红霉素生产及其有效组分转化的优化

论　著

文章编号:100128689(2005)0220065205

红霉素生产及其有效组分转化的优化

李啸　陈长华3　朱凤　李友元

(国家生物反应器重点实验室　华东理工大学生物工程学院,　上海200237)

　　摘要:　以红霉素生产菌红色链霉菌HB为研究对象,根据红霉素生物合成机理,以促进甲基化转化和强化基础代谢为主要手段,在利用摇瓶和50L罐发酵生产红霉素的过程中,在大约127h的时候,向发酵液中流加ATP、L2Met、MgSO4和柠檬酸,采用高效液相色谱仪(HPLC)对最终发酵液进行检测,红霉素的有效组分A的相对百分含量由原来的73%提高到88%以上,对最终发酵液进行生物测定,其生物效价亦得到明显提高,实现了红霉素发酵生产的优化。

关键词:　红霉素;　生物合成;　HPLC;　发酵;　优化中图分类号:TQ465.5　　　文献标识码:A

Optimizationofproducingerythromycinand

transformingitsefficientcomponents

LiXiao,　ChenChang2hua,　ZhuFeng　and　LiYou2yuan

(StateKeyLaboratoryofBioreactorEngineeringandDepartmentofBiologicalEngineering,

EastChinaUniversityofScienceandTechnology,　Shanghai200237).ABSTRACT　Tooptimizeerythromycinproductionandit′smajorcomponents

Saccharopolyspora

erythraeaHBwasusedasproducingstrain.ATP,L2methionine,MgSO4andcitricacidwereaddedtothe

brothat1272houroffermentationduringtheproductionoferythromycininflasksand50Lfermentor.ThefinalbrothwasdeterminedbyHPLC.TheresultsshowedthatrelativepercentageoferythromycinAhadbeenincreasedinitiallyfrom73%tomorethan88%.Biologicalpotencyincreasedsignificantly.Theprocessoferythromycinproductionhasbeenoptimized.

KEYWORDS　Erythromycin;　Biosynthesis;　HPLC;　Fermentation;　Optimization

　　红霉素(erythromycin,Er)是一类大环内酯类抗

生素,包括红霉素A(ErA)、红霉素B(ErB)、红霉素C(ErC)、红霉素D(ErD)、红霉素E(ErE)和红霉素F(ErF)。在临床上具有广泛用途的是红霉素A,它的抑菌活性最高,最初从一种放线菌——红色糖多孢菌(Saccharopolysporaerythraea)中分离出来[1]。红霉素生物合成的一般途径如Fig.1[2]。

从红霉素生物合成途径看,欲得到高产率及高含量的红霉素A,红霉素D是一个很关键的中间产物,该中间产物沿两条分支途径转化为红霉素A,其中途径󰂪为:红霉素D在eryK的作用下先羟基化,生成红

收稿日期:2004203212　　修回日期:2004205217

基金项目:生物工程上海市重点学科建设项目(2001年)。

霉素C,然后在eryG的作用下甲基化,生成红霉素A;途径󰂫为:红霉素D在eryG的作用下,先甲基化,生成红霉素B,然后在eryK的作用下羟基化,生成红霉素

[3～6]

,由红霉素B转化成红霉素A的通A。据文献报道

量小,红霉素B容易积累,而由红霉素C转化成红霉素

A的通量大,强化甲基化,红霉素C不易积累,能得到高百分含量的红霉素A,可使发酵液的生物效价显著提高。

1　材料与方法1.1　菌种

红色糖多孢菌HB(Saccharopolysporaerythraea,

作者简介:李啸,男,出生于1969年,在读硕士研究生,讲师。研究方向:发酵过程的调节与控制。　　3通讯作者

・66・

文中HB13、HB)由河南天方药业提供。HB59、HB68指用HB菌种自然分离所得的不同斜面编号。ATP、L2

黄豆饼粉、糊精met由上饶生物技术公司提供,淀粉、

由河南天方药业集团提供,其余原料均为工业纯市售产品。1.2　培养基

红霉素生产及其有效组分转化的优化　李啸等

1.3.1　生物效价测定　测量仪器ZY2300IV多功能

微生物自动测量分析仪;采用管碟法。1.3.2　化学效价测定

(1)标准曲线　分别吸取1000Λg󰃗m1的红霉素标准溶液014、018、112、116、210ml于分液漏斗中,加0135%K2CO3溶液稀释至20ml,再加入乙酸丁酯20ml,混合摇匀1min。取上层液10ml至另一个分液漏

种子培养基(%)　可溶性淀粉315,硫酸铵0175,

氯化钠015,蛋白胨015,糊精210,葡萄糖310,酵母粉210,碳酸钙018,硫酸镁0105,磷酸氢二钾0108,豆油012ml󰃗25ml。

发酵培养基(%)　可溶性淀粉310,硫酸铵015,糊精415,葡萄糖210,玉米浆011,碳酸钙019,豆油013ml󰃗25ml。

1.3　分析方法

斗,再加入10ml011mol󰃗取下层液5ml加LHCl,摇匀。入大试管,再加入5ml16mol󰃗LH2SO4,于50℃水浴中保温30min。取出后冷却,用蒸馏水作空白,在483nm处比色。以吸光度值为横坐标,浓度为纵坐标作图。根据曲线找出吸光值与浓度对应关系,求出标准曲线方程。

(2)方法　发酵液经过滤后,取1ml滤液用

Fig.1　　BiosynthesisoferythromycinA

中国抗生素杂志2005年2月第30卷第2期・67・

酸的混合液、ATP与MgSO4和柠檬酸的混合液(ATP、MgSO4和柠檬酸分别按照100ml加入0101、0102和0115g的量加入),最终发酵液的生物效价分别为6723、7128、7997Λg󰃗ml,而此时对照样品的生物效价为6342Λg󰃗ml,可见,在一定浓度范围内,ATP和其它几种因子同时流加,其生物效价有不同程度提高。

磷酸果糖激酶是糖酵解的主要调控酶,TCA循环有三个调控酶:柠檬酸合成酶、异柠檬酸脱氢酶、2酮Α戊二酸脱氢酶,TCA循环的速度决定于细胞对ATP的要求。高含量的ATP别构抑制磷酸果糖激酶的活性,从而减慢酵解及TCA循环速度[8]。低浓度的外源ATP一方面是62磷酸2果糖转化为1,62二磷酸果糖的底物,另一方面为糖代谢及生物合成所需关键酶的催化活动提供直接能源[9]。用50L罐发酵生产红霉素时,通过在线检测得出葡萄糖的消耗速率与发酵时间的关系(Fig.2),平均耗糖速率为5415ml󰃗h。在发酵早期,耗糖速率大大高于5415ml󰃗h,糖代谢旺盛,酵解速度及TCA循环速度很快,菌本身能获得足够的ATP,此时加入外源ATP将会对关键调控酶起抑制作用,既不利于菌的正常生理活动的维持,也不利于次级代谢物红霉素的生产。在摇瓶发酵后期(大约127h左右),糖耗速率达到低谷,补充低浓度的外源ATP,在其它因子交互作用下,可延缓菌的衰老,强化初级代谢,有利于红霉素的生成。单纯加入ATP效果不理想(Fig.3)。2.1.2　MgSO4的影响　在利用HB68菌发酵生产红霉素的过程中(127h时),向每100ml发酵液中流加量分别为0、01005、0102、0105、011和0115g的MgSO4,得最终发酵液的生物效价分别为6142、6235、6458、6557、6873和6985Λg󰃗进一步研究发现,在利用ml。

0135%的K2CO3稀释100倍,取稀释液20ml于分液漏

斗,然后加入20ml乙酸丁酯,其它步骤同上,测出的吸

光度值代入公式:

化学效价=(9105804+233.3576×A483)×1001.3.3　红霉素组分百分含量测定

设备　Waters公司(717plusAutosampler,2487DualΚabsorbancedetector,1525BinaryHPLCpump)。

HPLC法　采用反相柱C18柱RP2C18(250mm×416mm,5Λm),以乙腈(色谱纯)∶015%磷酸二氢铵(A.R)缓冲液=35∶65为流动相,流速为1ml󰃗min,在215nm处检测,柱温为35℃,定量分析样品中红霉素A、B、C。

1.4　摇瓶培养方法1.4.1　种子培养　将种子液在34℃的摇床间培养46h,摇床转速为220r󰃗min。1.4.2　发酵培养

(1)摇瓶培养　将接入种子液的发酵液在34℃的

摇床间培养,摇床转速为220r󰃗min培养时间为148h。

(2)50L罐培养　采用国家生化工程技术研究中心(上海)研制的全自动控制发酵罐,在线控制培养185h。2　结果与讨论

由于次级代谢物是由初级代谢物的中间体衍生的,即初级代谢能为次级代谢提供比较重要的前体化合物,次级代谢物通常是由初级代谢中间体经修饰后形成的,生物甲基化就是这种修饰作用之一,红霉素的生物合成需要甲基化,甲硫氨酸是红霉素生物合成甲基的主要给体[7]。在发酵后期,从菌丝自溶比较迅速这种现象推测,减弱的初级代谢不能为菌生长提供足够的维持能量,亦不能为次级代谢提供足够的前体,因此,有必要对初级代谢进行强化,而初级代谢与ATP、

2+

柠檬酸的浓度相关[8]。综合考虑,选择以下四因Mg、

子进行研究。

2.1　选定因子对发酵液生物效价的影响

2.1.1　ATP的影响　在利用HB68菌发酵生产红霉

素的过程中,在127h时,向每100ml发酵液中添加量分别为0、0101、0102、0105、011和012g的ATP,得最终发酵液的生物效价分别为6296、6132、6027、5573、5432和4583Λg󰃗ml,由此可见,单纯的不同浓度的外源ATP流加入发酵液,最终发酵液的生物效价有不同程

　　Fig.2　　Relatedcurveoftheglucoseconsumption

ratewithtime

度的降低。同时做了一些交互作用实验,在利用HB13菌发酵生产红霉素的过程中,同样在127h时,向发酵液中分别加入ATP和MgSO4的混合液、ATP和柠檬

・68・红霉素生产及其有效组分转化的优化　李啸等

　　　1:Biologicalpotencyoftheblankfermentationbroth

2:Biologicalpotencyoftheconditionalfermentationbroth

　　　Fig.4　　Relatedcurveofthefermentationbroth′s

concentrationwithtime

　Fig.3　　TheinfluenceofATPontitreofthefermentationbrothHB13菌发酵生产红霉素的过程中(127h时),向发酵

葡萄糖,127h时左右糖耗速率达到低谷,当加入混合物X后,耗糖速率显著加快,135h左右达到第二次耗糖顶峰,酵解和TCA循环得到强化,生成大量中间体,菌浓迅速增加,然后在一个新而高的起点进行抗生素的生产,发酵液的生物效价得到显著提高(Tab.1)。2.1.4　L2蛋氨酸的影响　在利用HB68菌发酵生产红霉素的过程中(127h时),向每100ml发酵液中流加量分别为0、01006、0101、0102、0106和011g󰃗100ml的L2蛋氨酸(L2met),其对应最终发酵液的生物效价分别为6289、6343、6512、6687、5895和5639Λg󰃗ml,可见,最终发酵液的生物效价随流加的L2蛋氨酸浓度的变化而变化,当浓度小于0102%时,生物效价随浓度增大而增大,当浓度较大时,生物效价反而降低。进一步研究发现,在利用HB13菌发酵生产红霉素的过程中(127h时),向发酵液中加入L2100ml)Met(加入量为0102g󰃗和柠檬酸(加入量为0115g󰃗100ml)的混合物,其生物效价为7119Λg󰃗ml,而对照样品的生物效价仅为6342Λg󰃗ml,交互作用明显。

红霉素的甲基可由L2甲硫氨酸衍生[5]。在高能化合物如ATP的协同作用下,一定浓度的L2Met可为ErD提供足够的甲基,在激活的eryG酶的催化作用下使其充分甲基化,使ErD更大程度地转化成红霉素有效成分ErA,这样可有效提高发酵液的生物效价。2.2　实验设计

2.2.1　中心组合实验设计(CentralCompositeDesign)　由以上实验结果知,四因子交互作用复杂,　　Tab.1　　Assignedconcentrationofeachingredient

athighandlowlevelsusingthePlackett2Burmandesign(T2)

Independentvariable

(g󰃗100ml)Codedlevels　-1

X1

ATP0.010.1　

X2L2Met0.010.15

X3

MgSO40.050.2　

X4

Citricacid0.020.2　

液中分别加入MgSO4和柠檬酸的混合液、MgSO4和ATP的混合液、MgSO4与ATP和柠檬酸的混合液(ATP、MgSO4和柠檬酸分别按照0101、0115和0115g󰃗100ml的量加入),最终发酵液的生物效价分别为7128、6723和7997Λg󰃗ml,正协同效应更显著。一定浓度的Mg2+迅速激活糖代谢及红霉素生物合成所需的关键酶,如己糖激酶・磷酸果糖激酶、丙酮酸激酶、柠檬酸合成酶[8]和红霉素生物合成中的几种关键酶如聚酮合成酶(PKS)[4]、红霉素羟基化酶(eryK)[3]和红霉素甲基化酶(eryG)[10]。在发酵后期,菌自溶速率增加,一定浓度的Mg2+加入发酵液,可激活一些关键酶,有利于红霉素生物合成。

2.1.3　柠檬酸的影响　在利用HB68菌发酵生产红霉素的过程中(127h时),向发酵液100ml中流加量分别为0、0101、0105、011、0115和012g的柠檬酸时,最终发酵液的生物效价分别为6399、6687、6729、6033、5734和5469Λg󰃗ml。可见,单纯流加柠檬酸,最终发酵液的生物效价有不同程度的变化,甚至有降低现象。进一步研究发现,在一定浓度范围内,柠檬酸和其它几种因子一起流加入发酵液时,则表现为正协同效应,且效果显著。

高浓度的柠檬酸对TCA循环的调控酶有抑制作用,低浓度的柠檬酸是TCA循环所必需的[8]。如需得到高浓度的抗生素有效成分ErA,务必保证生产期高浓度菌体的活性。在低浓度ATP、MgSO4的协同作用下,一定浓度的柠檬酸使发酵后期处于衰弱的TCA循环迅速强化,为菌体及次级代谢提供能量和中间体。在50L罐发酵生产红霉素的研究中(127h时)加入混合物X后,菌浓在6h内达到第二次顶峰(Fig.4)。在50L罐发酵生产红霉素的过程中,流加浓度为45%的

　　　　　　　1

中国抗生素杂志2005年2月第30卷第2期・69・

　　(1)生物效价的线性回归方程:

生物效价=+6431.18345-2668.95692X1

-2716.57143X2+3207.76644X3-5988.88889X4-50572.5623X1X2+43342.85714X1X3

+63670.06803X1X4

-24019.27438X3X4+36084.1269X2X4-54705.21542X1X3X4-5.82698E+005X1X2X4

2R=0.9620,说明该方程可靠。效价预测值为

欲达到最佳效果,拟定以下实验设计并展开了实验(HB59菌)。采用Design2Expert610110Tril(www.statease.com)软件设计,该软件是以各种数理统计方法为基础,集实验设计、数据分析和模型优化为一体的实验设计工具,适用于生物反应体系中多因子交互作用的显著因子的选择和设立的模型是否具有显著性及是否可行的判定(Tab.2)。

2.2.2　软件分析　应用Design2Expert6.0.10Tril软件对实验数据进行处理,结果见Tab.3。　　Tab.2　　　ExperimentaldesignandresultsofT2

No.

a,b

X1-----11111　1　1　0　1　1　1　1　0-1　0-1-1-1-1　0X2----1111　1　1-1　0-1　1　1　1　0-1　0　1　1　1　1　0X3-1-1　1　1-1　1　1　0-1-1　1-1　0　1　0　1　1　1　1　0X4

1234567891011121314151617181920　1

-1　1-1　1-1　1　0　1-1　1　1　0-1　0-1　1-1　1　0Titre(Λg󰃗ml)597265078028647356766326562663477070583853884313641551866415619256866374701764148249Λg󰃗ml。

(2)F=5138,模型对反应体系的影响显著;X1、X2X4、X3X4、X1X2X3和X1X3X4对响应值(生物效价)的

影响显著;“为非显著,设立的模型是可行Lackoffit”的(Tab.3)。

(3)根据微生物发酵的特点并结合生产实际进行优化分析,得以下最优实验结果:01005g󰃗100ml的0118g󰃗100ml的MgSO4、0102g󰃗100ml的L2ATP、Met

和0116g󰃗100ml的柠檬酸为最优组合,设四者的混合物为X。

2.2.3　验证实验　在HB68菌发酵生产红霉素的过程中(127h时),向发酵液中同时加入01005g󰃗100ml的ATP、0118g󰃗100ml的MgSO4、0102g󰃗100ml的L2

100ml的柠檬酸,用管蝶法对最终发酵Met和0116g󰃗

液进行生物测定,得到条件样品的平均生物效价为8851Λg󰃗ml,对照样品的生物效价仅为6658Λg󰃗ml。2.3　HPLC分析

对上述验证实验所得最终发酵液进行HPLC分析所得数据如Tab.4所示。ErA的相对百分含量由72109%(对照样品)提高至88169%(条件样品)。

100ml的ATP、0118g󰃗100ml的X:0.005g󰃗

0102g󰃗100ml的L2100ml的柠MgSO4、Met和0116g󰃗

檬酸(Tab.5)。3　结论

　　a:Experimentswereruninarandomorder;

b:Experimentswererepeatedthreetimesforaccuracy.Titreoftheblanksampleis6218Λg󰃗ml。

　　Tab.3

SourceModelABDCDABCACDLackoffit

　　Analylsisofvariancetable

FValue5.3816.5722.787.5311.076.830.32

Prob>F0.080　0.00220.00080.02070.00770.02590.8582

Significantsignificantsignificantsignificantsignificantsignificantsignificantnotsignificant

本实验以中间体的甲基化转化为突破口,同时考

虑发酵后期基础代谢衰弱,活菌体量迅速下降,生物合成的一些关键酶需充分激活的特点,在127h时流加混

　　Tab.4

Sample　　E󰂪　E󰂫　

RT(min)

ErA7.2867.064

ErB11.65011.284

ErC5.0774.957

　　DataofHPLC

Area(V3sec)

ErA3638968161

ErB71135836

ErC69792857

ErA72.0988.69

%AreaErB14.097.59

ErC13.823.72

(下转第102页)

・102・中国抗生素杂志2005年2月第30卷第2期

方法鉴定11株耐EMB分离株和46例结核病痰标本中的结核分枝杆菌,既简单又快速,只需2～3d。PCR2RFLP是分析特定部位痰标本中结核分枝杆菌存在

这两种方法联用只需3～4d,embB306位密码子突变。

既可从临床分离株或痰标本中快速鉴定结核分枝杆菌和部分结核分枝杆菌耐EMB基因型,弥补传统方法不足,指导临床治疗。参考文献[1]SreevatsanS,StockbauerKE,XiPan,etal.Ethambutol

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41(8):1677

[2]吴雪琼,张俊仙,刘佳文,等.PCR2SSCP分支杆菌菌种初

敏感株Nla󰂬酶切后;　5:EMB敏感株Nla󰂬酶切前

图2　　结核分枝杆菌embB基因部分PCR2RFLP结果

步鉴定方法的建立及其应用[J].中国现代医学杂志,

2000,10(7):25

(上接第69页)

.5　　TheinfluenceofmixtureXonthebiologicalTab

potencyofthefermentationbroth

No.EM220031118EM220031129

Time

(h)170181188

EM220031211

175185

XX

Addingmixture

参考文献

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erythraea2catalyzed

Saccharo2

Biologicalpotency

(Λg󰃗ml)

66528616773578058317

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Saccharopolysporaerythraeagenerequiredforthefinal

合物X,即01005g󰃗100ml的ATP、0118g󰃗100ml的

0102g󰃗100ml的L2100ml的柠MgSO4、Met和0116g󰃗檬酸,使处于衰弱的TCA循环迅速强化,延缓菌的衰

老,保持菌的生产活性,生成足够的中间体,菌浓回升,从而使微生物反应体系在一个高的起点进行次级代谢。在利用HB68菌发酵生产红霉素时,最终发酵液的生物效价由对照样品的6658Λg󰃗ml提高至条件样品的8851Λg󰃗ml,有效组分A的含量也由对照样品的72109%提高至条件样品的88169%,在一定程度上实

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