血红蛋白测定方法

消光系数法和标准曲线法任选其一测定血红蛋白。

１.6.1.1 光系数法

１.6.1.1.1 原理

血红蛋白(haemoglobin，Hb)被铁氰化钾氧化后生成高铁血红蛋白，再生氰离子结合形成氰化高铁血红蛋白（红色），氰化高铁血红蛋白（红色）极为稳定，在540nm波长下，毫克分子消光系数为44，据此，用分光光度法测其光密度，运用消光系数作血红蛋白的定量测定。

１.6.1.1.2 仪器

721型或其它型号的分光光度比色计。

10微升量吸管。

１.6.1.1.3 试剂

称取碳酸氢纳（ ）140毫克\\铁氰化钾200毫克、氰化钾50毫克，用水溶解并稀释到1000毫升。贮存於棕色试剂瓶内，在暗处或冰箱（+4℃）保存，至少可稳定数月到一年。

１.6.1.1.4 实验步骤

１.6.1.1.4.1 试剂2.5毫升於5毫升带盖试管中，加入10微升血液，混匀后，放置15分钟。

１.6.1.1.4.2 选用0.5厘米光径比色杯，于540nm波长下，以试剂调零点，将所得样品管之光密度乘以73.6，即为血红蛋白之浓度（克%）。

计算公式如下：

Ct=待测的血红蛋白（克%）浓度。

D 540 = 氰化高铁血红蛋白在540nm波长下测出的光密度。

HICN

251=测 定时血液的稀释倍数（血10微升加入试剂2.5毫升中）

44=氰化高铁血红蛋白的毫克分子消光系数

0.5=比色杯的光径

10000=将（毫克/升）换算成（克%）的数字

１.6.1.1.5 注意事项

１.6.1.1.5.1 试剂不要放在聚乙烯瓶内，以免因氰离子与其反应而使试剂作用降低。

１.6.1.1.5.2 仪器因mM消光系数法完全依靠仪器的吸光度来计算,故此法要求所用的仪器性能要符合要求(如仪器的波长准确与否,以及灵敏度及线性等),否则将直接影响测定的结果。

1.6.1.1.5.3仪器在使用前最好以WHO规定的氰化高铁血红蛋白参考液校正后再使用。参考液最好选用ICSH9国际血液学标准化委员会）确定的由RIV（莅国立公共卫生研究院）制定的氰化高铁血红蛋白参考液或上海医学化验所制血的氰化高铁血红蛋白标准液。

1.6.1.2 标准曲线法

1.6.1.2.1 原理

血红蛋白（hemoglobin,Hb）在铁氰化钾和氰化钾的作用下生成极为稳定的氰化高铁血红蛋白（红色），其颜色深浅与血红蛋白的含量成正比。用分光光度计在540nm波长下，测定血红蛋白标准品和参考标准物质的吸光度，制成标准曲线，测得待测样品的吸光度后查标准曲线即可各Hb的浓度。

1.6.1.2.2 仪器

10ul血色素吸管（或定量毛细管）

5毫升或10毫升带盖试管

721、722或723型等型号的分光光度计结和力。从中可计算出未饱和铁量及血清运铁蛋白饱和度。

1.6.1.2.3 试剂

称取碳酸氢纳（ ）140、铁氰化钾２００mg、氰化钾50mg，用蒸馏水溶解并稀释到1000ml贮存于棕色试剂瓶内，保存于４℃冰箱可稳定至一年。

1.6.1.2.４实验步骤

吸取2.5ml试剂于５ml带盖试管中，用10ul血色素吸管（或定量毛细管）取大鼠尾血或静脉血10ul放置于已放入试剂的试管中；混匀放置15分钟。

选取0.5cm光径比色杯，于540nm波长下，以试剂调节仪器零点，测定各样品管的吸光度，同时测定血红蛋白标准和参考标准物质的吸光度，绘制血红蛋白的标准曲线。查标准曲线可求得待测样品和参考标准物质得血红蛋白含量g/dl或g/l，计算参考物质的回收率。

1.6.1.2.5 注意事项

1.6.1.2.5.1 不要将试剂放在聚乙烯瓶内，以免因氰离子与其反应而使试剂作用降低。

1.6.1.2.5.2 不宜直接使用消光系数方法计算血经红蛋白的含量，因为仪器的波长准确与否仪器的灵敏度和线性等因素均直接影响测定结果。

1.6.1.2.5.3 每次测定时，在不同间隔反复测定血红蛋白标准液和参考标准物质（低、中、高３个浓度）。

1.6.1.3 数据处理及结果判定

实验数据可用方差分析，但需按方差分析的程度先进行方差齐性检验，方差齐，计算Ｆ值，Ｆ值<Ｆ0.05，结论：各级均数间差异无显著性；Ｆ值≥Ｆ0.05，Ｐ≤0.05，用多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计；对非正态或方差不齐的数据进行适当的变量转换，待满足正态或方差齐要求后，用转换后的数据进行统计；若变量转换后仍未达到正态或方差齐的目的，改用秩和检验进行统计。

结果判定

受试样品组与对照组比较，血红蛋白浓度升高经统计处理差异有显著性，且受试样品组前后升高幅度达到10g/l以上，判定该受试样品有升高血红蛋白作用，动物实验结果阳性。

1.6.2 血清运铁蛋白饱和度测定

1.6.2.1 原理

血清中加入过量的铁，使血清中的运铁蛋白全部与铁结合，达到饱和，过剩的铁用碳酸镁吸附除去，然后按测血清铁的方法，测定总结合的铁量，即为总铁结合力。从中可计算出未饱和铁量及血清运铁蛋白饱和度。

1.6.2.2 试剂

1.6.2.2.1 铁标准液

1.6.2.2.1.1 络天青Ｂ铵盐法

1.6.2.2.1.1.1 贮备液：（3mmoll）取1.176g硫酸亚铁铵（6分子结晶水）置蒸馏水中，加50ml浓硝酸混匀反应10分钟，用蒸馏水定容至1000ml。

1.6.2.2.1.1.2 工作液：（3mmoll）取10ml贮备液，用蒸馏水定容至1000ml。

1.6.2.2.1.2 原子吸收分光光度法

1.6.2.2.1.2.1 贮备液：取1.0000g纯金属铁，用盐酸或硝酸溶解后，用0.1Ｎ盐酸稀释到1000ml，移入聚乙烯塑料瓶内，存放４℃冰箱，1ml含1mg铁。

1.6.2.2.1.2.２工作液：取10贮备液，用0.1Ｎ盐酸定容至100ml，１ml=10ug铁。

1.6.2.2.2 轻质碳酸镁（AR）（或碱式碱式碳酸镁）其质量应符合要求。

1.6.2.2.3实验步骤

1.6.2.2.3.1 应用络天青Ｂ铵盐方法测总铁结合量 取0.1ml血清放入尖底离心管，加60umol/l铁标准液0.1ml充分混合，室温放置15分钟。再加４～５mg轻质碳酸镁，放置15分钟，混合3～4次。然后以3000转／分离心5～分钟，取上清液0.1ml按络天青Ｂ铵盐比色法测血清铁的步骤进行操作，计算。

1.6.2.2.3.2 原子吸收分光光度法测总铁结合量 取1.0ml血清，加铁标准液（20ug/ml）0.5ml，充分混合，放置15分钟。加150mg轻质碳酸镁，充分混匀1分钟以上，放置30分钟，混合3～4次。离心10分钟，取上清液1ml按原子吸收分光光度法测血清铁的操作步骤进行消化，测定，计算。

1.6.2.4 计算

1.6.2.4.1血清总铁结合量厅用（ug/100ml）表示。

1.6.2.4.2未饱和铁量＝血清总铁结合量－血清铁。

1.6.2.5 数据处理及结果判定

实验数据可用方差分析，但需按方差分析的程度先进行方差齐性检验，方差齐，计算Ｆ值，Ｆ值<Ｆ0.05，结论：各组均数间差异无显著性，F值≥F0.05，P≤0.05，用多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计；对非正态或方差不齐的数据进行适当的变量转换，待满足正态或方差齐要求后，用转换后的数据进行统计；若变量转换后仍未达到正态或方差齐的目的，改用秩和检验进行统计。

结果判定

受试样品组与对照组比较，血清运铁蛋白饱和度升高经统计处理差异有显著性，即可判定该受试样品有升高血清运铁蛋白饱和度的作用，动物实验结果阳性。

氰化高铁血红蛋白测定法

[目的与原理]

应用氰化高铁血红蛋白（HiCN）法，测定不同鱼类血红蛋白含量。

血红蛋白(Hb)被高铁氰化钾[K3Fe(CN)6]氧化为高铁血红蛋白（Hi），Hi与氰离子结合

成氰化高铁血红蛋白（HiCN），它在540nm有一吸收峰，通过测定其光密度而得血红蛋白含量。

[实验对象]

鲤、鲫或草鱼。

[试剂与器材]

分光光度计，试管若干，移液管（5ml），吸血管（20u1），注射器，凹瓷盘，试管，试管架，蒸馏水，75%酒精，棉球，纱布，抗凝剂（1%肝素钠溶液或10%草酸钾溶液）。

氰化高铁血红蛋白稀释试剂：称取高铁氰化钾[K3Fe(CN)6]200mg、氰化钾（KCN）50mg、无水磷酸二氢钾140mg，Triton X-100 1.0ml，用蒸馏水溶解并稀释至1L。此试剂应呈透明、淡黄色，pH在7.0～7.4之间，以蒸馏水作空白，在540nm比色，读数也是0。此溶液应放置棕色试剂瓶中，塞紧后保存于冰箱中（但不宜冻结），至少可稳定数月。如发现试剂变绿、浑浊则不能使用。

[实验步骤]

1、在一试管中准确加入HiCN稀释试剂5.0ml，作为测定管。

2、用血红蛋白吸管准确吸取全血20u1，擦去管端血迹，置于试剂中，冲洗3次，混和。

3、将混合液放置3分钟以后，倒入光径1cm比色皿，用分光光度计在540nm进行

比色。以蒸馏水或HiCN稀释试剂作空白管，校正光密度到0点，读取测定管光密度读数。

4、计算：

血红蛋白（g/L）= 测定管光密度×（64458/44000）×251

= 测定管光密度 × 367.7

式中：

（1）64458 是目前国际公认的血红蛋白分子量。

（2）44000 是国际血液学标准化委员会公布的血红蛋白摩尔吸光度。

（3）251是稀释倍数。

[方法评估]

HiCN法操作简便，试剂单一，除SHb外所有血红蛋白均可迅速转化为HiCN，显色快且稳定，可以根据吸光度直接计算结果，因此被列为国际血红蛋白测定的参考方法，也是我国推荐的首选方法，但其试剂中氰化钾为剧毒药品，须妥善保存、处理。另外，高球蛋白血症和白细胞明显增高的标本可导致反应液浑浊而影响结果。

[应用意义]

同改良沙利氏法。

[注意事项]

1、血红蛋白测定方法很多。但无论采用何种方法，都必须以HiCN法为标准，绘制标准曲线。

2、HiCN稀释液不能贮存在塑料瓶中，否则会使CNˉ丢失，测定结果偏低。HiCN稀释液应贮存在棕色有塞玻璃瓶中，4℃冰箱保存一般可用数月，但不能在0℃以下保存，因为结冰可引起高铁氰化钾还原，使溶液褪色失效。

3、氰化钾是剧毒品，配制稀释液时要按剧毒品管理程序操作。配制好的HiCN稀释液中因氰化钾含量低，又有高铁氰化钾存在，毒性不是很大。若进入体内，高铁氰化钾氧化血红蛋白，生成高铁血红蛋白。后者结合CNˉ，起到一定的解毒作用，但仍应妥善保管。测定后的废液不能与酸性溶液混合，因为氰化钾遇酸可产生剧毒的氰氢酸气体。为防止氰化钾污染环境，比色测定后的废液集中于广口瓶中。应注意废液处理，可用除毒液除毒。

除毒方法为：取硫酸亚铁（FeSO4·7H2O）二份加NaOH一份，在研钵中研细，配成100g/L的悬液。每1000ml废液加上述除毒液5ml，放置3小时，不时搅拌，使剧毒的氰化钾成为无毒的亚铁氰化钾。