百奥迈科生物技术有限公司Biomics Biotechnologies Co., Ltd 电话：0513‐85175207 传真：0513‐85175207 邮箱：jane@biomics.cn地址：江苏省南通市经济与技术开发区常兴路76号 邮编：226016 miRNA Q-PCR Detection Primer Set
z 概述：
microRNA(miRNA)是一类有大约22 个核苷酸组成的非编码小分子RNA，其广泛存在于真核生物中。miRNA 在个体发育的不同时期及不同组织中有不同的表达模式，都表明了其在发育和分化中起有重大的调控作用。迄今为此，对miRNA 的检测方法主要有Northern Blot 等基于分子杂交的方法，这些方法敏感度低、耗时长、RNA 的用量较大。miRNA Q-PCR Detection Kit 采用了国际上公认的核酸检测标准技术――Real-Time PCR 技术来对miRNA 进行检测，其具有快速、特异性强、灵敏度高等优点。
z 实验原理：
z 产品内容：
ID Description Qty. RT Primer miRNA Reverse Transcription Primer 2 nmol Forward Primer miRNA Forward Primer 2 nmol Reverse Primer Universal Reverse Primer 2 nmol
z 注意事项：
引物为干粉形式，需先离心，后每管加入200 μL Nuclease-Free H2O稀释至10μM，
混匀后于-20oC冻存备用；
干粉形式引物可在室温下稳定保存1年。稀释后溶液在-20oC，避免在4oC或室温
长期存放；
稀释后的溶液可先分装成小份冻存，避免多次反复冻融。
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miRNA Q-PCR Detection Primer Set
For the detection and quantification of miRNA using real-time PCR.
Catalog No.BK1010
一、组成和储存：
miRNA 定量检测引物包括以下组分，产品应在-20℃储存，避免在4℃或室温长期存放。
miRNA RT Primer miRNA Forward Primer miRNA Reverse Primer
200 rxns 200 rxns 200 rxns
-20℃ -20℃ -20℃
附送：U6 snRNA qPCR Primer Set（-20℃保存）
二、客户需提供的实验材料：
1. SYBR Green mix
最好以2×qPCR Mix 的形式提供，已混合了Taq 酶、dNTP、PCR Buffer、SYBR Green I 等试剂，即只需加入模板、引物即可进行定量PCR 反应，尽量避免加样误差及交叉污染。
2．逆转录酶
为了检测和定量您样品中的成熟miRNA，运用该试剂盒中的miRNA 特异逆转录引物进行逆转录反应是十分必要的。我们推荐使用如 MMLV 这样一些常用的逆转录酶。
3．RNA 酶抑制剂
为了保证 RNA 模板的完整性以及高质量的逆转录反应，我们推荐在逆转录反应体系中加入 RNA 酶抑制剂，其终浓度通常为 0.25 U/ml。
4．DNA 聚合酶
对于大多数的 PCR 反应来说，DNA 聚合酶的终浓度通常为每个反应0.05U/ml。
5．dNTP mix
dNTP Mix 等量 (25mM) 的dGTP, dTTP, dATP, and dCTP 混合液 (pH7.5).
三、实验步骤：
1．逆转录引物的配置
根据您的实验需要可以在该反应体系中同时加入1~45 个逆转录引物，而不影响检测效果。如果您需要用5S rRNA 或U6 snRNA 做对照，请同时配置Random Primer(6 mer)和Oligo(dT)做反转录引物，或者配置U6 Reverse Primer 作为反转录引物。取出miRNA RT Primer 引物工作液(5mM)，适当加入用户提供的Random Primer(6 mer)和Oligo(dT)混合引物组配置成反转录引物组。
如果没有后者，也可以用U6 Reverse Primer 引物工作液(5μM)做反转录引物，按下表加入相应比例的RNase-free H2O，配置为终浓度为62.5 nM 的反转录引物工作液(RT Primer Mix)。
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混合引物组 Primer（5μM） DEPC H2O 1 miRNA 1μl 79μl 2 miRNA 各1μl 78ul …… 各1μl …… N miRNA 各1μl 80-Nul N miRNA+Random 各1μl 80-N-1ul N miRNA+U6 各1μl 80-N-2ul
注：如果加入U6 做反转录引物，则可进行的Q-PCR次数将减少
2．逆转录反应体系的制备
miRNA 定量分析所用的模板可以是总RNA、细胞裂解产物或是纯化后的微小RNA。投入反应的 RNA 模板量可以根据实验的需要从0.2ng 到 200ng 或者更多。除了在 42℃反应比较稳定之外，对于逆转录反应及逆转录酶并没有特殊的要求，我们推荐您用 50ml 逆转录体系。更多的信息可以参阅你所使用的逆转录试剂的操作说明。
以下表格提供了一次 50ml 标准逆转录反应的体系：
试剂
RNA template
RT Primer Mix(62.5 nM)
使用量
X μl 4 μl
RT buffer 5X
dNTP mix(25mM each)
RNase inhibitor(40U/ μL) RT逆转录酶(200U/ μL) DEPC H2O 10 μl 4 μl 1 μl 1 μl to 50 μl
Total 50 μl
注：
1）请根据RNA 模板的体积计算需要加入DEPC H2O的量。
2) 请在每个反应中加入2μg 以上的总RNA 或者0.2ng 以上的miRNA 提取物。
3) 在逆转录反应之前须将除了逆转录酶外的各种试剂和逆转录mix 混匀，可用手指轻弹反应管，逆转录mix 可用移液器吸打几次，千万不要用振荡器。
3. miRNA 逆转录程序
标准的逆转录反应程序：42℃ 60 分钟，75℃ 10 分钟。
请把所有的试剂，反应的混合液和样品至于冰上操作。配置完成后，请将反应的混合液置于以 cDNA 合成的温度进行预热后的热循环仪上，立即开始逆转录反应。逆转录反应结束后立即将 cDNA 产物取出，快速置冰上冷却，后续所有步骤都在冰上进行，不要将 cDNA 产物随便从冰上移走。
4．miRNA 逆转录产物的操作
miRNA 实时定量分析，请先将逆转录产物混匀并且从中吸取2 μl（20 μl 体系）当作定量 PCR 的模板。请将剩余的 miRNA 逆转录产物存放于-20℃。（长期保存请置于-80℃）
5. miRNA实时定量 PCR反应液配置
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下列表格提供了实时定量PCR 50μl 的反应体系。： 试剂 使用量 2X SYBR Green Mix 25 μl RT product 5μl MiRNA Forward Primer（10 μM） 1 μl MiRNA Reverse Primer（10 μM） 1 μl DEPC H2O to 50 μl Total 50 μl
注：U6 snRNA的Q-PCR使用量请参照miRNA Primer的使用量。
11．miRNA实时定量 PCR反应程序 请您在定量PCR 仪上设定如下程序： 循环数 1 40
步骤 预变性 变性 退火延伸
温度 95℃ 95℃ 60℃
时间 20sec 10sec 20sec
检测 否 否 是
循环结束后请立即进行融解曲线分析： 检测温度 70℃-95℃ 室温
四、注意事项：
1）请严格按照基因扩增检验实验室的管理规范进行实验操作：如PCR实验严格分区操作；各区应有专用的手套、移液器等，不得交叉使用，避免污染；工作人员应遵循从一区到二区的单方向工作原则，各工作区相对隔离；进行PCR实验的工作桌面和及相关物品应定期用1%次氯酸钠、75%酒精、1M/L盐酸或紫外灯进行灭菌和消毒。
2）所用的吸头和离心管都需要经DEPC水处理，以灭活RNA酶，75%乙醇也要用DEPC处理过的水配制。
3）各试剂充分融化后请短暂离心。反应液分装时应尽量避免产生气泡。上机前应注意检查各反应管是否盖紧，以免污染仪器。
升温速率 0.5℃/次
恒温时间 1 sec/次 Hold
检测 是 否
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