(12)发明专利申请
(10)申请公布号 CN 107574197 A(43)申请公布日 2018.01.12
(21)申请号 201710567428.8(22)申请日 2017.07.12
(71)申请人 青岛农业大学
地址 266109 山东省青岛市城阳区长城路
700号(72)发明人 吕海涛 杜玲 段科 单虎
秦志华 (74)专利代理机构 北京冠和权律师事务所
11399
代理人 李建华(51)Int.Cl.
C12P 19/04(2006.01)C12P 19/12(2006.01)C12P 19/14(2006.01)G01N 21/31(2006.01)
权利要求书1页 说明书6页 附图4页
(54)发明名称
一种浒苔多糖的生物降解方法(57)摘要
本发明具体提供了一种利用生物酶完全降解浒苔多糖的方法：将粗多糖配制成5mg/mL，在一定的pH和温度下反应一定的时间，将酶解后的酶解液煮沸5min，离心除去酶，将上清液用碱调节pH至中性，然后将溶液用截留分子量为500的透析袋透析24h，除去无机盐，透析液进行冷冻干燥得酶降解浒苔多糖，其分子量为1.9645×103Da，浒苔多糖降解率达到100％。所得到的低分子量的寡糖基本化学结构与浒苔多糖相差不大，但其体外抗氧化活性明显增强。
CN 107574197 ACN 107574197 A
权 利 要 求 书
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1.酶法降解浒苔多糖的方法，包括如下步骤：称取0.05g浒苔粗多糖加入10mL溶剂，配成5mg/mL的粗糖水溶液，所述溶剂为降解酶和缓冲液的混合液，其中以α-淀粉酶10-50U/mL作为降解酶，pH为5.0-7.0，浓度为0.1mol/L乙酸-乙酸钠缓冲液作为缓冲液，在30-90℃反应1-6h，将酶解后的酶解液煮沸5min，离心除去酶得到上清液。
2.根据权利1所述的降解浒苔多糖的方法，其特征是：上述方法中反应时间4h，反应pH6.5、反应温度70℃、反应料液比1:2000。
3.根据权利1或2所述的降解浒苔多糖的方法，其特征是：将反应后的上清液用碱调节pH至中性，然后将溶液用截留分子量为500的透析袋透析24h，除去无机盐，透析液进行冷冻干燥得淀粉酶降解浒苔多糖。
4.根据权利1-3任一项所述的降解浒苔多糖的方法，其特征是：浒苔多糖降解率达到100％，降解所得的寡糖分子量为1.9645×103Da。
5.一种清除羟自由基能力的测试方法，采用Fenton反应体系测定权利要求1-4任一项所述降解浒苔多糖的方法降解后的浒苔多糖对·OH的清除作用：分别取1mL 9mmol/L FeSO4、1mL 9mmol/L水杨酸乙醇溶液、1mL 8.8mmol/L H2O2，加入上述配制好的样品各1mL，混匀，37℃水浴30min，以蒸馏水作空白，在510nm处测定各溶液的吸光度；试验设3个组：样品组A1、对照组A0、本底组A2；清除率计算方法：
式中：A0为不加样品溶液的吸光度；A1为加入样品溶液的吸光度；A2为不加显色剂时样品本身的吸光度。
6.根据权利要求5所述的测试方法，其特征是：降解浒苔多糖对·OH的清除率平均值为69.52％。
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CN 107574197 A
说 明 书
一种浒苔多糖的生物降解方法
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技术领域
[0001]本发明涉及海洋生物技术领域，具体涉及一种利用酶完全降解浒苔多糖的方法。背景技术
[0002]我国藻类资源丰富，种类繁多，研究藻类和开发藻类资源已成为科学前沿。浒苔是一种重要的经济海藻，在东部沿海一带分布较广，资源丰富。多糖是浒苔的重要营养物质之一。据报道浒苔多糖有多种活性，如有增强免疫、抗肿瘤、降血压、降血脂、降血糖、抗突变、免疫调节、抗衰老等，这些生理活性说明浒苔应用前景广阔。但浒苔多糖分子量大，粘度较大，很难穿越细胞膜，无法发挥作用。若将其降解为适当分子量的多糖会提高其生物活性。目前国内外对于浒苔多糖的提取、纯化的研究已经做了部分工作，而对于浒苔多糖的降解并没有十分有效的方法将其完全降解成小分子量的寡糖。[0003]酶法降解浒苔多糖，作用条件比较温和，与化学降解法和物理降解法相比有很多优点，如无污染、不需要添加化学试剂、克服了化学降解多糖所产生的分子量分布宽、均一性差、产物复杂的特点等。而且酶解法降解产物容易分离纯化，可以得到溶解性好、生物活性高、易吸收的低分子量多糖。发明内容
[0004]本发明的目的是提供一种利用生物酶完全降解浒苔多糖得到小分子量寡糖的方法。为实现上述目标，本法发明所采用的技术方案为：
[0005]称取0.05g浒苔粗多糖加入10mL溶剂(降解酶和缓冲溶液)，配成5mg/mL的粗多糖水溶液。以ɑ-淀粉酶10-50U/mL作为降解酶，在pH为5～7，0.1mol/L乙酸-乙酸钠缓冲液中，30-90℃反应1-6h，将酶解后的酶解液煮沸5min，离心除去酶，将上清液用碱调节pH至中性，然后将溶液用截留分子量为500的透析袋透析24h，除去无机盐，透析液进行冷冻干燥得淀粉酶降解浒苔多糖。
[0006]酶法降解浒苔多糖的方法，包括如下步骤：称取0.05g浒苔粗多糖加入10mL溶剂，配成5mg/mL的粗多糖水溶液。以α-淀粉酶10-50U/mL作为降解酶，在pH为5.0-7.0，0.1mol/L乙酸-乙酸钠缓冲液中，30-90℃反应1-6h，将酶解后的酶解液煮沸5min，离心除去酶得到上清液。
[0007]各因素影响程度依次为反应时间＞反应pH＞反应温度＞料液比，最佳降解方案为：反应时间4h，反应pH6.5、反应温度70℃、反应料液比1:2000。[0008]将反应后的上清液用碱调节pH至中性，然后将溶液用截留分子量为500的透析袋透析24h，除去无机盐，透析液进行冷冻干燥得淀粉酶降解浒苔多糖。[0009]浒苔多糖降解率达到100％，降解所得的寡糖分子量为1.9645×103Da。[0010]一种清除羟自由基能力的测试方法，采用Fenton反应体系测定上述降解浒苔多糖的方法降解后的浒苔多糖对·OH的清除作用：分别取1mL 9mmol/L FeSO4、1mL 9mmol/L水杨酸乙醇溶液、1mL 8.8mmol/L H2O2，加入上述配制好的样品各1mL，混匀，37℃水浴30min，
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说 明 书
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以蒸馏水作空白，在510nm处测定各溶液的吸光度；试验设3个组：样品组A1、对照组A0、本底组A2；清除率计算方法：
[0011]
式中：A0为不加样品溶液的吸光度；A1为加入样品溶液的吸光度；A2为不加显色剂时样品本身的吸光度。
[0013]降解浒苔多糖对·OH的清除率平均值为69.52％。[0014]本发明的优点：
[0015]1.与传统降解方法相比，淀粉酶降解多糖作用条件温和，反应时间短，无副产物。[0016]2.本发明采用淀粉酶降解浒苔多糖，浒苔多糖降解率达到100％，得到分子量为1.9645×103Da的寡糖。
[0017]3.降解后浒苔多糖的体外抗氧化活性明显高于未降解多糖。
附图说明
[0018]图1为实施例1-1到1-5所得到的不同反应pH降解浒苔多糖对·OH的清除作用。[0019]图2为实施例2-1到2-5所得到的不同反应时间降解浒苔多糖对·OH的清除作用。[0020]图3为实施例3-1到3-5所得到的不同反应温度降解浒苔多糖对·OH的清除作用。[0021]图4为实施例4-1到4-6所得到的不同料液比降解浒苔多糖对·OH的清除作用。[0022]图5为不同浓度的降解前后浒苔多糖及Vc对·OH清除效果的比较。[0023]图6为最佳降解方法得到的降解浒苔多糖的高效凝胶色谱图。[0024]注：编号017，双峰图谱为样品浒苔多糖。编号018，单峰图谱为样品淀粉酶降解浒苔多糖。
[0025]图7为降解前后的浒苔多糖红外色谱图。
具体实施方式
[0026]下面结合附图和具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的保护范围。此外应理解，在阅读本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明做各种改动或修改，这些等价形式同样属于本申请所附权利要求书所限定的范围。
[0027]称取0.05g浒苔粗多糖加入10mL溶剂(降解酶和缓冲溶液)，配成5mg/mL的粗多糖水溶液。以α-淀粉酶10-50U/ml作为降解酶，在pH为5.0-7.0的0.1mol/L乙酸-乙酸钠缓冲液中，30-90℃反应1-6h，将酶解后的酶解液煮沸5min，离心除去酶，将上清液用碱调节pH至中性，定容至同一体积，以清除羟自由基的能力为指标比较抗氧化活性较好的淀粉酶降解多糖的方法。
[0028]下列实施例中所使用的浒苔多糖是经过脱色，热水提取，除蛋白，浓缩，醇沉，过滤之后的浒苔粗多糖。此方法具体参照《酸法降解浒苔多糖及其清除羟自由基活性研究》。[0029]实验前先称取100mg淀粉酶(酶活为100000U/g)用相应pH的乙酸-乙酸钠缓冲液定容至100mL配制成100U/mL的淀粉酶溶液待用。
[0030]实施例中的对羟自由基的清除作用采用Fenton反应体系测定降解后浒苔多糖
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[0012]
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对·OH的清除作用：分别取1mL 9mmol/L FeSO4、1mL 9mmol/L水杨酸乙醇溶液、1mL 8.8mmol/L H2O2，加入上述配制好的样品各1mL，混匀，37℃水浴30min，以蒸馏水作空白，在510nm处测定各溶液的吸光度。试验设3个组：样品组A1、对照组A0、本底组A2。清除率计算方法：
[0031]
式中：A0为不加样品溶液的吸光度；A1为加入样品溶液的吸光度；A2为不加显色剂
时样品本身的吸光度。[0033]实施例1-1
[0034]称取0.05g浒苔粗多糖加入5mL pH为5.0乙酸-乙酸钠缓冲液淀粉酶溶液，加入5mL100U/mL的淀粉酶溶液，反应时间2h，反应温度50℃，料液比1:2000(酶浓度50U/mL)，将酶解后的酶解液煮沸5min，离心除去酶，将上清液用碱调节pH至中性，定容25mL，采用Fenton反应体系测定降解后浒苔多糖对·OH的清除作用。[0035]将实施例1-1中的反应pH由5.0分别改为5.5、6.0、6.5、7.0，其余同实施例1-1，得到实施例1-2、1-3、1-4、1-5。
[0036]将实施例1-1到1-5所得到的降解浒苔多糖对·OH的清除作用作图得图1。得到淀粉酶最佳反应pH为6.0。[0037]实施例2-1
[0038]精确称取0.05g浒苔粗多糖，加入5mL pH为6.0乙酸-乙酸钠缓冲液，加入5mL100U/mL的淀粉酶溶液，反应时间1h，反应温度50℃，料液比1:2000(酶浓度50U/mL)，将酶解后的酶解液煮沸5min，离心除去酶，将上清液用碱调节pH至中性，定容20mL，采用Fenton反应体系测定降解后浒苔多糖对·OH的清除作用。
[0039]将实施例2-1中的反应时间由1h分别改为2、3、4、6h，其余同实施例1-1，得到实施例2-2、2-3、2-4、2-5。
[0040]将实施例2-1到2-5所得到的降解浒苔多糖对·OH的清除作用作图得图2。得到淀粉酶最佳反应时间为2h。[0041]实施例3-1
[0042]称取0.05g浒苔粗多糖，加入5mL pH为6.0的乙酸-乙酸钠缓冲液，加入5mL100U/mL的淀粉酶溶液，反应时间2h，反应温度30℃，料液比1:2000(酶浓度50U/mL)，将酶解后的酶解液煮沸5min，离心除去酶，将上清液用碱调节pH至中性，定容20mL，采用Fenton反应体系测定降解后浒苔多糖对·OH的清除作用。
[0043]将实施例3-1中的反应温度由30℃分别改为50、60、70、90℃，其余同实施例3-1，得到实施例3-2、3-3、3-4、3-5。
[0044]将实施例3-1到3-5所得到的降解浒苔多糖对·OH的清除作用作图得图3。得到淀粉酶最佳反应温度为60℃。[0045]实施例4-1
[0046]称取0.05g浒苔粗多糖，加入9mL pH为6.0乙酸-乙酸钠缓冲液，加入1mL100U/mL的淀粉酶溶液，反应时间2h，反应温度60℃，料液比1:10000(酶浓度10U/mL)，将酶解后的酶解液煮沸5min，离心除去酶，将上清液用碱调节pH至中性，定容20mL，采用Fenton反应体系测
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定降解后浒苔多糖对·OH的清除作用。
[0047]将实施例4-1中的料液比1:10000(10U/mL)分别改为1:5000(20U/mL，反应体系为8mL pH为6.0的乙酸-乙酸钠缓冲液+2mL，100U/mL的淀粉酶溶液)、3:10000(30U/mL，反应体系为7mL pH为6.0的乙酸-乙酸钠缓冲液+3mL，100U/mL的淀粉酶溶液)、1:2500(40U/mL，反应体系为6mL pH为6.0乙酸-乙酸钠缓冲液+4mL，100U/mL淀粉酶溶液)、1:2000(50U/mL，反应体系为5mL pH为6.0乙酸-乙酸钠缓冲液+5mL，100U/mL淀粉酶溶液)和3:5000(60U/mL，反应体系为4mL pH为6.0乙酸-乙酸钠缓冲液+6mL，100U/mL的淀粉酶溶液)，其余同实施例4-1，得到实施例4-2、4-3、4-4、4-5、4-6。
[0048]将实施例4-1到4-6所得到的降解浒苔多糖对·OH的清除作用作图得图4。得到淀粉酶最佳反应料液比为1:2500(40U/mL)。[0049]通过上述实施例得到的结果，设计正交试验L9(34)的因素水平表进行试验，以降解浒苔多糖对·OH的清除能力为评价指标，见下表1[0050]表1正交试验因素水平表
[0051]
[0052]
[0053][0054]
实施例5见表2
表2淀粉酶降解浒苔多糖正交试验结果
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由上表可以看出，各因素影响程度依次为反应时间＞反应pH＞反应温度＞料液
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比，最佳降解方案为：反应时间4h，反应pH6.5、反应温度70℃、反应料液比1:2000(50U/mL)。[0058]为了使得实验的结果得到合理验证，按最佳实验条件降解浒苔多糖并平行测定3次，浒苔多糖对·OH的清除率平均值为69.52％，此结果高于正交试验所测得结果的最高值，所得实验方法是稳定、可靠的。[0059]实施例6
[0060]分别配制0.125、0.25、0.5、1.0、2.0、4.0mg/mL浒苔多糖溶液和经透析冷冻干燥后的降解浒苔多糖溶液，并以Vc做对照，比较样品对·OH的清除率。见附图5。[0061]由图可以看出，浒苔多糖、降解浒苔多糖对·OH都具有一定的清除作用，并且在实验范围浓度内，对·OH的清除作用都是随着多糖浓度的升高而逐渐加强的。当多糖的质量浓度为1mg/mL时，两者对于·OH的清除作用都趋于平缓，这时Vc对·OH的清除率已达到100％。另外，通过origin软件计算，EP的IC50＝1.1014mg/mL，淀粉酶降解多糖的IC50＝0.397mg/mL，多糖降解前后IC50明显下降，降解浒苔多糖对·OH的清除效果明显高于浒苔多糖。
[0062]实施例7
[0063]称取0.05g浒苔多糖加入5mL pH为6.0的乙酸-乙酸钠缓冲液，加入5mL100U/mL的淀粉酶溶液，配成5mg/mL的粗糖水溶液，在60℃的温度下反应4h的时间，将酶解后的酶解液煮沸5min，离心除去酶，将上清液用碱调节pH至中性，然后将溶液用截留分子量为500的透析袋透析24h，除去无机盐，透析液进行冷冻干燥得淀粉酶降解浒苔多糖。[0064]将所得到的产物利用高效凝胶色谱测定，浒苔多糖峰消失，只有单一降解产物峰，浒苔多糖降解率达到100％，其分子量为1.9645×103Da(图6)，降解产物的红外光谱与原料浒苔多糖原料的红外光谱比较(图7)，原料浒苔多糖的特征吸收峰850.45cm-1(C-O-S)，1230.36cm-1(S＝O)，1619.91cm-1(C＝O)，在降解后依然存在，说明淀粉酶降解后浒苔多糖的基本结构和活性基团没有被破坏。
[0065]所有上述的首要实施这一知识产权，并没有设定限制其他形式的实施这种新产品和/或新方法。本领域技术人员将利用这一重要信息，上述内容修改，以实现类似的执行情况。以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。
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