样压力。
● 确保废液桶中的废液清空，并加入2ml次氯酸钠溶液，旋紧桶盖。。 ● 开机之提前20min开空调，使流式房内温度预冷20min。
3. 开机
1）确保UPS一直处于运行状态。
2）打开稳压电源开关。
3）打开Calibur流式细胞仪的开机按钮（位于流式仪右侧的绿色按钮），此时 流式细胞仪功能控制钮的显示STANDBY。
4）电脑开机，输入密码，待仪器自检成功后（仪器自检时），方可使用。 注：必须流式细胞仪开机后，再对电脑开机，否则容易引起不能正常联机 5）将鞘液桶附近的气阀位置扳至RUN状态。
6）仪器预热10分钟，将流式管中盛有1ml超纯水，放置于进样针上，并将上样管支撑架移至中位，执行仪器PRIME功能键，使得功能键自动恢复到STANDBY状态，重复一次，以排除液路中的气泡。
4. 仪器设定或调整
1）进入CELLQuest软件，将出现一个“Untitled”窗口，将窗口最大化。 2）按下快捷键：to Cytometer）。 3） 按下快捷键：
+1，
+2，
+3，
+4，打开Detectors/Amps、Threshold、
+B，完成流式仪和软件之间的联机（或者从Acquire→Connect
Compensation、Status四个对话框，将对话框窗口依次排列至合适位置。
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4）建立模式文件，利用工具，根据样品特点设计模板。
A．例如对单染FITC的样品，可以先用（右下角标记2的工具）散点图工具设FSC-SSC双参数流式散点图，(FSC参数反应细胞的大小，SSC反应细胞内组成成分的复杂度)，再用直方图工具（右上角标记1的工具）设一个FL1-Counts流式直方图。
散点图 直方图
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B．对双染样品，如FITC-AnnexinV和PI双染的样品，设计FSC-SSC,FL1-SSC,FL2-SSC,FL1-FL2四个流式图。
5）激活流式图，出现
对话框，Plot Source选项中选择Acquisition→Analysis,并根据样品管的不同 选择X与Y轴参数。
（首先要明确样本的荧光染料是在哪个通道获取：如FITC/GFP荧光染料在FL1 通道检测，PI、PE 在FL2通道检测、Percp在FL3通道检测、APC在FL4通 道检测）
6）调取数据：激活想分析数据的目的流式图，
选中激活
7）建立储存数据的位置及文件名：
→
出现对
话框，点击位置1的change键，创建文件夹。
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点击第2个位置的Change键，出现文件名编辑窗口，输入文件名，在File Count中输入1。
8）：设置获取参数
在Acquisition$Storage窗口中，在红色标记1位置处输入获取的细胞数，标记2的位置处选择细胞获取的来源（如图中表示所有的细胞数获取到10000个时自动停止获取，如果2的位置选的是G1=R1，表示R1门内细胞获取10000个时自动停止）。
9）上样检测。
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● 在Detectors/Amps对话框中，逐个通道调节电压，使样品信号出现在建立的
流式图中。
● 工具中选取Region（区域），并在靶细胞周围设置合适的“门”。如在FSC-SSC
散点图中设置R门，将活细胞圈出。
● 设置每个流式图中的数据来源。
图2 图1
例如：图1中的数据取自所有细胞，则可以在图1对应的DOT Plot对话框中Gate后面选择No Gate，如果图2中的数据取自于所有活细胞（即图1中的R1
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群），则可以在图2对应的DOT Plot对话框中Gate后面选择G1=R1. 10）设置自动获取数据：
将电压、门、各流式图的数据来源设置完毕后，便可进行样品的检测和数据的保存。若使仪器自动保存数据，一定将获取参数设置好后，获取样品时将Setup前面的勾号去掉。
11）保存模板与参数：保存模板和参数后，下次做同一系列的实验即可直接调出流式图和参数。
模板保存：File→save as-选择数据保存的位置。
参数保存：
Cytometer→Save→选择保存的位置→Set→Done
5. 关机
1）在上样管中放置一管盛有3ml 10%NaClO溶液的流式管，将上样管支撑架扳至旁位冲洗外管1min，再将上样管支撑架扳至中位冲洗内管5min
2）如上述方法，换上一管盛有3ml超纯水的流式管，外管冲洗1min，内管冲洗5-10min。
注：在冲洗仪器时一定要注意Status的状态描述，以确保鞘液足够、废液未满。 3）将功能键由RUN键调换至Standby键，10min。 4）File→Quit 退出软件，CellQuest→Shutdown关机。
6）关掉流式细胞仪（右侧的绿色按钮）。将气阀扳至Vent位置，关掉稳压器、空调。
7）做好实验记录，带走垃圾，锁好门窗。。
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第三章Calibur仪器故障的排除及疑难解答
1. 遇到上样后没有细胞信号？
● 检查是否获取数据。
● 调大或者调大电压值，检查是否是阈值设置过高引起。 ● 检查细胞浓度是否过低，建议换一管样品上样试一试。
● 检查流式管与仪器上样针是否配套，建议换一个型号的流式管。
● 是否是上样针上方的Bal Seal磨损，此配件为易损配件，建议更换一个。 ● 检查样本管是否破损。
● 从System Status窗口中，检查仪器是否处于RUN状态，检查鞘液是否足够，
废液是否排空。
● 检查参数设置是否正确，检查调取的模板参数与将要检测的样品参数是否一
致。
● 检查联机是否正常，建议重启电脑和流式细胞仪是否解决。
● 检查液路中是否有气泡，在上样针上放1ml盛有超纯水的流式管PRIME两次。 ● 仪器管道赌赛
2. 仪器一直处于STANDBY状态？
● 检查鞘液桶是否漏气。
● 检查气阀是否扳倒RUN状态。 ● 检查样本管是否破损。
● 是否是上样针上方的Bal Seal磨损， ● 检查鞘液桶上的蓝色接口是否已连接好。
3. 仪器一直处于NOT Ready状态？
● 从System Status窗口中，检查仪器是否处于RUN状态，检查鞘液是否足够，
废液是否排空。
● 可能仪器处于预热状态，可等5min以后再行尝试。 ● 鞘液桶的液面检测器连接是否松动或未连接。
4. 仪器噪音过大？
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● 检查液路中是否有气泡，可以在上样针上放一管盛有超纯水的流式管PRIME
两次。
● 如果在实验过程中，鞘液曾吸空过，重新装满鞘液后，不要立即检测样品，
建议用盛有5ml的超纯水的上样管RUN 5-10min，尽可能地排除气泡。
5. 上样管中有鞘液反流？
● 检查上样针外管是否接触不良，可以将外管拧下，向上推动旋紧。 ● 更换上样针O圈
● 检查真空泵是否工作，建议关掉软件和流式细胞仪后重新启动仪器，如果重
启仪器后还是不工作，向管理员或者工程师寻求帮助。
6. 举例分析DNA分析时的常见错误及解决办法
问题 二倍体峰的位置突然改变或缓慢漂移 原因 液流系统中有气泡 鞘液和样本缓冲液弹性不一致 PI染色不够 PI孵育时间不够 染色不均一 荧光的直方图中碎片过多 样本坏死过多 细胞裂解不完全 鞘液不干净，杂质过多 峰比较宽 高速上样 液路中有气泡 荧光强度的减弱带来的峰的漂移 太多细胞 染色不饱和 进样针残留漂白液 重新制备样品 裂解完全 清洗系统，或者更换鞘液及更换鞘液滤器 低速上样代替高速上样 排除气泡 调整细胞浓度 摸索PI染色浓度至最佳 每次用漂白水清洗仪器后，用超纯水彻底清洗仪器 多PRIME几次 解决办法 冲洗管路，排除气泡 更换鞘液或者上样缓冲液使其一致 增加PI染色浓度或者孵育时间 样本活性差，过多坏死细胞 重新制备样品 7. 怎么样调节补偿？
● 先准备不染色的空白对照、各色的单染管及样本管，如果是用荧光抗体标记的
细胞还要准备同型对照管。
● 用空白对照调节电压，用单染管调节补偿
当单染FL1时，则调节FL2-%FL1的值，使的第四象限双阳性区的信号都回落到FL1阳性区。
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当单染FL2时，则调节FL1-%FL2的值，使的第四象限双阳性区的信号都回落到FL2阳性区。
当单染FL3时，则则调节FL4-%FL3的值，使的第四象限双阳性区的信号都回落到FL3阳性区。
当单染FL4时，则则调节FL3-%FL4的值，使的第四象限双阳性区的信号都回落到FL4阳性区。
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