牛栏山酒厂优良酿酒酵母的筛选及鉴定

王勇

【摘 要】白酒的发酵过程主要是酒精发酵和风味物质形成的过程.在白酒生产中,酒精发酵过程主要是由酿酒酵母通过糖酵解途径,将发酵中的糖类分解为二氧化碳和酒精,在生成酒精的同时,酿酒酵母还能够生成多种有机酸、高级醇及酯类物质,这些物质在基酒的风味中发挥重要作用.优良性状的酿酒酵母可以起到提高出酒率,增加风味物质含量,节约粮食的目的.牛栏山酒厂针对特定工艺,对大曲及发酵过程中微生物进行分离鉴定,获得20株酿酒酵母菌,并结合生化性能筛选实验,最终筛选出产酒精能力、耐酒精能力、发酵力以及发酵产物方面较为优秀的酿酒酵母菌2株,命名为Y006和Y008.将2株酿酒酵母菌分别制作成强化麸曲添加到酿酒生产实验中,均起到了增加乙酸乙酯,适量控制乳酸乙酯,降低杂醇油含量且提高出酒率的作用.%Liquor fermentation is the process of alcoholic fermentation and the formation of flavoring substances. In alcoholic fermen-tation, sugar is decomposed into carbon dioxide and alcohol through glycolysis by S.cerevisiae. At the same time, a variety of organic acids, higher alcohols and ester compounds are produced. Those substances play important roles in base liquor flavor. It can be con-cluded that S.cerevisiae strains with excellent performance are capable of enhancing liquor yield,

increasing flavoring compounds con-tent, and saving grains. In this study, 20 S.cerevisiae strains were isolated in Niulanshan Distillery. Through biochemical property screening test, two S.cerevisiae strains with excellent alcohol-producing capability, alcohohol resistance, fermenting power and fer-menting products were finally obtained and they were named Y006

and Y008. The two strains were used for the preparation of Fuqu and then used respectively in liquor-making, which could increase ethyl acetate, control ethyl lactate properly, reduce fusel oil, and in-crease liquor yield. 【期刊名称】《酿酒科技》 【年(卷),期】2017(000)004 【总页数】5页(P61-64,67)

【关键词】微生物;产酒精能力;耐酒精能力;酿酒酵母 【作 者】王勇

【作者单位】北京顺鑫农业股份有限公司牛栏山酒厂,北京 101301 【正文语种】中 文

【中图分类】TS262.3;TS261.1;TS261.4;Q93-3

在白酒生产中，酒精发酵过程主要是由酿酒酵母完成的，优良的酿酒酵母可以起到提高出酒率、改善基酒质量、节约粮食的作用。白酒生产中要求优良的酿酒酵母往往需要具有较强的产酒精能力、较高的耐酒精能力，而且会给成品酒带来优良的风味[1]。根据以上要求，以牛栏山酒厂生产用大曲和酒醅为材料，分离出酿酒酵母菌20株，并进行了耐酒精能力、产酒精能力以及发酵力和发酵产物等多方面的测定。综合分析，最终筛选出生化性能优良的酿酒酵母菌2株，并利用其进行麸曲强化添加实验，取得了良好的实验效果。 1.1 材料

1.1.1 分离纯化用培养基

YPD培养基：酵母浸粉10 g，蛋白胨20 g，葡萄糖20 g，琼脂20 g，水1 L。

1.1.2 TTC培养基

TTC上层培养基：TTC0.5 g、葡萄糖5 g、琼脂15 g、水1000m L。 TTC下层培养基：YPD琼脂培养基。 1.1.3 耐酒精性能筛选培养基

含8%vol～30%vol乙醇的8°麦芽汁培养基：试管内装入10m L灭菌的麦芽汁液体培养基，冷却后加入无水乙醇制成酒精度为8%vol、10%vol、12%vol……28%vol、30%vol的8°麦芽汁培养基。 1.1.4 高粱糖化液培养基

高粱粉碎后按高粱∶水=1∶8的比例混匀后，90℃水浴下糊化90m in，冷却到60℃，加入糖化酶，糖化2～3 h，煮沸5m in，双层纱布过滤，按体积加入30 g/100m L葡萄糖。

1.2 酵母的分离纯化及PCR鉴定 1.2.1 酵母菌分离

分别取清香型大曲及入池酒醅1 g，用9m L无菌水稀释，拟定为10-1的浓度。依次稀释为10-2、10-3、10-4、10-5、10-6浓度，分别吸取10-4、10-5稀释液0.1m L，接种到麦芽汁培养基平板中，用涂布棒均匀涂布。恒温培养箱中28℃培养3 d，肉眼观察培养基平板，根据酿酒酵母形态特征，随机挑选生长形态呈圆形、乳白色、菌落平坦稍凸起、有湿润感、光滑、边缘整齐的单菌落接入到新的麦芽汁培养基平板中，28℃培养3 d后观察菌种是否已纯化彻底，若不纯则按上述方法重新纯化直至出现单一菌种。 1.2.2 酿酒酵母鉴定

挑取少量活化的酵母菌体，于灭过菌的1.5m L离心管内；加入100μL裂解液（100mM Tris，30mM EDTA，0.5%SDS，pH 8.0，15 Pa灭菌30m in备用）；100℃水浴15m in；加入100μL 2.5M的醋酸钾溶液，冰浴60m in；4℃下

13000 r/m in离心5m in，取上清液200μL至0.5m L离心管中；加入等体积的氯仿-异戊醇（24∶1），剧烈振荡10m in，13000 r/m in离心15min，移取100μL上清液至0.5m L离心管中；加入100μL预冷的异丙醇，混匀后于-20℃下放置20m in；13000 r/m in离心15m in，弃上清液；用70%的酒精洗涤沉淀2次；沉淀过夜自然干燥；加入50μL已灭菌的超纯水，室温下溶解1 h，-20℃冰箱储藏备用。PCR扩增酵母菌D1/D2区，所用引物及PCR条件见表1。 PCR产物送公司测序后，用Chromas软件分析测序质量，去除峰图不可靠的部分对DNA序列进行手动校正，用校正后的序列在NCBI（http://www.

ncbi.nlm.nih.gov/blast）中进行同源序列搜索，比较该菌株在D1/D2序列上亲缘关系最近的已知酵母菌信息，包括模式菌株与实验菌株的碱基差异，近缘模式菌株GenBank序列号。目前所有已知酵母菌的核糖体D1/D2和ITS序列都已上传至数据库中，可在线搜索。因此，可以根据序列同源性初步判断待测菌株的分类地位。

本实验中共分离到疑似酿酒酵母35株，通过PCR鉴定后，确定酿酒酵母菌20株，编号为Y001—Y020（见表2）。 2.1 酵母的理化筛选实验方法 2.1.1 酵母TTC显色实验

将上述分离出的20株酿酒酵母菌分别接种到TTC显色培养基中，比较颜色深浅，作为其性能的参考，结果见表3。

结果分析：TTC显色剂对酵母的代谢产物发生呈色反应，通过它可以判断酵母中酶活力的大小，即酵母产酒精能力的强弱。产酒精能力强的酵母菌菌落呈深红色，次之为粉红色，野生酵母呈红色或粉红色，通过TTC显色实验结果看出，Y010、Y002、Y008、Y006、Y020为黑紫红色，颜色最深，初步推断出是产酒精能力最高的，可作为优良酿酒酵母筛选的参考依据。

2.1.2 耐酒精性能筛选

将20株酿酒酵母分别接入含8%vol～30%vol乙醇的麦芽汁中，28℃条件下培养60 h，分别在12 h、24 h、48 h和72 h时观察杜氏小管中的产气情况，结果见图1。

结果分析：虽然酒精是酿酒酵母的主要产物，但较高的酒精对酵母的生长依然起到一定的抑制作用。而在白酒发酵环境中，酒精的存在是不可避免的，所以具有较高耐酒精能力的酿酒酵母菌才能在发酵过程中生长良好。由耐酒精度实验柱状图可以看出，Y020耐酒精能力最强，达到20%vol，此外Y001、Y006、Y008、Y014也相对较强。

2.1.3 酿酒酵母发酵性能测定

将纯化好的酿酒酵母入到带发酵栓并含有100m L高粱糖化醪的150m L三角瓶中，发酵栓中装入10m L、5mol/L的硫酸阻止水分蒸发，28℃培养，每日称重，记录每日失重情况，待发酵结束时计算总失重，并测定其酒精含量，结果见图2、图3。

结果分析：通过菌种发酵失重图和产酒精实验图看出，Y006、Y008、Y020这3株酵母在失重实验和产酒精实验中数值均较高。

分析总结：通过TTC显色实验挑选出颜色最深的5株酵母为Y010、Y002、Y008、Y006、Y020。在耐酒精度实验中Y020为最高值22%vol，Y008为20%vol，Y001、Y006、Y014介于12%vol和16%vol之间。通过以上生化性能筛选实验确定Y006、Y008、Y020为初期优良酿酒酵母，将此3株菌种进行代谢产物分析以挑选最优菌株。 2.1.4 酵母产酯能力的测定

酯类是一类具有芳香性气味的化合物，多数呈果香，是白酒中重要的芳香物质，可在不同程度上赋予酒的香气，并决定香气的品质。

将Y006、Y008、Y020分别挑取1～2环加入到100m L麦芽汁液体培养基中，装好发酵栓，塞紧胶塞，用滴管向发酵栓内加入5mol/L硫酸，直至液面距发酵栓上出气口1 cm为止。置于28℃培养箱中进行发酵，每天摇匀称重，直至恒重。将产酯培养后恒重的发酵液转入500 m L平底烧瓶中，加入100m L、60%vol乙醇进行蒸馏，收集100m L馏分，气相色谱仪分析测定。选取普遍使用的商业用酿酒酵母作为对照参考，见表4。

结果分析：从各菌株所产风味物质来看，主要代谢产物为正丙醇、异戊醇、异丁醇、活性戊醇、β-苯乙醇、乙酸乙酯等。在清香型白酒中，乙酸乙酯赋予清香型白酒主体风味，Y006和Y008在产乙酸乙酯方面同对照相比提高了23.84%和30.38%；而影响白酒风味的主要杂醇油为正丙醇、异丁醇、异戊醇等，同对照相比，Y006、Y008产异丁醇分别降低了77.67%和60.57%，产异戊醇分别降低了62.59%和66.27%。由表4可看出，Y006、Y008均起到了增加乙酸乙酯，降低杂醇油的作用。

通过TTC显色实验、耐酒精度、菌种发酵失重、产酒精量和产酯产香及杂醇油产量测定，我们将菌株Y006、Y008确定为今后实验选用的优良酿酒酵母菌。 2.2 麸曲的制作

强化麸曲配方：麸皮65%，水35%，搅拌均匀，装入三角瓶中，121℃灭菌30m in。

将纯化的酵母斜面试管菌种取1环，接种到三角瓶中，28℃培养3 d。取出放入40℃烘干箱中烘干备用。 2.3 强化麸曲添加实验

将强化麸曲按投粮比例的3‰分别添加到大曲中拌匀，与大曲混合使用，其余按照清茬大曲酿酒工艺。蒸馏后得到的基酒分别称为Y006基酒、Y008基酒，将不添加强化麸曲的普通工艺的基酒称为对照基酒[4-5]。分别计算出酒率，并将3种

基酒分别降度至60%vol，气相色谱测定基酒骨架成分，结果见表5。

从表5可以看出，Y006基酒与Y008基酒同对照相比：在总酯和乙酯含量较对照基酒有不同程度提高。乙酸乙酯含量提高11.00%和39.31%，乳酸乙酯降低15.54%和5.55%，正丙醇含量略有上升，而异丁醇和异戊醇含量有较大幅度下降。出酒率见表6。

在原粮出酒率方面，添加强化麸曲的出酒率要高于不添加强化麸曲的出酒率，与对照基酒相比，Y006强化麸曲基酒出酒率提高了4.78%，Y008强化麸曲基酒出酒率提高了7.95%。

白酒酿造过程中的酵母主要分为酿酒酵母、产酯酵母以及酵母属的其他微生物，以牛栏山酒厂生产用清香大曲及酒醅为材料分离出酿酒酵母20株。分别进行了TTC显色实验，耐酒精能力、发酵能力和酒精产量的测定。综合考虑，挑选出Y006、Y008、Y020为初期优良酿酒酵母，随后对其进行代谢产物分析。与市售商业酿酒酵母相比，Y006、Y008具有高产乙酸乙酯，同时适当降低杂醇油含量的能力，最终将Y006、Y008确定为优秀酿酒酵母菌株，并制作成强化麸曲添加到酿酒实验中去。从基酒色谱分析及出酒率统计可以看出，添加Y006、Y008酿酒酵母进行强化发酵，有效提高基酒出酒率4.7%～7.9%，每班次全年可增产基酒6.6 t，为企业带来可观的经济效益。同时，通过强化菌种应用可适当提高基酒乙酸乙酯含量，降低乳酸乙酯含量，适量降低杂醇油含量，起到协调酒体，改善酒质的作用，提高了优质酒率。

酿酒酵母作为发酵中众多微生物的一种，在白酒的产酒和产香方面具有重要作用。根据酿酒酵母的理化性能及代谢产物差异，可以简便有效的筛选出优良菌株，并利用强化麸曲的添加方式进行发酵生产，达到改善基酒质量，提高基酒产量的目的。总体而言，优良的酿酒酵母可以起到提高出酒率和优质酒率，节约粮食，降低原酒

成本的作用，在白酒企业中具有较高的应用前景。

【相关文献】

[1]沈怡方.白酒生产技术全书[M].北京：中国轻工业出版社，1998：114-125. [2]钟卫鸿.基因工程技术实验指导[M].北京：化学工业出版社，2007：101-102.

[3]陈红歌,王明道.基因工程原理与实验指导[M].北京：中国轻工业出版社，2010：46-58. [4]王景芝，俞学锋.酵母生产与应用手册[M].北京：中国轻工业出版社，2005：94-283. [5]肖冬光.白酒生产技术[M].北京：化学工业出版社，2005：45-55.