分子生物技术

一、核酸的提取、纯化与鉴定

的提取与纯化

哺乳动物细胞总RNA的提取与纯化

经典方式：异硫氰酸胍-酸酚法

实验原理：利用高浓度强变性剂异硫氰酸胍可使细胞结构迅速破坏，释放出RNA，包括核糖体RNA。高浓度异硫氰酸胍和β-巯基乙醇还可使细胞内各类RNA酶失活，使释放出的RNA不被RNA酶降解。采纳酸性苯酚/氯仿/异戊醇抽提细胞裂解物时，蛋白质变性不溶，而在酸性pH条件下，DNA溶于酚相中，RNA仍留于水相中。取水相用冰异丙醇沉淀，70%乙醇洗涤晾干后即可取得高质量细胞总RNA。

Trizol法：（原理同经典方式）

实验步骤：

1. 提取组织RNA时，每50～100mg组织（已研磨成粉沫）用1ml Trizol试剂对组织进行裂解；提取细胞RNA时，先离心沉淀细胞，每5-10 ×106个细胞加1ml Trizol后，反复用枪吹打或猛烈振荡以裂解细胞；

2. 将上述组织或细胞的Trizol裂解液转入EP管中,在室温15~30℃下放置5分钟；

3. 在上述EP管中，依照每1ml Trizol加氯仿的量加入氯仿，盖上EP管盖子，在手中使劲震荡15秒，在室温下（15℃～30℃）放置2～3分钟后，12000g（2℃～8℃）离

心15分钟；

4. 取上层水相置于新EP管中,依照每1ml Trizol加异丙醇的量加入异丙醇，在室温下（15℃～30℃）放置10分钟,12000g（2℃～8℃）离心10分钟；

5. 弃上清，依照每1ml Trizol加1ml 75%乙醇进行洗涤，涡旋混合，7500g（2℃～8℃）离心5分钟，弃上清；

6. 让沉淀的RNA在室温下自然干燥；用Rnase-free water 溶解RNA沉淀。

病毒RNA的提取

用异硫氰酸胍提取

提禽流感病毒的详细步骤，可参考：

1.取200ul样品数阴性对照阳性对照个灭菌eppendorf管；

2.加600ul异硫氰酸胍，然后加入对照和样品，再加200ul氯仿，倒置混匀

离心15min；

4.在第3步离心快终止时，另取一样多个eppendorf管，加入400ul -20℃预冷的异丙醇；

5.取第3步离心的上清（必然不要吸取到中间白色层，第3步离心终止往外拿的时候，

管子尽可能不要倾斜）转移到第4步预备的管中，倒置混匀；

离心15min，轻轻倒去上清；在吸水纸上尽可能沾干液体；

7.加600ul 75％乙醇，倒置数次以洗涤残余异丙醇；

离心15min，轻轻倒去上清；在吸水纸上尽可能沾干液体；

离心10sec，将管壁残余液体甩到底部，用微量枪头吸干，室温干燥2－3min（不可过度干燥，避免下一步RNA不溶解）；

9.加入20ul DEPE水(加入depc的纯水高压后的水即为DEPE水)，轻轻混匀溶解RNA。2000rpm离心5sec，冰上保留备用（最好2小时内利用，以避免RNA降解）。

用TRIzol LS提取

应用TRIzol LS提取病毒RNA

所提取物为血清、血液、细胞培育液、鸡胚尿囊液等液体中的病毒。提取时尽可能在人少时进行，避免空气中RNA酶的污染。所用一切物品也应是无RNA酶的。

1 在的eppendorf管中加入病毒原液500ul，再加入TRIzol LS 500ul，充分混匀，室温放置10min。

2 加入200ul的氯仿，盖紧离心管盖，使劲震荡离心管（溶液充分乳化，成乳白状，无分相现象），室温放置10min （由于氯仿沸点低、易挥发，振荡时离心管可能爆开，警

惕）。

3 离心 4℃、13000r/min、15min，取上层液相移入另一管（切忌吸动白色中间相）。

4 加入等体积异丙醇，轻轻倒置离心管充分混匀液体，室温放置10min。

5 离心 4℃、13000r/min、15min，（这时乍一看会发觉管子里仿佛没有东西，再认真看看，会发觉靠近管底的壁上有一星点的白色沉淀物，确实是它了）用移液器警惕吸去所有上清。

6 1ml75%乙醇洗一遍，离心 4℃、8000r/min、10min，（这时又会发觉管子没东西了，不要担忧，有的，可是因为量太少看不见算了）用移液器警惕吸去所有上清，在超净台中干燥5min。

7 加入适量DEPC处置水。（若是材料来源丰硕的话，加入的水量为下一步RT的total减去其他试剂的量；假设要省着点用，那么自己看着办了，尽可能不要加太多的水）。

8 建议当即做RT。假设要保留，可在上一步加入乙醇后冻存于－70℃，可保留一年；假设加入DEPC水后那么只能在－20℃保留1个月左右。

Trizol法提禽流感病毒protocol

Trizol法适用于人类、动物、植物、微生物的组织或培育细菌，样品量从几十毫克至几克。

一、 取鸡胚尿囊液，加入5-10倍体积 Trizol液，混匀；

二、 室温放置5分钟，然后以每1ml Trizol液加入的比例加入氯仿，盖紧离心管，用手猛烈摇荡离心管15秒；

3、 取上层水相于一新的离心管，按每ml Trizol液加异丙醇的比例加入异丙醇，室温放置10分钟，12000g离心10分钟；

4、 弃去上清液，按每ml Trizol液加入至少1ml的比例加入75%乙醇，混匀，4℃下7500g离心5分钟；

五、 重复第4步；

六、 警惕弃去上清液，然后室温干燥5-10分钟，注意不要干燥过度，不然会降低RNA的溶解度；

7、 然后将RNA溶于水中，放置10分钟。

[注意]

一、 整个操作要带口罩及一次性手套，并尽可能在低温下操作。

二、 加氯仿前的匀浆液可在-70℃保留一个月以上，RNA沉淀在70%乙醇中可在4℃保留一周，-20℃保留一年。

mRNA的分离纯化

亲和层析法：

原理：除血红蛋白及某些组蛋白外，绝大多数mRNA在其3'结尾带有一个犬牙交错的多聚腺苷酸（polyadenylic acid）的结构，即poly(A)尾巴。以总RNA制品为起始材料，利用核酸的碱基配对原理，通过oligo(dT)-纤维素或poly(U)-琼脂糖凝胶的亲和层析，和能够很容易地同时分离不同种类与大小的mRNA的分子群体。

操作步骤

1．将-1.0g寡聚（dT）-纤维悬浮于0.1M的NaOH溶液中。

2．用DEPC处置的1ml注射器或适当的吸管，将寡聚（dT）-纤维素装柱，用3倍柱床体积的DEPC H2O洗柱。

3．利用1×上样缓冲液洗柱，直至洗出液pH值小于。

4．将RNA溶解于DEPC H2O中，在65℃中温育10min左右，冷却至室温后加入等体2×上样缓冲液，混匀后上柱，当即搜集流出液。当RNA上样液全数进入柱床后，再用1×上样缓冲液洗柱，继续搜集流出液。

5．将所有流出液于65℃加热5min，冷却至室温后再次上柱，搜集流出液。

6．用5-10倍柱床体积的1×上样缓冲液洗柱，每管1ml分部搜集，OD260测定RNA含量。前部份搜集管中流出液的OD260值很高，其内含物为无Poly(A)尾的RNA。后部份搜集管中流出液的OD260值很低或无吸收。

7．用2-3倍柱容积的洗脱缓冲液洗脱Poly(A+)RNA，分部搜集，每部份为1/3-1/2柱体积。

8．OD260测定Poly(A+)RNA散布，归并含Poly(A+)RNA的搜集管，加入1/10体积3M NaAc（）、倍体积的预冷无水乙醇，混匀，-20℃放置30min。

9．4℃离心，10000g×15min，警惕吸弃上清。用70%乙醇洗涤沉淀。[注意：现在Poly(A+)RNA的沉淀往往看不到]。4℃离心，10000g×5min，弃上清，室温晾干。

10. 用适量的DEPC H2O溶解RNA。

磁珠法提取mRNA：

大体原理：第一通过含有RNA抑制剂的裂解液裂解样本，释放核酸，然后通过磁珠上共价偶联的oligo(dT)与mRNA上的polyA相配对结合而提取较高纯度的完整mRNA。其它的RNA分子由于缺乏polyA而不能与磁珠相结合，会被水相洗涤而除去。

操作步骤

1.探针的退火

1）在一个无菌的、无RNase的中，加入未稀释的总RNA溶液，使终体积达到。可利用更大量的总RNA，其浓度可至过饱和，即有絮状RNA沉淀析出，但当有絮状RNA沉淀存在时，后续的退火反映操作会受到必然程度阻碍；也可利用更少量的总RNA(50ug)，但mRNA产量可能无法保证。

2）将离心管置于65℃中10分钟或略长时刻。

3）加入15ul 的Biotinylated-Oligo(dT)探针和39ul的20×SSC到RNA中。倒置

数次以混匀，静置于室温下至充分冷却。这将需要10分钟或略少的时刻。在该溶液冷却期间，制备×和×SSC贮存液

2.贮存液制备

1）通过在三个无菌的、无RNase的离心管中各自混合30ul的20×SSC和的无RNase的水来制备三份的无菌的 ×SSC。

2)通过在三个无菌的、无RNase的离心管中各自混合7ul的20×SSC和的无RNase的水来制备三份的无菌的 ×SSC。

3.链霉抗生物素蛋白-磁珠(Streptavidin-Paramagnetic Particles)的漂洗

1）取三管链霉抗生物素蛋白-磁珠，轻弹离心管的底部使SA-PMPs重悬直至其充分分散，吸取悬液归并于一管。

2）使汇总的SA-PMPs重悬直至其充分分散，然后将离心管置于磁柱中直至SA-PMPs已经聚集在离心管壁上(大约30秒)。警惕地移出上清。不要离心沉淀颗粒。

3)用×SSC漂洗SA-PMPs三次(每次，每次都利用磁柱来捕捉它们，然后警惕地移去上清。

4)重悬漂洗过的SA-PMPs于的×SSC中。

(dT)-mRNA退火杂合体的捕捉和漂洗。

1）将退火反映的全数成份加入到含有漂洗过的SA-PMPs的离心管中。

2）室温下静置10分钟。每1-2分钟轻柔地倒置一次以混匀。

3）用磁柱捕捉SA-PMPs，警惕移去上清，注意不要搅动SA-PMPs颗粒。当总RNA为过饱和高浓度时溶液时，退火反映易形成黑色絮状物，磁柱吸附也难以紧缩其体积，这时应警惕吸取上清；保留上清直至确信mRNA的结合与洗脱已是令人中意。

4）用×SSC(每次漂洗颗粒4次，其间轻弹离心管底部直至颗粒已被重悬。最后一次漂洗后，在不搅动SA-PMPs的前提下，以 8000rpm离心1分钟，尽可能多地移出液相。

的洗脱

1）为洗脱mRNA，将最终的SA-PMPs重悬于的无RNase的水中，温柔地轻弹离心管以重悬颗粒。

2）65℃水浴2分钟。

3）用磁场捕捉SA-PMPs，8000rpm离心30秒。

4）将含有洗脱的mRNA的液相移入一无菌的、无RNase的离心管中。勿将颗粒抛弃。

5）重悬SA-PMP颗粒于的无RNase的水中，65℃水浴2分钟，用磁场捕捉SA-PMPs，8000rpm离心2分钟。将洗脱液与5. 4)步骤中洗脱的mRNA归并。

6）如果这时有任何颗粒也被携带到终溶液中，可用10,000×g，4℃，5-10分钟的离心来去除。警惕地将RNA转入一新鲜的无RNase的离心管中。

的浓缩

1）加入等体积异丙醇，混匀。通常立刻有肉眼可见之沉淀生成，当即以12000rpm离心10分钟，沉淀mRNA。或依照沉淀生成的难易，-20℃ 放置数小时或留宿再沉淀。

2）警惕倒去异丙醇，加75%乙醇洗涤。

3）警惕倒去75%乙醇，室温干燥。

4）将mRNA溶于20ul无RNase的水中。注意管壁上通常会粘附大量mRNA沉淀，用枪头吸取水滴在管壁上转动数次以尽可能回收mRNA。

磁珠分离mRNA试剂盒：

1.1.5ml离心管中加入500ul待提取样品，再加入400ul核酸提取液，震荡10秒；

2.将样品处理管置于恒温装置上60℃保温10分钟；

3.再将样品处理管置于室温放置10分钟后，转移到磁珠分离器上，静置5分钟；待磁珠吸附于管壁后，吸净管中的气泡和液体，保留磁珠；

4.向管中加入1ml洗涤液，取下后震荡10秒，再置于磁珠分离器上，静置5分钟；重复步骤3，共用洗涤液漂洗2次，最后尽量吸净液体；

5.若对后续试验无特殊要求，加入50ulDEPC-treated Water，震荡，使磁珠悬浮即可；

6.若需要将磁珠洗脱下来，可向管中加入50ul洗脱液（DEPC-treated Water或Long-term RNA Storage Buffer），取下并震荡10秒，再将管置于恒温装置上60℃保温5分钟；

7.立即将上述样品处理管重新置于磁珠分离装置上，静置3分钟，保持样品处理管于磁珠分离装置上，取出清液（弃磁珠），即为提取的RNA。

2．DNA的提取与纯化

细菌质粒DNA的提取与纯化

质粒DNA的小量制备

原理：所有分离质粒 DNA 的方式都包括 3 个大体步骤：培育细菌使质粒扩增；搜集和裂解细菌；分离和纯化质粒 DNA 。采纳溶菌酶可破坏菌体细胞壁，十二烷基磺酸钠（ SDS ）可使细胞壁裂解，经溶菌酶和阴离子去污剂（ SDS ）处置后，细菌 DNA 缠绕附着在细胞壁碎片上，离心时易被沉淀出来，而质粒 DNA 那么留在上清液中。用酒精沉淀洗涤，可取得质粒 DNA 。

质粒DNA的小量制备可采纳下述的碱裂解法或煮沸法

（一）细菌的收成和裂解

1.收成

1）将2ml含相应抗生素的LB加入到容量为15ml 并通气良好（不盖紧）的试管中，然后接入一单菌落，于30℃猛烈振摇下培育留宿。

2）将培育物倒入微量离心管中，用微量离心机于4℃以12000g离心30秒，将剩余的培育物贮存于4℃。

3）吸去培育液，使细菌沉淀尽可能干燥。除去上清的简便方式是用一次性利用的吸头与真空管道相连，轻缓抽吸，并用吸头接触液面。当液体从管中吸出时，尽可能使吸头远离细菌沉淀，然后继续用吸头通过抽真空除去附于管壁的液滴。

2.碱裂解法

1）将细菌沉淀，所得重悬于100μl用冰预冷的溶液I中，猛烈振荡。

溶液I

50mmol/L葡萄糖

25mmol/L （）

10mmol/L EDTA（）

溶液I可成批配制，每瓶约100ml，在10lbf/in2（×104Pa） 高压下蒸气灭菌15分钟，贮存于4℃。须确使细菌沉淀在溶液I中完全分散，将两个微量离心管的管底部相互接

触震荡，可使沉淀迅速分散。

2）加200μl新配制的溶液Ⅱ。

溶液Ⅱ

L NaOH（临用前用10mol/L贮存液现用现稀释）

1%SDS

盖紧管口，快速倒置离心管5次，以混合内容物。应确保离心管的整个内表面

均与溶液Ⅱ接触。不要振荡，将离心管放置于冰上。

3）加150μl用冰预冷的溶液Ⅲ

溶液Ⅲ

5mol/L乙酸钾 60ml

冰乙酸

水

所配成的溶液对钾是3mol/L，对乙酸根是5mol/L

盖紧管口，将管倒置后和地振荡10秒钟溶液Ⅲ在粘稠的细菌裂解物中分散均匀，以后

将管置于冰上3－5分钟。

4）用微量离心机于4℃12 000g离心5分种，将上清转移到另一离心管中。

5）可做可不做：加等量酚：氯仿， 振荡混匀， 用微量离心机于4 ℃以12000g离心

2分钟，将上清转移到另一良心管中。有些工作者以为没必要用酚：氯仿进行抽提，但是由于一些未知的缘故，省略这一步，往往会取得可耐受限制酶切反映的DNA。

6）用2倍休积的乙醇于室温沉淀双锭DNA.振荡混合， 于室温放置2分钟。

7）用微量离心机于4℃以12 000g离心5分钟。

8）警惕吸去上清液，将离心管倒置于一张纸巾上，以使所有液体流出。再将附于管壁的液滴除尽。除去上清的简便方式是用一次性利用的吸头与真空管道相连，并用吸头接触液面。当液体从管中吸出时，尽可能使吸头远离核酸沉淀，然后继续用吸头通过抽真空除去附于管壁的液滴。

9）用1ml70%乙醇于4℃洗涤双链DNA沉淀，按步骤8）所术方式去掉上清，在空气中使核酸沉淀干燥10分钟。

i.此法制备的高拷贝数质粒（如Xf3或pUC），其产量一样约为：每毫升原细菌培育物

3－5μg。

ii.若是要通过限制酶切割反映来分析DNA，可取1μl DNA溶液加到另一含8μl水的微量离心管内，加1μl 10×限制酶缓冲液和1单位所需限制酶， 在适宜温育1－2小时。将剩余的DNA贮存于－20℃。

iii.此方式按适当比例放大可适用于100ml细菌培育物：

3.煮沸裂解

1）将细菌沉淀，所得重悬于350μlSTET中。

STET

L NaCL

10mmol/L （）

1mmol/L EDTA（）

5% Triton X-100

2）加25μl新配制的溶菌酶溶液[10mg/ml，用10mmol/L 以混匀之。若是溶淮中pH低于，溶菌酶就不能有效发挥作用。

3）将离心管放入煮沸的水浴中，时刻恰为40秒。

]，振荡3秒钟（）配制

4）用微量离心机于室温以12 000g离心10分种。

5）用无菌牙签从微量离心管中去除细菌碎片。

6）在上清中加入40μl 5mol/L乙酸钠（）和420μl异丙醇，振荡混匀，于室温放置5分钟。

7）用微量离心机于4℃以12 000g离心5分种，回收核酸沉淀。

8）警惕吸去上清液，将离心管倒置于一张纸巾上，以使所有液体流出。再将附于管壁的液滴除尽。除去上清的简便方式是用一次性利用的吸头与真空管道相连，轻缓抽吸，并用吸头接触液面。当液体从管中吸出时，尽可能使吸头远离核酸沉淀，然后继续用吸头通过抽真空除去附于管的液滴。

9）加1ml 70％乙醇，于4℃以12 000g离心2分钟。

10）按步骤8）所述再次轻轻地吸去上清，这一步操作要额外警惕，因为有时沉淀块贴壁不紧，去除管壁上形成的所有乙醇液滴，打开管口，放于室温直至乙醇挥发殆尽，管内无可见的液体（2－5）分钟。

11）用50μl含无DNA酶的胰RNA酶（20μg/ml）的TE（）溶解核酸略加振荡，贮存于-20℃。

注：当从表达内切核酸酶A的大肠杆菌株（endA+株，如HB101 ）中小量制粒尤其DNA时，建议舍弃煮沸法。因为煮沸步骤不能完全灭活内切核酸酶A，以后在Mg2+存在下温育（V顶用限制酶时）质粒DNA可被降解。 在上述方案的步骤9）之间增加一步，

即用酚：氯仿进行抽提，能够幸免这一问题。

（二）质粒DNA小量制备的问题与计谋

裂解和煮佛法都极为靠得住，重复性也专门好，而且一样没有会么麻烦。连年来，在咱们实验室中日常利用这两种方式的进程中，只碰着过两个问题：

1）有些工作者第一次进行小量制备时，有时会发觉质粒DNA不能被限制酶所切割，这几乎老是由于从细菌沉淀或从核酸沉淀中去除所有上清液时注意得不够。大多数情形下，用酚：氯仿对溶液进行抽提能够去除小量备物中的杂质。若是老是仍然存在，可用离心柱层析注纯化DNA.

2）在十分偶然的情形下，个别小时制备物会显现无质粒DNA的现象。这几乎确信是由于核酸沉淀颗粒已同乙醇一路被弃去。

质粒DNA的大量制备

（一）在丰硕培育基中扩增质粒

许连年来，一直以为在氯霉素存在下扩增质粒只对生长在大体培育基上的细菌有效，但是在带有pMBl或ColEl复制子的高拷贝数质粒的大肠杆菌菌株中，采纳以下步骤可提高产量至每500ml培育物2－5mg质粒DNA，而且重复性也专门好。

1）将30ml含有目的质粒的细菌培育物培育到对数晚期（DNA 600约）。培育基中应含有相应抗生素，用单菌落或从单菌落中生长起来的小量液体闭关物进行接种。

2）将含相应抗生素的500ml LB或Terrific肉汤培育基（预加温至37℃）施放入25ml对数晚期的培育物，于37℃猛烈振摇培育25小时（摇床转速300转/分），所得培育物的OD 600值约为.

3）可做可不做：加氯霉素溶液（34mg/ml溶于乙醇），使终浓度为170μg/ml.像pBR322一类在宿主菌内只以中等拷贝娄竿行复的质粒，有必要通过扩增。这些质粒只要从生长达到饷新一代的质粒（如pUC质粒）可复制达到很高的拷贝数，因此无需扩增。这些质粒只要从生长达到饱和的细菌培育物即可大量提纯。但用氯霉素进行处置，具有抑制细菌复制的优势，可减少细菌裂解物的体积和粘稠度，极大地简化质粒纯化的进程。因此一样说来，尽管要在生长中的细菌培育物里加入氯霉素略显不便，但用氯霉素处置仍是利大于弊。

4）于37℃猛烈振摇（300转/分），继续培育12-16小时。

（二）细菌的收成和裂解

1.收成

1）用适合转头于4℃以4000转/分离心15分钟，弃上清，放开离心管口并倒置离心管使上清全数流尽。

2）将细菌沉淀重悬于100ml用冰预冷的STE中。

STE

L NaCl

10mmol/L （）

1mmol/L EDTA（）

2）按步骤1）所述方式离心，以搜集细菌细胞。

2，碱裂解法

1）将冼过的500ml 培育物的细菌沉淀物[ 来自收成细菌的步骤3] 重悬于10ml（18ml）溶液I中。

溶液I

50mmol/L葡萄糖

25mmol/L （）

10mmol/L EDTA（）

溶液I可成批配制，在10 lbf/in2（）高压下蒸气灭菌15分钟，贮存于4℃。

2）加1ml（2ml）新配制的溶菌酶溶液[10mg/ml，溶于10mmol/L （）].当溶液的pH值低于时，溶菌酶不能有效工作。

3）加20ml（40ml）新配制的溶液Ⅱ。

溶液Ⅱ

L NaOH（临用前用10mol/L贮存液现用现稀释）

1％SDS

盖紧瓶盖，缓缓倒置离心瓶数次，以充分混匀内容物。于室温放置5-10分钟。

4）加15nl（20ml）用冰预冷的溶液Ⅲ。

溶液Ⅲ

5mol/L乙酸钾 60ml

冰乙酸

水

所配成的溶液对钾是3mol/L，对乙酸根是5mol/L.

封住瓶口，摇动离心瓶数次以混匀内容物，现在应再也不显现分明的两个液相。置冰上放10分钟，应形成一白色絮状沉淀。于0℃放置后所形成的沉淀应包括染体DNA、 高分子量RNA和钾－SDS－蛋白质－膜复合物。

5）用适合转头于4℃以4000转/分离心15分钟，不开刹车而使转头自然停转。若是细菌碎片贴壁不紧，能够5000转/分再度离心20分钟， 然后尽可能将上清全数转到另一

瓶中，弃去残留在离心管内的粘稠状液体。未能形成致密沉淀块的缘故一般是由于溶液Ⅲ与细菌裂解物混合不充分[步骤4）].

6）上清过滤至一250ml离心瓶中，加体积的异丙醇，充分混匀，于室温放置10分钟。

7）用适合转头于室温以500转/分离心15分钟，回收核酸。如于4℃离心，盐也会了生沉淀。

8）警惕倒掉上清，放开瓶口倒置离心瓶使残余上清液流尽，于室温用70％乙醇洗涤沉积管壁。倒出乙醇，用与真空装置相联的巴期德吸出附于瓶壁的所有液滴，于室温将瓶倒置放在纸巾上，使最后残余的痕量乙醇挥殆尽。

9）用3ml TE（）溶解核酸沉淀。

10）纯化。

质粒DNA的纯化

聚乙二醇沉淀法质粒DNA

氯化铯－溴化乙锭梯度平稳离心法纯化闭环DNA

（一）聚乙二醇沉淀法提取质粒DNA

1）将核酸溶液所得]转入15mlCorex 管中， 再加3ml 用冰预冷的5mol/L LiCl溶

液，充分混匀，用适合转头于4℃下以10 000转/分离心10分钟。LiCl可沉淀高分子RNA.

2）将上清转移到另一30mlCorex管内，加等量的异丙醇， 充分混匀， 用SorvallSS34转头（或与其相当的转尖）于室温以10 000转/分离心10分钏， 回收沉淀的核酸。

3）警惕去掉上清，放开管口，将管倒置以使最后残留的液滴流尽。于室温用70％乙醇洗涤沉淀及管壁，流尽乙醇，用与真空装置相连的巴其德吸管吸去附于管壁的所有液滴，放开管口并将管侄置，在纸巾上放置几分钟，以使最后残余的痕量乙醇蒸发殆尽。

4）用500μl含无DNA酶的胰RNA酶（20μg/ml ）的TE（）溶解沉淀，将溶液转到一微量离心管中，于室温放置30分钟。

5）加500μl含13％（w/v）聚乙二醇（PEG 8000）的L NaCl，充分混合，用微量离心机于4℃以12000g离心5分钟，以回收质粒DNA.

6）吸出上清，用400μl TE（）溶解质粒DNA沉淀。用酚、酚：氯仿、氯仿各抽1次。

7）将水相转到另一微量离心管中，加100μl 10mol/L乙醇铵，充分混匀，加2倍体积（约1ml）乙醇，于室温放置10分钟，于4℃以12 000g离心5分钟，以回收沉淀的质粒DNA.

8）吸去上清，加200μl处于4℃以12 000g离心2分钟。

9）吸去上清，放开管口，将管置于实验桌上直到最后可见的痕量乙醇蒸发殆尽。

10）用500μl TE（）溶解沉淀1：100稀释[用TE（）] 后测量OD 260，计算质粒DNA的浓度（1OD260＝50μg质粒DNA/ml）， 然后将DNA贮于－20℃。

细菌基因组DNA提取纯化

CTAB/NaCl 法：

细菌基因组DNA的制备

一、材料

细菌培育物。

二、试剂

1、CTAB十六烷基三甲基溴化铵/NaCl溶液：4.1g NaCl溶解于 80ml H2O,缓慢加入10g CTAB,加水至100ml。

2、其它试剂：氯仿:异戊醇(24:1)，酚: 氯仿:异戊醇(25:24:1)，异丙醇，70% 乙醇，TE，10% SDS，蛋白酶 K (20mg/ml或粉剂)，5mol/L NaCl。

三、操作步骤：

1. 将菌株接种于液体LB培育基，37℃震荡培育留宿。

2. 取培育物12000rpm离心2min。

3. 沉淀物加入567 ul的TE缓冲液，反复吹打使之从头悬浮，加入30ul 10%SDS和15ul的蛋白酶K，混匀，于37℃温育1h.

4. 加入100ul 5mol/L NaCl, 充分混匀，再加入80ul CTAB/NaCl溶液，混匀后再65℃温育10min。

5. 加入等体积的酚/氯仿/异戊醇混匀，离心4-5min, 将上清转入一只新管中，加入倍体积的异丙醇，轻轻混合直到DNA沉淀下来，沉淀可略加离心。

6. 沉淀用1ml的70%乙醇洗涤后，离心弃乙醇。

哺乳动物细胞DNA的提取与纯化

盐析法

原理：细胞中的DNA和RNA别离与蛋白质相结合，形成脱氧核糖及核糖。在细胞破碎后，这两种核蛋白将混杂在一路。因此，要制备DNA第一要将这两种核蛋白分开。已知这两种核蛋白在不同浓度的中具有不同的溶解度，如在L NaC1的稀中核糖核蛋白的溶解度最大，脱氧核糖核蛋白的溶解度那么最小（仅约为在纯水中的1%）；而在l mol/L NaCl的浓盐溶液中，脱氧核糖核蛋白的溶解度增大，至少是在纯水中的2倍，核糖核蛋白的溶解度那么明显降低。依照这种特性，调整盐浓度即可把这两种核蛋白分开。因此，在细胞破碎后，用稀盐溶液，反复清洗，所得沉淀即为脱氧核糖核蛋白成份。

分离取得的脱氧核糖核蛋白，用十二烷基硫酸钠（）使蛋白质成份变性，让DNA游离出来，再用含有异戊醇的氯仿沉淀除去变性蛋白质。最后依照核酸只溶于水而不溶于有

机溶剂的特点，加入95%的乙醇即可从除去蛋白质的溶液中把DNA沉淀出来，取得产品。

当细胞破碎时，细胞内的脱氧核糖（DNase）当即开始降解DNA，若是在破碎细胞后不及时采取抑制酶活的方法，最后将会得不到任何DNA。为此，如在本实验中加入柠檬酸盐、等螯合剂以除DNase必需的Mg2＋离子，使DNase活性降低，并要求整个分离制备的进程均在4℃以下进行，以减少DNase的降解作用，最后加入使所有的蛋白质（包括DNase）变性。固然若是希望取得更大分子的DNA时，那么在细胞破碎后，及时加入SDS使蛋白质（包括DNase）变性，并加入K，降解所有的蛋白质成为碎片或，及时阻止DNase的降解作用。

DNA分子专门大、很长，在水中呈粘稠状，但DNA链的双螺旋结构不宜小角度的折叠，使之DNA分子具有刚性，即分子是僵硬的（stiff），小角度的折叠和压挤等剪切力，将使DNA断裂成碎片。为保证取得大分子DNA，操作时应幸免急裂振摇，或过大的离心力。转移吸取DNA时不可用过细的，不可猛吸猛放，更不能用细的反复吹吸。

试剂及器材

（1） L NaCl – L 柠檬酸钠溶液：称取8.77g NaCl，4.41g柠檬酸三钠（Na3C6H507 · 2H20），用约800ml水溶解后，调剂pH至，最后定容至1 000ml。

（2） L NaCl – L Na2溶液：称取8.77g NaCl，37.2g EDTANa2溶于约800ml水中，以NaOH调pH至，最后定容至1 000ml。

（3） 5%（W/V）十二烷基硫酸钠（SDS）溶液：称取5g SDS溶于45%（V/V）100ml的乙醇中。

（4） 氯仿– 异戊醇溶液：按氯仿:异戊醇=24:1配制。

5） TE缓冲液或LNaOH：120mol/L –HCl，lmol/L EDTANa2。或取NaOH 0.4g加蒸馏水至1 000ml。

（6） 95％（V/V）乙醇1 000ml。

（7） 75％（V/V）乙醇1 000ml。

（8） 组织捣碎机。

（9） 玻璃匀浆器。

（10） 冷冻。

（11） 冰、粗盐。

（三）操作

（1） 本实验以兔肝脏作材料（其他动物肝脏也能够）。实验前应将兔饥饿24h以上，以幸免糖原的干扰。

（2） 用（500m1）放1/3体积的冰，加入少量水及约20g食盐，制成冰盐水。

（3） 将通过饥饿的兔颈部放血致死，迅速开腹掏出肝脏，称取约10g浸入预先在冰盐水中冷却的L NaCl–L柠檬酸钠溶液中。除去脂肪、血块等杂物；再用少量溶液反复洗

涤几回，直至组织块无血为止。

（4） 将洗净的组织剪成碎块。先加入20m1 L NaCl–L柠檬酸钠溶液，放在组织捣碎机中迅速捣成匀浆，再放入玻璃匀浆器中匀浆2～3次，使细胞充分破碎。最后加入L NaCl––L柠檬酸钠溶液至50ml。

（5） 匀浆液在4℃ 6 000r／min离心15min，弃上清。在沉淀中加入4倍体积冷的L NaCl– mol/L柠檬酸钠溶液，搅匀，按上述条件，离心弃上清。如此重复操作2～3次，尽可能洗去可溶的部份（目的是什么?）。最后弃去上清，留沉淀。

（6） 将沉淀物（约5m1）悬浮于5倍体积的， mol/L NaCl– mol/L EDTANa2溶液中，搅匀，而后边搅拌边慢慢滴加5%SDS溶液，直至SDS的最终浓度达1%为止（应加多少毫升?），现在溶液变得十分粘稠，假设不粘稠应重做，然后，加入固体NaCl使最终浓度达l mol/L。继续搅拌30～45min，以确保NaCl全数溶解，现在可见溶液由稠变稀薄。

（7） 将上述混合溶液倒于一个300ml的带塞三角瓶中，加入等体积的氯仿– 异戊醇，振荡10min。在室温3 000r/min离心10min（什么缘故能够在室温操作?），现在可见离心液分为3层：上层为水溶液，中层为变性蛋白块，基层为氯仿– 异戊醇。警惕吸取上层水相，记录体积，放入三角瓶中，向水相中，再加入等体积氯仿– 异戊醇，振荡，离心，如此重复抽提2–3次，除净蛋白质。

（8） 最后1次离心后，警惕吸取上层溶液（不要吸取基层氯仿），记录体积，放入干燥小中，加入2倍体积预冷的95%乙醇。加时，用滴管吸取乙醇，边加边用玻璃棒慢慢顺一个方向在烧杯内转动，随着乙醇的不断加入可见溶液显现粘稠状物质，并能慢慢缠绕

于玻璃棒上，现在玻璃棒搅动的目的在于把粘稠丝状物缠在玻璃棒上，直至再无粘稠丝状物显现为止。粘稠丝状物即是DNA。

（9） 将所得的DNA从玻璃棒上取下，用75%乙醇洗2次，置于干燥器中抽干，称取重量，计算产率。

（10） 按200μg/ml的浓度称取必然量DNA，溶于 mol/L NaOH溶液或 TE缓冲液中（干燥DNA不易溶解，应在测定头几天预先溶解）。

1. 切取组织5g左右,剔除结缔组织,吸水纸吸干血液,剪碎放入研钵(越细越好)。

2. 倒入液氮,磨成粉末,加10ml分离缓冲液。

3. 加1ml 10% SDS, 混匀,此时样品变得很粘稠。

4. 加50ul或 1mg K, 37℃保温1-2小时, 直到组织完全解体。

5. 加1ml 5mol/L NaCl, 混匀,5000rpm离心数秒钟。

6.取上清液于新离心管，用等体积酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)抽提。待分层后,3000rpm离心 5分钟。

7. 取上层水相至干净离心管, 加2倍体积乙醚抽提(在通风情况下操作)。

8. 移去上层乙醚,保留下层水相。

9. 加1/10 体积3mol/L NaAc, 及2倍体积无水乙醇颠倒混合沉淀DNA。室温下静止10-20分钟，DNA沉淀形成白色絮状物。

10. 用玻棒钩出DNA沉淀,70%乙醇中漂洗后,在吸水纸上吸干,溶解于1ml TE中,-20℃保留。

11. 如果DNA溶液中有不溶解颗粒,可在5000rpm短暂离心,取上清; 如要除去其中的RNA,可加5μl RNaseA(10μg/μl), 37℃保温30分钟, 用酚抽提后, 按步骤9-10重沉淀DNA。

SDS法

实验原理：DNA是一切生物细胞的重要组成成份，要紧存在于细胞核中。通过研磨和作用破碎细胞；苯酚和氯仿可使蛋白质变性，用其混合液（酚：氯仿：异戊醇）重复抽提，使蛋白质变性，然后离心除去变性蛋白质；RNase降解RNA，从而取得纯净的DNA分子。

（三）试剂配制

1．– HCL 1mol/L 50ml

配制方法：

40ml双蒸水，6.057g固体Tris放入中溶解，用浓盐酸调PH值到 ，转移到50ml中，加入双蒸水定容，摇匀后，转到预备好的输液瓶中，贴上标签，高压灭菌后，降至室温，4℃保留备用。

2．生理盐水: %NaCL 100ml

配制方法：

在20ml双蒸水中溶解0.85g固体NaCL，加水定容至100ml，摇匀后，转到预备好的输液瓶中，贴上标签，高压灭菌后，降至室温，4℃保留备用。

3． L 50ml

配制方法：

将 9.08g的EDTA·Na2·2H2O溶解于40ml双蒸水，用1g的NaOH颗粒（慢慢慢慢加入）调PH值到，用50ml定容，若是 EDTA难溶，先加NaOH溶解，然后慢慢加EDTA·Na2·2H2O。

4．TES缓冲液（释放DNA） 100ml

配制方法：

将 0.5844g的5 mol/lNaCl溶解于80ml双蒸水，在别离加入1ml的 mol/l EDTA、的Tris-HCl (pH=，加定容至100ml, 摇匀后，转到预备好的输液瓶中，贴上标签，高压灭菌后，降至室温，4℃保留备用。

5．10% SDS（变性剂 破细胞壁）100ml

配制方法：

将10g的十二烷基硫酸钠（SDS）溶解于80ml双蒸水于68℃加热溶解，用浓HCl 调至PH=，定容至100ml，摇匀后，转到预备好的输液瓶中，贴上标签，4℃保留备用。

6．K（降解蛋白质）：20mg/mL 无菌三蒸水溶解。

7．RNA酶 （降解RNA）

配制方法：

将胰RNA酶（RNA酶A）溶于10mmol/L的 Tris·CL（）、15mmol/LNaCL中，配成10mg/ml的浓度，于100℃加热15min，缓慢冷却至室温，分装成小份存于 –20℃。

8．氯仿：异戊醇=24：1 100ml

按24:1的比例加入氯仿、异戊醇，摇匀，转到准备好的瓶中，贴上标签，4℃保留备用。

9．TE缓冲液（溶解DNA） 50ml

配制方法：

将 的10mmol Tris-HCl 、的l EDTA 加入到50ml的容量瓶中，调定容至50ml摇匀后，转到准备好的瓶中，贴上标签，高压灭菌后，降至室温，4℃保留备用。

【实验步骤】

1．组织块解冻，用生理盐水洗去血污，剪取约0.5g组织，放入离心管中，剪碎。

2．加入 TES混匀，再加入50ul SDS（10%），蛋白酶K（20mg/ml），充分混匀后，于56°C保温4-6h，每2h摇1次。

3．放置到室温，加入等体积饱和酚（500ul），颠倒混匀，10000r/m，离心10m，分离水相和有机相，警惕吸取上层含核酸的水相，到一个新的离心管。

4．加入等体积酚：氯仿：异戊醇（25：24：1），颠倒混匀，10000r/m，离心10分钟，取上层转移到新的离心管中。

5．加入等体积氯仿：异戊醇（24：1），颠倒混匀，10000r/m，离心10分钟，取上层清液到一个新的离心管。

6．加入倍体积的 -20°C预冷的无水乙醇沉淀DNA，观看现象。

7．12000 r/m，离心10分钟，弃乙醇。

8．-20°C保留的75%乙醇洗涤，10000 r/m，离心5分钟，去乙醇，55°C干燥DNA。

9．加入适量TE溶解DNA（具体依DNA的多少而定），-20°C保留备用。

【注意事项】

1．抽提每一步使劲要柔和，避免机械剪切力对DNA的损伤。

2．取上层清液时，注意不要吸起中间的蛋白质层。

3．乙醇漂洗去乙醇时，不要荡起DNA。

4．离心后，不要晃动离心管，拿管要稳，斜面朝外。

和DNA的理化性质鉴定

理化性质的初步鉴定：电泳

DNA的琼脂糖凝胶电泳

【实验原理】

带电粒子在电场中能够向其所带电荷相反的电极的方向移动的现象，称为电泳。DNA分子在pH值高于其等电点的缓冲液中带负电荷，在电场中向正极移动,缓冲液pH值偏离等电点愈远，其所带的电荷愈多。在必然的电场强度下，不同的DNA片段的迁移速度不一样。其迁移速度要紧取决于DNA的分子大小、所带电荷量等，分子量愈小、带电荷量愈多，迁移速度愈快，相同分子量的不同构型的DNA分子，其迁移速度也不一样。超螺旋质粒DNA的泳动速度最快，线状质粒DNA次之，开环质粒DNA泳动速度最慢。另外，同一种DNA分子，在浓度较高的琼脂糖凝聚中泳动速度较慢，在浓度较低的琼脂糖凝聚中泳动速度较快。

一、 琼脂糖胶液的制备：称取1 g 琼脂糖，置于三角烧瓶中，加入硼酸EDTA缓冲液，瓶口扣上一小烧杯，于（110---115度）加8-10分钟，琼脂全数融化于缓冲液中。掏出摇匀，即为1%琼脂。（也可加溴化乙啶）

二、 凝胶板的制备

用橡皮膏将凝胶塑料托盘短边缺口封住，置水平玻板或工作台面上（须调水平，将样品槽模板（梳子）插进托盆长边上的凹槽内（距一端约1.5cm）。梳子底边与托盘表面维持一1mm的间隙，待琼脂糖冷至65℃左右，加入4μl DNAgreen。警惕地倒入托盘内，使凝胶缓慢地展开直至在托盘表面形成一层约3mm厚均匀胶层．液内不存有气泡．室温下静置一lh。待凝固完全后，用小滴管在梳齿周围加人少量缓冲液润湿凝胶，双手均匀使劲轻轻拔出样品槽模板（注意勿使样品槽破裂），那么在胶板上形成彼此隔开的样品槽。

3、 取下封边的橡皮膏，将凝胶连同托盘放人电泳槽平台上，用缓冲液先填满加样槽，避免槽内窝存气泡。接着再倒入大量 Tris-硼酸-EDTA缓冲液直至浸没过凝胶面2—3mm。

4、加样

将酶解后的DNA样品液与溴酚蓝-甘油溶液以4：1的体积比混合，用微量注射器别离加人到凝胶板的加样槽内．每一个糟加10ul左右。因此加样量不宜超过20ul，避兔因样品过量而溢出，污染临近样品，加样时，注射器针头穿过缓仲液警惕插人加样槽底部，但不要损坏凝胶槽，然后缓慢地将样品推动槽内让其集中沉于槽底部。

五、 电泳

加样完毕，将靠近样品槽一端连接负极．另一端连接正极（万万不要弄错），接通电源，开始电泳。在样品进胶前可用略高电压，防上样品扩散，样品进胶后，应操纵电压降不高于5V／cm(电压值V／电泳板两极之间距离比)．当染料条带移动到距离凝胶前沿约

lcm时，停止电泳。

六、染色

将电泳后的胶掏出，警惕椎至／ml溴乙锭染色液中，室温下浸泡染色30min。

7、 观看与拍照

警惕地掏出凝胶置托盘上，并用水轻轻冲洗胶表面的溴化乙锭溶液，然后再将胶板推至预先浸湿并铺在紫外灯观看台上的玻璃纸内，在波长254nm紫外灯下进行观看DNA存在的位置呈现橘红色荧光，肉眼可观看到清楚的条带．荧光在4一6小时后减弱，因此，初步观看后，应当即拍照记录下电泳图谱．观看时应戴上防护眼镜或有机玻璃防护面罩，幸免紫外光对眼睛的损害。

拍照时，照相机加上近摄圈和红色滤光铺头，用全色胶卷，56光圈，曝光时刻依照条带，荧光的强弱进行选择，10—60s．将电泳图谱底片适当放大为照片。

RNA的琼脂糖凝胶电泳

实验步骤

（1）用1×TAE电泳缓冲液制作琼脂糖凝胶，加1×TAE电泳缓冲液至液面覆盖凝胶。

（2）在超净工作台上，用移液器吸取总RNA样品4μl于封口膜上。在实验台上再加入5μl 1×TAE电泳缓冲液及1μl 的10X载样缓冲液，混匀后，警惕加入点样孔。

（3）打开电源开关，调剂电压至100V，使RNA由负极向正极电泳，约30min后将凝胶放入EB染液中染色5min,用清水略微漂洗。在紫外透射检测仪上观看RNA电泳结果。

RNA的变性琼脂糖凝胶检测

试剂：

（1）MOPS缓冲液（10*）:L 吗啉代丙烷磺酸（MOPS），L NaAc, 10mol/L EDTA。

（2）上样染料：50%甘油，1mmol/L EDTA ,%溴酚蓝，%二甲苯蓝。

（3）甲醛。

（4）去离子甲酰胺。v电泳槽清洗：去污剂洗干净（一样浸泡留宿）——水冲洗——乙醇干燥——3%H2O2灌满——室温放置10分钟——%DEPC水冲洗。

操作：

（1） 将制胶用具用70%乙醇冲冼一遍，晾干备用。

（2） 配制琼脂糖凝胶。

①称取0.5g琼脂糖，置干净的100ml 锥形瓶中，加入40ml蒸馏水，微波炉内加热使琼脂糖完全溶化均匀。

②待胶凉至60--70 ℃，依次向其中加入9ml甲醛、5ml 10X MOPS缓冲液和 溴化

乙锭，混合均匀。

③灌制琼脂糖凝胶。

（3） 样品预备：

① 取DEPC处置过的500ul小离心管，依次加入如下试剂： 10x MOPS缓冲液2ul，甲醛,甲酰胺（去离子）10ul，RNA 样品,混匀。

② 将离心管置于60℃水浴中保10分钟，再置冰上2分钟。

③ 向管中加入3ul 上样染料，混匀。

（4）上样。

（5）电泳：电泳槽内加入1XMOPS缓冲液，于ml 的电压下电泳。

（6）电泳终止后，在紫外灯下检查结果。

1） 电泳槽的处置：电泳槽可用氯仿浸泡30min，然后以3%H2O2浸泡30min，再用DEPC处置过的水冲洗干净备用。

2） 琼脂糖凝胶的配制：100ml电泳缓冲液中加入100μlDEPC，加入1g琼脂糖，室温12h以上再高压灭菌即可利用。

3） 上样电泳：

2 定量：

DNA模板的纯度、含量测定

260nm 1 OD

双链DNA 50μg /ml

单链DNA 40μg /ml

OD 260nm/ OD280nm ≈

RNA模板的纯度、含量测定

260nm 1 OD

单链RNA 40μg /ml

OD 260nm/ OD280nm ≈