Percoll分层液

Percoll，淋巴细胞分离，密度梯度分离，GE公司 一、原理

Percoll是一种包有乙烯吡咯烷酮的硅胶颗粒。渗透压很低(<20mosm/kg H2O), 粘度也很小，可形成高达1.3g/ml密度，采用预先形成的密度梯度时可在低离心力(200～1000g)于数分至数十分钟内达到满意的细胞分离结果。由于Percoll扩散常数低，所形成的梯度十分稳定。此外，Percoll不穿透生物膜，对细胞无毒害，因此广泛用于分离细胞、亚细胞成分、细菌及病毒，还可将受损细胞及其碎片与完好的活细胞分离。

二、操作方法及注意事项

1. 不同浓度(密度)Percoll溶液的制备: 先用9份Percoll与1份8.5% NaCl或1.5MPBS混合达到生理性渗透压，然后用生理溶液(0.85% NaCl或0.15M PBS)稀释到所需浓度。

Percoll浓度(%) 70 60 50 40 30 20 比重g/ml 1.090 1.077 1.067 1.056 1.043 1.031

2. 不连续密度梯度Percoll层的制备: 先将试管壁用牛血清湿润，除去多余血清，这种预处理可使逐层叠加的Percoll液平稳沿管壁流下，使形成满意的界面。在制备过程中一般用长针头注射器从高密度向低密度逐层放置，有时相邻两层Percoll比重相差不大时，可将Percoll液放入注射器中，小针头斜面紧贴管壁，任其自然慢慢流下。

3. 装样：样品体积和细胞浓度根据不同细胞而异，一般加样体积不宜过大，细胞浓度也不可过高，否则会影响细胞的分离和回收。

4. 离心：一般采用离心力为400g，时间20～25min。由于多层Percoll之间密度差别不大，因此离心机加速、降速时要慢，要平稳。

5. 取样：当所要分离的细胞绝大部分在两层的界面时，可逐层去除Percoll液后收集界面部位的细胞；有时大部分细胞位于Percoll层中，则需要逐层收集。收获含有Percoll液的细胞经2次洗涤后可供培养或检测用。

三、分离纯化细胞举例

1. 富含NK活性大颗粒淋巴细胞(LGL)的纯化:按顺序由下向上逐层加50%、47.5%、45%、42.5%和40%五种不同密度的Percoll,如用10ml试管(或塑料管)分离,每层Percoll约1.2～1.5ml，初步从外周血中分离的PBMC细胞1×10悬于1ml培基中，按要求装样、离心和取样。一般富含NK杀伤活性的LGL细胞位于42.5%与45%Percoll界面以及上下二层的Percoll液中。

2. 纯化淋巴母细胞和除去死细胞：分别叠加50%和30%Percoll液。收取经PHA(或其它抗原、有丝分裂原)刺激PBMC,或含有较高比例异型的PBMC(如肾综合征出血热患者)，按要求装样、离心和取样。位于管底的淋巴细胞为小淋巴细胞；两层Percoll之间为淋巴母细胞，纯度和回收率在80%以上，位于30%Percoll表面是死细胞。收获淋巴母细胞可进行表型、结构以及功能的研究。

四、人不同血细胞的漂浮密度

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细 胞 红细胞 嗜酸性粒细胞 嗜中性粒细胞 单核细胞 血小板 漂浮密度 1.09-1.11 1.09-1.095 1.080-1.085 1.050-1.066 1.030-1.060 细 胞 淋巴细胞 B淋巴细胞 T淋巴细胞 淋巴母细胞 自然杀伤细胞 漂浮密度 1.052-1.077 1.062-1.075 1.065-1.077 1.065-1.077 1.050-1.070 五、percoll分离液相关问题

percoll连续梯度怎么配制？比如15%---75%的percoll连续梯度?根据实验需要的具体密度梯度决定的，根据要分离的不同细胞种类，数量等等，也有用原液配的。也有用80%配的，不一定的。另外，percoll本身是低渗透压的，要用高渗透压溶液配成生理等渗透压溶液，然后使用，不然，细胞容易破裂。一般是先用9份Percoll与1份8.5% NaCl或1.5MPBS混合达到生理性渗透压，然后用生理溶液(0.85% NaCl或0.15M PBS)稀释到所需浓度。即取Percoll原液与10倍浓缩的PBS以9:1的比例混合，此时溶液为100%Percoll，比重是1.127，毫克分子渗透压浓度为290mOsmol/kg

Percoll浓度(%) 70 60 50 40 30 20 比重g/ml 1.090 1.077 1.067 1.056 1.043 1.031

Percoll是经过聚乙烯吡咯烷酮 (polyvinyl pyrolidone, PVP) 处理的硅胶颗粒混悬液，对细胞无毒性和刺激性。Percoll混悬液的硅胶颗粒大小不一，经过高速离心后，可形成一个连续密度梯度，将比重不同的细胞分离纯化。

将1份10XPBS与9份Percoll贮存液混合，制成等渗Percoll悬液，此悬液被认为是100%Percoll悬液，其密度为1.1294g/ml。用PBS或细胞培养液稀释100%Percoll而获得所需密度的Percoll分离液用于相应细胞的分离。若分离淋巴细胞应使用1.0777g/ml，配制时用稀释液稀释60%即可。

取比重1.077的Percoll分离液X ml与离心管中，将等倍稀释的抗凝血1/2 X ml 小心叠加在分离液上，经水平离心（1500rpm）后，便得四个细胞层，从而分离出淋巴细胞。表层为死细胞残片和血小板，底层为粒细胞和红细胞，中间有两层，上层富含单核细胞，下层富含淋巴细胞。

该法是纯化淋巴细胞和单核细胞的一种较好的方法，淋巴细胞纯度高达98%，单核细胞纯度可达78%。 因为Percoll具有渗透性低、不穿透细胞、粘度低、密度高和无毒害等优点，与目前常用的密度梯度离心介质，包括蔗糖（Sucrose）、血清白蛋白（Serum albumin, ALB）、聚蔗糖（Ficoll）、氯化铯（CsCl）等相比，是目前较理想的介质。Percoll密度梯度离心已被多次成功地用于动物细胞及其细胞器的分离，纯化了包括人血液细胞、骨髓细胞、红血球细胞、白血球细胞、淋巴细胞、肝细胞等在内的十余种动物细胞。这一技术也开始用于用于分离和纯化植物原生质体、核、叶绿体和线粒体。