PCR反应中Taq酶的选择

PCR反应中Taq酶的选择

随着分子生物学研究发展的不断广泛和深入，PCR已成为一门相当成熟的常规技术，而热聚合酶（即Taq酶）的合理选择是PCR成败与否的一个关键因素。目前市面上有多种Taq酶，能够满足多方面的实验需要。那么，如何选择最合适的Taq酶？根据用户经常考虑的指标，如特异性、保真性、耐热性、扩增速率、扩增片段长度、能否进行复杂模板扩增以及优化条件难易等等，我们在这儿将主要的Taq酶归归类，其性质、用途也就一目了然了。

高特异性Taq酶

高度特异性地扩增所需的片段是PCR最基本的要求，影响PCR特异性的因素很多，包括模板、引物性质及质量、反应条件的控制等等，而高特异性Taq酶的出现大大减少了摸条件这一繁琐的实验过程，也为PCR产物快速有效的纯化（PCR产物直接纯化）打下了基础。这类酶最典型的代表是热启动Taq酶。大家都知道，在PCR第一个循环变性之前，有一个升温的过程，引物和模板会有一些非特异性配对，如果这时Taq酶发挥活性，就很容易产生非特异性扩增，由于循环初期模板量非常少，产生的非特异性条带经过后面的指数扩增，就会严重干扰目的片段的扩增，甚至导致特异性条带不能扩出。而热启动Taq酶是必需经过高温才能激活的酶，因此在初始循环的变性之前它没有活性，不会产生非特异性扩增，这就大大提高了PCR扩增的特异性。第一代热启动Taq酶往往直接在Taq酶上做一些修饰，比如用抗体抑制，蜡封等，如Clontech、Stratagen、Gibcol-LTI的一些产品，由于抗体、蜡等异物的掺入，对实验造成一定的影响，也给试验者带来一些不便。新一代的热启动Taq酶是通过内部改造的重组酶，真正实现便利的热启动，代表产品如QIAGEN公司的HotStar系列，无需别的辅助抑制物，也不用担心抑制不稳定，使用起来方便、高效。此外，由于几乎所有的Taq酶产品都带有相应的反应缓冲液，缓冲液的品质

也对保证Taq酶特异性扩增起着不可忽视的作用，一般的缓冲液中调节H键作用的盐只有KCl，QIAGEN公司的缓冲体系通过 KCl、（NH4）SO4盐离子体系的平衡调节也提高了酶作用的特异性。

此外，热启动的Taq酶也是实现一步法RT-PCR的基础。如QIAGEN公司的OneStepRT-PCR试剂盒，在RT反应较低温度下，Taq酶没有活性，逆转录酶发挥活性；RT反应结束，高温灭活逆转录酶的同时，激活Taq酶，进行PCR反应。另一家公司Epicentre有一种MasterAmpTMTth DNA聚合酶，本身就具有逆转录酶活性，也可用作RT-PCR。

高保真Taq酶

下游应用为基因筛选、测序、突变检测，分子诊断等等的用户，往往对PCR保真性要求很高，保真性的一个通用标准是错配率，错配率越低保真性越好。普通Taq酶的错配率在2-5X10-5碱基/循环数，而高保真Taq酶错配率可达10-6数量级，大大降低了出错的可能。其原理主要是因为高保真Taq酶具有3‘到5’核酸外切酶（Proofreading）的活性，扩增途中如果产生了错配的碱基，它可以将其切掉，从而保证了扩增的准确性。需要提醒用户的是由于此酶具有核酸外切酶功能，往往扩增效率低一些，有的还容易降解引物，且产物一般不宜用TA或UA克隆法克隆。目前市面上主要有两类产品，一类是混合型的高保真酶，将带有Proofreading活性的酶与普通Taq酶（用于提高扩增效率）混合起来，错配率在8-9X10-6碱基/循环数。Clontech、LTI等公司都有此类产品。如果要求更高的保真度，就要选择单一型的高保真酶，如Stratagene的Pfu，NEB公司的Vent DNA 聚合酶，错配率5.7 X10-5碱基/循环数；QIAGEN公司新推出的ProofStart DNA聚合酶，兼特异性与保真性于一体，其聚合酶及Proofreading活性都为热启动，可避免引物降解，错配率达2-4×10-6碱基/循环数，加上优化的反应体系，可在室温下配置反应液，可进行复杂模板（高GC含量、二级结构）及长片段的扩增，的确是这类酶中的佼佼者。

高耐热性Taq酶

对于有些模板变性温度较高，需要时间较长的用户，可能要求高耐热性Taq酶，这里介绍NEB公司的Vent和Deep Vent DNA聚合酶系列，两者都是从海底火山口分离出来后克隆的，是普通Taq酶耐热性的三倍以上，前者在95℃半衰期近7小时，100℃近2小时；后者更甚，分别为23小时和8小时。

超长片段扩增Taq酶

对于作基因组图谱、测序及分子遗传学研究的用户，可能会用到超长片段的扩增，Clontech公司的Advantage Genomic系列混有Tth DNA聚合酶，Proofreading酶和热启动抗体，对复杂模板可扩增10kb片段，简单模板可达40kb。

关于复杂模板的扩增

对于模板结构复杂，如GC含量高（>60%），有二级结构等，普通的Taq酶可能难以延伸下去，加入DMSO等助熔剂可帮助扩增顺利进行，但 DMSO有毒，而且用量需要优化。QIAGEN公司的任何一种Taq酶都附有特制的Q-溶液，操作方便、安全，对复杂模板的扩增特别有效。

关于条件的优化

现下很多著名的生物试剂公司都提供优化的缓冲液，如QIAGEN公司的缓冲体系，对温度和Mg2+的耐受性很强，随试剂盒有推荐的操作手册，大大减少了反应条件的优化，如果结合好的引物设计软件和高质量的模板引物，一次成功率极高。但任何东西都不是万

能的，如果碰到比较特殊的情况，还需要仔细分析，优化调整。

以上就Taq酶的一些基本分类分别进行了介绍，具体选购时要根据实验需要择其重点，再参照其他参数，才能选到最合适的Taq酶。我们会及时将最新的技术和产品推荐给大家，希望能帮助大家更快更好的达到实验目的。

增加PCR特异性的八个方面

1、引物设计

细心地进行引物设计是PCR中最重要的一步。理想的引物对只同目的序列两侧的单一序列而非其他序列退火。设计糟糕的引物可能会同扩增其他的非目的序列。下面的指导描述了一个可以增加特异性的引物所具有的令人满意的特点：

① 典型的引物18到24个核苷长。引物需要足够长，保证序列独特性，并降低序列存在于非目的序列位点的可能性。但是长度大于24核苷的引物并不意味着更高的特异性。较长的序列可能会与错误配对序列杂交，降低了特异性，而且比短序列杂交慢，从而降低了产量。

② 选择GC含量为40％到60％或GC含量映像模板GC含量的引物。

③ 设计5'端和中间区为G或C的引物。这会增加引物的稳定性和引物同目的序列杂交的稳定性。

④ 避免引物对3'末端存在互补序列，这会形成引物二聚体，抑制扩增。

⑤ 避免3'末端富含GC。设计引物时保证在最后5个核苷中含有3个A或T。

⑥ 避免3'末端的错误配对。3'端核苷需要同模板退火以供聚合酶催化延伸。

⑦ 避免存在可能会产生内部二级结构的序列，这会破坏引物退火稳定性。

目的序列上并不存在的附加序列，如限制位点和启动子序列，可以加入到引物5'端而不影响特异性。当计算引物Tm值时并不包括这些序列，但是应该对其进行互补性和内部二级结构的检测。

有时候，对于引物设计仅了解有限的序列信息。比如，如果仅知道氨基酸序列，可以设计兼并引物。兼并引物是指代表编码单个氨基酸所有不同碱基可能性的不同序列的混合物。为了增加特异性，可以参考密码子使用表，根据不同生物的碱基使用偏好，减少兼并性。次黄嘌呤可以同所有的碱基配对，降低引物的退火温度。不要在引物的3'端使用兼并碱基，因为3'端最后3个碱基的退火足以在错误位点起始PCR。使用较高的引物浓度（1μM到3μM），因为许多兼并混合物中的引物不是特异性针对目的模板。

2、引物退火温度

引物的另一个重要参数是熔解温度（Tm）。这是当50％的引物和互补序列表现为双链DNA分子时的温度。Tm对于设定PCR退火温度是必需的。在理想状态下，退火温度足够低，以保证引物同目的序列有效退火，同时还要足够高，以减少非特异性结合。合理的退火温度从55℃到70℃。退火温度一般设定比引物的Tm低5℃。

设定Tm有几种公式。高盐溶液中的杂交，适用于小于18碱基的引物。根据GC含量

估算Tm。确定引物Tm最可信的方法是近邻分析法。这种方法从序列一级结构和相邻碱基的特性预测引物的杂交稳定性。大部分计算机程序使用近邻分析法。

根据所使用的公式及引物序列的不同，Tm会差异很大。因为大部分公式提供一个估算的Tm值，所有退火温度只是一个起始点。可以通过分析几个逐步提高退火温度的反应以提高特异性。开始低于估算的Tm5℃，以2℃为增量，逐步提高退火温度。较高的退火温度会减少引物二聚体和非特异性产物的形成。为获得最佳结果，两个引物应具有近似的Tm值。引物对的Tm差异如果超过5℃，就会引物在循环中使用较低的退火温度而表现出明显的错误起始。如果两个引物Tm不同，将退火温度设定为比最低的Tm低5℃。或者为了提高特异性，可以在根据较高Tm设计的退火温度先进行5个循环，然后在根据较低Tm设计的退火温度进行剩余的循环。这使得在较为严紧的条件下可以获得目的模板的部分拷贝。

3、递减PCR

递减PCR通过在PCR的前几个循环使用严紧的退火条件提高特异性。循环开在比估算的Tm高大约5℃的退火温度下开始，然后每个循环降低1℃到2℃，直到退火温度低于Tm 5℃。只有同同源性最高的目的模板会被扩增。这些产物在随后的循环中继续扩增，并会将扩增的非特异性产物排挤出去。递减PCR对于那些不了解引物和目的模板同源性程度的方法较为有用，如AFLP DNA指纹分析。

4、引物浓度

引物的浓度会影响特异性。最佳的引物浓度一般在0.1到0.5μM。较高的引物浓度会导致非特异性产物扩增。

为了确定引物浓度，可以在260nm（OD260）测量光密度值。然后使用光吸收值和微摩消光系数的倒数（nmol/OD），通过Beers法则计算引物浓度。与大分子双链DNA可以使用平均消光系数不同，确定引物的精确浓度必须使用计算的消光系数。这是因为引物较短，碱基组成差异很大。在Gibco/BRL定制引物的质检报告中包含了消光系数（OD/μmol）和消光系数的倒数（μmol/OD）。另外，不要使用寡聚核苷酸作为标准，在EB染色的胶上估算引物浓度，因为引物和标准的染色能力根据序列不同而差异很大。

5、引物纯度和稳定性

定制引物的标准纯度对于大多数PCR应用是足够的。因脱盐而除去的苯甲酰基和异丁酰基很少，因此不会干扰PCR。部分应用需要纯化，以除去在合成过程中的任何非全长序列。这些截断序列的产生是因为DNA合成化学的效率不是100％。这是个循环过程，在每个碱基加入时使用重复化学反应，使DNA从3'到5'合成。在任何一个循环都可能失败。较长的引物，尤其是大于50个碱基，截断序列的比例很大，可能需要纯化。

引物产量受合成化学的效率及纯化方法的影响。Life Technologies以一个最小OD单位确保总寡核苷的产量。定制引物以干粉形式运输。最好在TE重溶引物，使其最终浓度为100μM。TE比去离子水好，因为水的pH经常偏酸，会引起寡核苷的水解。

引物的稳定性依赖于储存条件。应将干粉和溶解的引物储存在-20℃。以大于10μM浓度溶于TE的引物在-20℃可以稳定保存6个月，但在室温（15℃到30℃）仅能保存不到1周。干粉引物可以在-20℃保存至少1年，在室温（15℃到30℃）最多可以保存2个月。

6、热启动

热启动PCR是除了好的引物设计之外，提高PCR特异性最重要的方法之一。尽管Taq DNA聚合酶的最佳延伸温度在72℃，聚合酶在室温仍然有活性。因此，在进行PCR反应配制过程中，以及在热循环刚开始，保温温度低于退火温度时会产生非特异性的产物。这些非特异性产物一旦形成，就会被有效扩增。在用于引物设计的位点因为遗传元件的定位而受限时，如site-directed突变、表达克隆或用于DNA工程的遗传元件的构建和操作，热启动PCR尤为有效。

限制Taq DNA聚合酶活性的常用方法是在冰上配制PCR反应液，并将其置于预热的PCR仪。这种方法简单便宜，但并不能完成抑制酶的活性，因此并不能完全消除非特异性产物的扩增。

热启动通过抑制一种基本成分延迟DNA合成，直到PCR仪达到变性温度。包括延缓加入Taq DNA聚合酶在内的大部分手工热启动方法十分烦琐，尤其是对高通量应用。其他的热启动方法使用蜡防护层将一种基本成分，入镁离子或酶，包裹起来，或者将反应成分，如模板和缓冲液，物理地隔离开。在热循环时，因蜡熔化而把各种成分释放出来并混合在一起。象手动热启动方法一样，蜡防护层法比较烦琐，易于污染，不适用于于高通量应用。

Platinum DNA聚合酶对于自动热启动PCR来说方便高效。Platinum Taq DNA聚合酶的成分为复合有抗Taq DNA聚合酶单克隆抗体的重组Taq DNA聚合酶。抗体在PCR配制，以至于在室温的延时保温过程中抑制酶的活性。Taq DNA聚合酶在变性步骤的94℃保温过程中被释放到反应中，恢复了完全的聚合酶活性。同经化学修饰用于热启动的Taq DNA聚合酶相比，Platinum酶不需要在94℃延时保温（10到15分钟）以激活聚合酶。使用PlatinumTaq DNA聚合酶，在94℃进行2分钟就可以恢复90％的Taq DNA聚合酶活性。

7、镁离子浓度

镁离子影响PCR的多个方面，如DNA聚合酶的活性，这会影响产量；再如引物退火，这会影响特异性。dNTP和模板同镁离子结合，降低了酶活性所需要的游离镁离子的量。最佳的镁离子浓度对于不同的引物对和模板都不同，但是包含200μM dNTP的典型PCR起始浓度是1.5mM（注意：对实时定量PCR，使用3到5mM带有荧光探针的镁离子溶液）。较高的游离镁离子浓度可以增加产量，但也会增加非特异性扩增，降低忠实性。为了确定最佳浓度，从1mM到3mM，以0.5mM递增，进行镁离子滴定。为减少对镁离子优化的依赖，可以使用Platinum Taq DNA聚合酶。Platinum Taq DNA聚合酶能够在比Taq DNA聚合酶更广的镁离子浓度范围内保持功能，因此仅需较少的优化.

8、促进PCR的添加剂

退火温度，引物设计和镁离子浓度的优化足以对大多数模板进行高特异性的扩增，但是，某些模板，包括高GC含量的模板，需要其他的措施。影响DNA熔解温度的添加剂提供了提高产物特异性和产量的另外一种方法。为获得最好的结果需要模板的完全变性。另外，二级结构会阻止引物结合和酶的延伸。PCR添加剂，包括甲酰胺，DMSO，甘油，甜菜碱以及PCRx Enhancer Solution可以增强扩增。它们可能的机理是降低熔解温度，从而有助于引物退火并辅助DNA聚合酶延伸通过二级结构区。PCRx Solution还有其他优点。在同Platinum Taq DNA聚合酶和Platinum Pfx DNA聚合酶一起使用时，仅需很少的镁离子优化。这样，将Platinum技术同添加剂结合，增强了特异性，同时减少了第三种方法-镁离子优化的依赖。为获得最佳结果，应优化添加剂的浓度，尤其是会抑制Taq DNA聚合酶的DMSO，甲酰胺和甘油。

PCR反应体系的循环参数

1、变性温度和时间：

模板DNA和PCR产物的变性不充分是PCR失败的主要原因。适宜的变性条件是95℃ 30s或97℃15s。变性不完全，DNA双链会很快复性，因而减少产量。在变性中，温度太高或反应时间过长，会导致酶活性的损失。Taq DNA聚合酶活性的半寿期：92.5℃为2h以上，95℃为40min，97℃为5min。

2、复性温度和时间：

复性温度决定PCR的特异性，而引物退火温度和所需时间长短取决于反应体系中的基本组成及扩增引物的长度和浓度，实际使用的退火温度要比扩增引物的Tm值低5℃。增加退火温度会增加引物的识别，同时可降低引物3端核苷酸的错误延伸。因此，提高退火温度，特别是在前几个循环中，会增加扩增的特异性。而且为了在循环开始获得最高的特异性，应在第一次变性之后，引物退火之前加入Taq DNA聚合酶。复性时间一般为30～60s。

3、延伸温度和时间：

引物延伸温度一般为72℃，延伸的时间决定于扩增模板的长度，小于1kb的片段一般1～2min，而10kb的片段可能需要15min或更长时间。不合适的延伸温度不仅会影响扩增产物的特异性,亦会影响其产量。

4、循环数：

在25～30个循环内，扩增DNA增加明显，需要进一步增加产量时，可将第一次PCR

产物稀释后再扩增，而不要盲目增加循环数，以免增加非特异扩增。