(12)发明专利申请
(10)申请公布号(10)申请公布号 CN 103931493 A(43)申请公布日 2014.07.23
(21)申请号 201410023655.0(22)申请日 2014.01.17(66)本国优先权数据
201310019386.6 2013.01.18 CN
(71)申请人成都中医药大学
地址611137 四川省成都市温江区柳台大道
1166号(72)发明人李敏 于素玲 吴发明 卿艳
杨小多 周睿 卢道会(74)专利代理机构成都高远知识产权代理事务
所(普通合伙) 51222
代理人李高峡 张娟(51)Int.Cl.
A01H 4/00(2006.01)
权利要求书1页 说明书8页 附图1页权利要求书1页 说明书8页 附图1页
(54)发明名称
一种半夏一步成苗的组织培养方法以及新的半夏培养基(57)摘要
本发明公开了一种半夏一步成苗的组织培养方法，它包括如下步骤：（1）取半夏块茎、珠芽、叶片和/或叶柄作为外植体，消毒，接种于培养基中，在温度为20～30℃、光照强度为1000～2000lx、光照时间5～15h/d的条件下培养；所述培养基以MS培养基为基础培养基，添加有终浓度为30～50g/L的蔗糖、1.0～2.5mg/L的6-BA和0.1～0.2mg/L的NAA；（2）培养至苗高3～8cm时，即可。本发明还公开了一种用于半夏组织培养的培养基。本发明半夏的组织培养方法可一步成苗，成苗率高，培育的半夏苗健壮，长势旺，操作简便，成本低廉。CN 103931493 ACN 103931493 A
权 利 要 求 书
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1.一种半夏一步成苗的组织培养方法，其特征在于：它包括如下步骤：（1）取半夏块茎、珠芽、叶片和/或叶柄作为外植体，消毒，接种于培养基中，在温度为20～30℃、光照强度为1000～2000lx、光照时间5～15h/d的条件下培养；所述培养基以MS培养基为基础培养基，添加有终浓度为30～50g/L的蔗糖、1.0～2.5mg/L的6-BA和0.1～0.2mg/L的NAA；
（2）培养至苗高3～8cm，即可。
2.根据权利要求1所述的组织培养方法，其特征在于：步骤（1）中，所述消毒的方法是：用浓度为60～90%的酒精浸泡外植体50～60s，然后用无菌水冲洗1～2次，然后再用浓度为0.05～0.15%的升汞溶液浸泡8～10min，最后用无菌水冲洗3～4次，即可。
3.根据权利要求2所述的组织培养方法，其特征在于：所述酒精的浓度为75%；所述升汞溶液的浓度是0.1%。
4.根据权利要求1所述的组织培养方法，其特征在于：步骤（1）中，所述温度为24～26℃，光照强度为1500lx，光照时间为10h/d。
5.根据权利要求1所述的组织培养方法，其特征在于：步骤（1）所述培养基中，蔗糖的终浓度为30g/L，6-BA的终浓度为2.0mg/L，NAA的终浓度为0.1mg/L。
6.根据权利要求1所述的组织培养方法，其特征在于：步骤（1）中，以叶柄作为外植体时，所述培养基中还添加有终浓度为0.3～1.0g/L复合添加剂，所述复合添加剂由如下重量百分比的成分组成：NH4NO330％、P2O528％、K2O28％和FeSO414%。
7.根据权利要求6所述的组织培养方法，其特征在于：所述复合添加剂的终浓度为0.3g/L。
8.一种用于半夏组织培养的培养基，其特征在于：它是MS培养基为基础培养基，添加有终浓度为30～50g/L的蔗糖、1.0～2.5mg/L的6-BA和0.1～0.2mg/L的NAA。
9.根据权利要求8所述的培养基，其特征在于：所述培养基中，蔗糖的终浓度为30g/L，6-BA的终浓度为2.0mg/L，NAA的终浓度为0.1mg/L。
10.根据权利要求8所述的培养基，其特征在于：所述培养基中还添加有终浓度为0.3～1.0g/L的复合添加剂，所述复合添加剂由如下重量百分比的成分组成：NH4NO330％、P2O528％、K2O28％和FeSO414%；
优选地，所述培养基中，复合添加剂的终浓度为0.3g/L。
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CN 103931493 A
说 明 书
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一种半夏一步成苗的组织培养方法以及新的半夏培养基
发明内容
[0001]
本发明属于栽培领域，涉及一种半夏一步成苗的组织培养方法及半夏组织培养
基。
背景技术
[0002] 半夏(Pinellia ternata（Thunb.）Breit.)是天南星科多年生草本植物,以块茎入药,具燥湿化痰,降逆止呕,消痞散结等功效,为一种重要的传统中药材。半夏生于山地、农田、溪边或林下；分布于我国大部分地区。作为运用广泛的大宗中药材，随着市场用量的有增无减，半夏野生资源逐年锐减，已不能满足日益增长的市场需求，人工栽培势在必行。目前人工栽培采用小块茎育苗,用种量大,成本高，且存在叶型变异，子块茎多、种质退化等问题。利用组织培养技术，由外植体直接诱导分化成苗，作为种苗栽种，可提高繁殖率，防止种质退化；缩短其生长周期，有效降低栽种成本。
[0003] 国内外不少学者对半夏组织培养进行了探索性研究，但是现有的研究大多集中于半夏外植体如何有效诱导成为愈伤组织，关于愈伤组织后期成苗以及半夏外植体一步成苗的研究较少。发明内容
[0004]
本发明的目的是提供一种半夏一步成苗的组织培养方法及一种新的半夏组织培
养基。
本发明半夏一步成苗的组织培养方法，它包括如下步骤：
[0006] （1）取半夏块茎、珠芽、叶片和/或叶柄作为外植体，消毒，接种于培养基中，在温度为20～30℃、光照强度为1000～2000lx、光照时间5～15h/d的条件下培养；所述培养基以MS培养基为基础培养基，添加有终浓度为30～50g/L的蔗糖、1.0～2.5mg/L的6-BA和0.1～0.2mg/L的NAA；[0007] （2）培养至苗高3～8cm时，即可。[0008] 6-BA：6-苄氨基嘌呤，属于细胞分裂素。[0009] NAA：萘乙酸，属于植物激素生长素。[0010] 步骤（1）中，所述消毒的方法是：用浓度为60～90%的酒精浸泡外植体50～60s，然后用无菌水冲洗1～2次，然后再用浓度为0.05～0.15%的升汞溶液浸泡8～10min，最后用无菌水冲洗3～4次，即可。优选地，所述酒精的浓度为75%；所述升汞溶液的浓度是0.1%（w/v）。[0011] 酒精，即乙醇；升汞，即氯化汞。[0012] 步骤（1）中，所述温度为24～26℃，光照强度为1500lx，光照时间为10h/d。
[0005]
步骤（1）所述培养基中，蔗糖的终浓度为30g/L，6-BA的终浓度为2.0mg/L，NAA的终浓度为0.1mg/L。[0014] 步骤（1）中，以叶柄作为外植体时，所述培养基中还添加有终浓度为0.3～1.0g/L
[0013]
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CN 103931493 A
说 明 书
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复合添加剂，所述复合添加剂由如下重量百分比的成分组成：NH4NO330％、P2O528％、K2O28％和FeSO414%。优选地，所述复合添加剂的终浓度为0.3g/L。[0015] 本发明用于半夏组织培养的培养基，它是MS培养基为基础培养基，添加有终浓度为30～50g/L的蔗糖、1.0～2.5mg/L的6-BA和0.1～0.2mg/L的NAA。优选地，所述培养基中，蔗糖的终浓度为30g/L，6-BA的终浓度为2.0mg/L，NAA的终浓度为0.1mg/L。[0016] 其中，所述培养基中还添加有终浓度为0.3～1.0g/L的复合添加剂，所述复合添加剂由如下重量百分比的成分组成：NH4NO330％、P2O528％、K2O28％和FeSO414%。优选地，述培养基中，复合添加剂的终浓度为0.3g/L。
[0017] 本发明半夏组织培养方法可以一步成苗，成苗率高，最高可以达到97%，培养得到的半夏苗健壮、长势好，培养时间短，培育成本低廉。本发明培养基可以有效促进半夏外植体的生长和分化，其中，外植体为叶柄时，本发明添加了复合添加剂的培养基可以很好地促进其生长分化，缩短培养时间，降低成本，应用前景良好。[0018] 显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。[0019] 以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。附图说明
[0020]
图1升汞处理不同时间对半夏外植体的影响结果图。
具体实施方式
实施例1本发明半夏一步成苗的组织培养方法
[0022] （1）取半夏块茎作为外植体，用75%酒精浸泡50～60s；转入无菌培养瓶中，用无菌水冲洗1～2次；倒掉无菌水，加入浓度为0.1%的升汞液，浸泡杀菌10min；再用无菌蒸馏水冲洗3～4次，以彻底去除外植体表面升汞残液，置无菌瓶中；[0023] （2）将步骤（1）处理后的半夏外植体接种于培养基中培养，培养条件为：温度24℃，光照强度1500x，光照时间10h/d；所述培养基以MS培养基为基础培养基，添加有终浓度为30g/L的蔗糖、2.0mg/L的6-BA和0.1mg/L的NAA。[0024] （3）培养至苗高3～8cm，即可。
[0025] 实施例2本发明半夏一步成苗的组织培养方法[0026] （1）取半夏叶柄作为外植体，用75%酒精浸泡50～60s；转入无菌培养瓶中，用无菌水冲洗1～2次；倒掉无菌水，加入浓度为0.1%的升汞液，浸泡杀菌8min；再用无菌蒸馏水冲洗3～4次，以彻底去除外植体表面升汞残液，置无菌瓶中；[0027] （2）将步骤（1）处理后的半夏外植体接种于培养基中培养，培养条件为：温度26℃，光照强度1500x，光照时间10h/d；所述培养基以MS培养基为基础培养基，添加有终浓度为30g/L的蔗糖、2.0mg/L的6-BA、0.1mg/L的NAA和0.3g/L的复合添加剂，其中，复合添加剂由如下重量百分比的成分组成：30％NH4NO3、28％P2O5、28％K2O和14%FeSO4。[0028] （3）培养至苗高3～8cm，即可。
[0021]
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说 明 书
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实施例3本发明半夏一步成苗的组织培养方法
[0030] （1）取半夏珠芽作为外植体，用60%酒精浸泡50～60s；转入无菌培养瓶中，用无菌水冲洗1～2次；倒掉无菌水，加入浓度为0.05%的升汞液，浸泡杀菌10min；再用无菌蒸馏水冲洗3～4次，以彻底去除外植体表面升汞残液，置无菌瓶中；[0031] （2）将步骤（1）处理后的半夏外植体接种于培养基中培养，培养条件为：温度20℃，光照强度1000x，光照时间5h/d；所述培养基以MS培养基为基础培养基，添加有终浓度为50g/L的蔗糖、2.5mg/L的6-BA和0.2mg/L的NAA。[0032] （3）培养至苗高3～8cm，即可。
[0033] 实施例4本发明半夏一步成苗的组织培养方法[0034] （1）取半夏叶片作为外植体，用90%酒精浸泡50～60s；转入无菌培养瓶中，用无菌水冲洗1～2次；倒掉无菌水，加入浓度为0.15%的升汞液，浸泡杀菌8min；再用无菌蒸馏水冲洗3～4次，以彻底去除外植体表面升汞残液，置无菌瓶中；[0035] （2）将步骤（1）处理后的半夏外植体接种于培养基中培养，培养条件为：温度30℃，光照强度2000x，光照时间15h/d；所述培养基以MS培养基为基础培养基，添加有终浓度为40g/L的蔗糖、1.0mg/L的6-BA和0.1mg/LNAA。[0036] （3）培养至苗高3～8cm，即可。[0037] 实施例5外植体消毒灭菌方法的优选[0038] 1、实验方法[0039] （1）外植体的选取:晴天，大田选取生长健壮、无病虫害的植株作为外植体来源的母株，取其块茎、珠芽、幼嫩叶片、幼嫩叶柄，泥后用清水洗净,剥去块茎外皮,再用含少量洗洁净的自来水冲洗干净。[0040] （2）外植体的消毒:[0041] 分别取半夏块茎、珠芽、叶片和叶柄，用75%酒精浸泡50～60s；转入无菌培养瓶中，用无菌水冲洗1～2次；倒掉无菌水，加入浓度为0.1%的升汞液，分别浸泡杀菌10min、8min和5min；再用无菌蒸馏水冲洗3～4次，以彻底去除外植体表面升汞残液，置无菌瓶中，即可。[0042] （3）然后将消毒后的外植体接种在预先配置好的培养基上,接种后5天后分别观察污染情况，10天后观察成活率（以是否出现芽点为标准，若有芽点，则计为存活，若无芽点，则计为死亡）。[0043] ①培养基：采用MS为基础培养基，添加琼脂粉6g/L，蔗糖30g/L，pH值为5.8。配置好的培养基分装入培养瓶中，置于121℃高压灭菌锅内灭菌20分钟。[0044] ②接种：在超净工作台内将已经消毒的外植体从无菌培养瓶中取出，置无菌滤纸上,每个块茎纵切为4块，珠芽纵切为2-4块,叶柄切段1-1.2cm，叶片切成1cm×1cm的方块，然后，然后，将切割好块茎、珠芽、叶片插入培养基中，将切割好的叶柄水平放置在培养基上，置培养室中培养。[0045] ③培养条件：培养温度为25士1℃，光照时间为10h，光照强度15001X。[0046] 2、实验结果[0047] 观察发现，随着升汞消毒时间的延长，不同外植体的污染率降低，但是，出苗后，苗的死亡率升高，特别是消毒时间大于8min时，死亡率明显升高。
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CN 103931493 A[0048]
说 明 书
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存活率如表1和图1所示：
[0049] 表1不同消毒处理对半夏外植体的影响
[0050]
由表1和图1可以看出，随着升汞消毒时间的延长，叶柄和叶片的成活率先升高后
降低，消毒时间为8min时，成活率在84%以上，块茎和株芽的成活率则不断升高，在消毒时间为8～10min时，成活率在90%以上。[0052] 实验结果说明，采用0.1%的升汞溶液浸泡8～10min，既可以对外植体进行有效消毒灭菌，又不会破坏外植体组织，成活率高。
[0053] 实施例6培养基中激素种类和用量的筛选实验[0054] 1、实验方法[0055] ①培养基：采用MS为基础培养基，添加琼脂粉6g/L，蔗糖30g/L，激素种类和浓度见表2，pH值为5.8。配置好的培养基分装入培养瓶中，置于121℃高压灭菌锅内灭菌20分钟。
[0056] ②接种、培养：在超净工作台内将已经消毒的外植体（采用实施例5中，升汞消毒时间为8min的消毒方式）从无菌培养瓶中取出，置无菌滤纸上,每个块茎纵切为4块，珠芽纵切为2-4块,叶柄切段1-1.2cm，叶片切成1cm×1cm的方块，然后，将切割好块茎、珠芽、叶片插入培养基中，将切割好的叶柄水平放置在培养基上，置培养室中培养，培养至苗高为3～8cm时，即可。[0057] ③培养条件：培养温度为25士1℃，光照时间为10h，光照强度15001X。[0058] 2、实验结果
[0051]
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说 明 书
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实验结果如表2所示：
[0060] 表2不同种类和浓度的激素对半夏外分化成苗的影响结果
[0061]
[0062]
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说 明 书
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由表2可以看出，当激素为2,4-D与6-BA，或者2,4-D与KT的组合时，成苗率不
高；而采用本发明1.0～2.5mg/L6-BA与0.1～0.2mg/L NAA的组合，成苗率较高，其中，以2.0mg/L6-BA与0.1mg/L NAA的组合的成苗率最高。[0064] 实验结果说明，以MS为基础培养基，在添加30g/L蔗糖的基础上，添加1.0～2.5mg/L6-BA和0.1～0.2mg/L NAA，可以促进外植体的生长和分化，大大提高成苗率，其中，以添加2.0mg/L6-BA和0.1mg/L NAA为最佳选择。
[0065] 实施例7在培养基中添加复合添加剂对外植体成苗的影响实验[0066] 1、实验方法[0067] （1）复合添加剂对不同外植体的影响[0068] ①培养基：在实施例6优选的培养基中（MS为基础培养基，添加琼脂粉6g/L，蔗糖30g/L，6-BA2.0mg/L以及NAA0.1mg/L），加入浓度为0.3g/L的复合添加剂。复合添加剂的组成：30％NH4NO3，28％P2O5，28％K2O，14%硫酸亚铁。[0069] ②接种、培育：在超净工作台内将已经消毒的外植体（采用实施例5中，升汞消毒时间为8min的消毒方式）从无菌培养瓶中取出，置无菌滤纸上,每个块茎纵切为4块，叶柄切段1-1.2cm，叶片切成1cm×1cm的方块，然后，将切割好块茎、珠芽、叶片插入培养基中，将切割好的叶柄水平放置在培养基上，置培养室中培养，培养至苗高为3～8cm时，即可。
[0063]
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③培养条件：培养温度为25士1℃，光照时间为10h，光照强度15001X。
[0071] 统计外植体成苗天数。[0072] （2）不同浓度复合添加剂对叶柄成苗的影响[0073] 培养基中，复合添加剂的浓度分别为0.3g/L、0.7g/L、1.0g/L、2.0g/L；以叶柄为外植体，接种50天观察生长状况，接种方法和培养条件同步骤（1）。[0074] 2、实验结果[0075] （1）复合添加剂对不同外植体的影响[0076] 实验结果如表3所示：
[0077] 表3复合添加剂对不同外植体成苗时间的影响
[0078]
由表3可以看出，当外植体为块茎或叶片时，复合添加剂对会抑制其生长分化，导
致组织疏松，呈黄白色，成苗率不高；然而，当外植体为叶柄时，添加复合添加剂却可以明显促进其生长分化，成苗率高，培育的苗健壮，还可以大大缩短成苗时间，有效降低育苗成本。
[0079]
[0080] （2）不同浓度复合添加剂对叶柄的影响
实验结果如表4所示：
[0082] 表4不同浓度复合添加剂对叶柄诱导分化的影响
[0081]
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CN 103931493 A
说 明 书
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[0083]
由表4可知，复合添加剂的浓度为0.3～1.0g/L时，可以有效促进叶柄的生长分
化，当浓度为2.0g/L时，反而会抑制其生长分化。[0085] 实验结果说明，在培养基中添加终浓度为0.3～1.0g/L的复合添加剂，可以有效促进叶柄的生长分化，大大缩短成苗时间，降低生产成本。[0086] 综上，本发明半夏组织培养方法可以一步成苗，成苗率高，最高可以达到97%，培养得到的半夏苗健壮、长势好，培养时间短，培育成本低廉。本发明培养基可以有效促进半夏外植体的生长和分化，其中，外植体为叶柄时，本发明添加了复合添加剂的培养基可以很好地促进其生长分化，缩短培养时间，降低成本，应用前景良好。
[0084]
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说 明 书 附 图
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图1
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