Aug，2010JOURNALOFBIOLOGY
第27卷第4期2010年8月
doi∶10.3969/j．issn．1008－9632．2010.04．005
细胞色素P450nor在大肠杆菌中的克隆表达及分离纯化
12311
陈舒丽，刘德立，蔡朝晖，刘汉才，罗德生
（1．咸宁学院基础医学院，湖北咸宁437100；2．华中师范大学生命科学学院，湖北武汉410079；3．咸宁学院化学与生命科学学院，湖北咸宁437100）
摘
p450nor，要：研究改造了原有的未能高效表达的重组表达载体pRSET-通过PCR方法，去除了P450nor起始密码
子ATG上游的59个碱基序列。将真菌细胞色素P450nor基因首先克隆至克隆载体pBluescriptII上，然后亚克隆到28上，p450nor。该基因在30℃、0.1mMIPTG诱导下在大肠杆菌中获得到了重组表达载体pET-高效表达载体pET-P450nor。SDS-PAGE蛋白电泳表明在45kD处出现强特异性带。将大量表达的重组蛋白得高效表达融合蛋白His-NTA亲和层析柱纯化，得到了单一的目的条带。用Ni-关键词：细胞色素P450nor；克隆；表达；大肠杆菌中图分类号：Q503；Q78
文献标识码：A
文章编号：1008－9632（2010）04－0005－03
CloningexpressionandpurificationofcytochromeP450norinEscherichiacoli
CHENShu-li1，LIUDe-li2，CAIZhao-hui3，LIUHan-cai1，LUODe-sheng1
（1．Basismedicalcollege，XianningCollege，Xianning437100；2．CollegeofLifeScience，HuazhongNormalUniversity，Wuhan430079；3．CollegeofChemistryandlifeScience，XianningCollege，Xianning437100，China）
Abstract：P450norgenewasamplifiedbyPCRusingpreviouslyconstuctedpRSET-p450norastemplate．59bpoftheupstreamse-quenceofP450norgenewasdeleted．TherecombinantplasmidpBlue-p450norwasconstructedbyinsertingPCRfragment，i．e．p450norwassub-clonedintotheprokaryoticex-P450norgene，intocloningvectorpBluescriptII．ThentheP450norgenefrompBlue-pressionvectorpET-28toconstructrecombinantexpressionplasmidspET-p450nor．ThepET-p450norwastransformedintoEscherichiaP450norwashighat30℃after0.1mMIPTGinducing．SDS-PAGEanaly-coliBL21．TheexpressionlevelofrecombinantproteinHis-sisshowedaspecificband（about45kD）．Itindicatedthatthetargetproteinwasexpressedsuccessfully．Theover-expressedcyto-chromeP450norwaspurifiedtoelectrophoretichomogeneitybythefacilitationofmetal（Ni2+）chelateaffinitychromatography．Asin-gleband，about45kD，wasdetected．
Keywords：cytochromeP450nor；cloning；over-expression；purification
细胞色素P450是一类能与CO结合，形成的复合
［1］
物在450nm附近有最大吸收峰的血红蛋白的总称。已经发现的细胞色素P450超过3000种，从细菌到高
［2］
等动、植物都普遍存在这种蛋白。它可催化多种生化反应，在外源性和内源性化合物代谢中起着非常重
［3］
要的作用。
细胞色素P450nor是一类独特的细胞色素P450，
收稿日期：2009－03－20；修回日期：2009－05－31基金项目：国家自然科学基金（No．30170011）作者简介：陈舒丽（1980－），女，硕士；
E-mail：jxa12419@126．com。通讯作者：罗德生（1950－），男，教授，
虽然它属于P450超家族，但没有单加氧酶活性
［4］
。它
在真菌反硝化中起着NO还原酶的作用，能以NAD（P）H为直接电子供体将NO还原成N2O［5］。其催化
+
机制如下：2NO+NAD（P）H+H→N2O+NAD（P）
+
+
H2O。反硝化在大气氮循环中起着重要的作用［6］，可使其转变为N2或去除污水中的硝酸盐或亚硝酸盐，
N2O。细胞色素P450nor在真菌的反硝化中起着重要的作用，所以研究细胞色素P450nor，对污水的治理将有非常重要的价值。虽然已有5种真菌细胞色素P450nor被克隆和测序［7－8］，但重组细胞色素P450nor却一直未能高效表达。这就极大地限制了对细胞色素
5
生物学杂志Vol．27No．4
Aug，2010JOURNALOFBIOLOGY
第27卷第4期2010年8月
P450nor作用机理以及酶结构与功能的研究。本研究改造了原来构建的未能高效表达的表达载体pRSET-p450nor，去除了P450nor基因上游59个碱基序列，并
28在大肠杆菌中构建了重组利用高效表达载体pET-p450nor，细胞色素pET-为细胞色素P450nor的高效表达和分离纯化奠定了良好的基础。11．11．1．11．1．2
材料与方法材料
菌株与质粒
大肠杆菌TG1、BL21，质粒载体
22．1
实验结果
p450nor的构建和鉴定。重组质粒pBlue-细胞色素P450nor的克隆
以pRSET－
2．1．1
p450nor为模板，PCR扩增细胞色素P450nor基因。PCR产物检测结果见图1。
pBluescriptⅡ，pET-28a，均由本室保存。
T4工具酶及主要试剂DNA限制性内切酶、
DNA连接酶均为TaKaRa公司产品。DNAMarker及低
分子量蛋白质标准购于华美生物工程公司。1．2方法1．2．1
细胞色素P450nor的克隆PCR方法扩增细
胞色素P450nor片段。根据P450nor核苷酸序列设计
P450nor基因核苷酸序列及编码蛋白质序列见引物，
GenBank，登记号为：D78512。引物序列为：
P1：5'CGGGATCCATGCACGCTACCGAAGACGA3'；P2：5'CCCAAGCTTGCCATCTGTCATCCATCTACCA3'。下划线部分为酶切位点，分别是：BamHI和HindIII。
95℃变性反应程序为：95℃加热预变性5min后，30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环，72℃延
4℃保温。伸10min，1．2．2
蛋白质的原核表达
将含有重组表达质粒
pET-p450nor的大肠杆菌单菌落接种到5mL含相应抗
37℃培养过夜。然后以1∶100稀生素的LB培养基上，
释到新鲜的培养基中，培养约2h使其OD600值约为0.6，加IPTG至终浓度为0.1mM，在30℃诱导不同时SDS-PAGE检测表达结果。间取出制样，1．2．3
目的蛋白的大量制备
将含有重组表达质粒
的大肠杆菌单菌落接种到5mL含相应抗生素的LB培37℃培养过夜。按1∶100体积比将过夜培养养基中，
培养2～4h，待OD600物转移至200mL新鲜培养基中，
30℃诱导值达0.6时，加入IPTG（终浓度为0.1mM），培养8h。4000r/min离心30min收集菌体，用10mL裂13000r/min离解缓冲液重悬菌体。冰浴中超声破碎，心30min，取上清保存备用。1．2．4
Ni-NTA亲和层析柱分离纯化蛋白质
用10倍
体积的H2O和10倍体积的裂解缓冲液依次平衡Ni-NTA树脂。取10mL超声波上清液上样，待流尽后加入15mL漂洗缓冲液漂洗杂蛋白，最后用洗脱缓冲液洗脱PAGE电泳检测。目的蛋白，用EP管分步收集。SDS-图3
pET－p450nor的酶切鉴定
图4
P450nor蛋白的SDS－PAGE分析
图1PCR产物电泳图
图2pBlue－p450nor的酶切鉴定
Fig1ProductofPCR1：PCR产物；2：Marker
Fig2AnalysisofpBlue-p450nor1：Marker；2：pBlue－p450nor；3：BamHⅠ/HindⅢ双酶切pBlue－p450nor；4：HindⅢ单酶切pBlue－p450nor
2．1．2p450nor的构建和鉴定重组质粒pBlue-限制
性内切酶BamHⅠ/HindⅢ双酶消化回收的PCR产物，将p450nor基因片段克隆到载体pBluescript构建成重p450nor。构建的重组质粒pBlue-组克隆载体pBlue-p450nor转化大肠杆菌TG1，用Amp平板筛选阳性克隆，提取重组质粒DNA。用BamHⅠ/HindⅢ双酶消化p450nor，有一外源片段放出，且大小与重组pBlue-p450nor基因相等，约1．3kb。证明重组质粒pBlue-p450nor构建成功（见图2）。
Fig3AnalysisofpET-p450nor
Fig4AnalysisofpET-p450norbySDSPAGE
1：pET－p450nor；2：BamHⅠ/Hind1：BL21；2：E．colipET－p450norIPTG
；3：E．colipET－p450norIPTG
Ⅲ双酶切pET－p450nor；3：HindⅢ未诱导
2h；4：E．colipET－p450norIPTG
单酶切鉴定pET－p450nor；4：Marker诱导
诱导4h；5：E．colipET－p450norIPTG
诱导6h；6：E．colipET－p450norIPTG诱导8h；7：Marker
6生物学杂志Vol．27No．4
Aug，2010JOURNALOFBIOLOGY
第27卷第4期2010年8月
2．2
p450nor的构建和鉴定重组表达质粒pET-限制性内切酶BamHⅠ/HindⅢ双酶消化pBlue-
GCAGCTGCGGGCCCCCCCTCGAGGTCGACGTATCACGATAAACAACATG，下划线部分为起始密码子ATG与
BamHⅠ酶切位点之间的59个碱基序列。为了探明重组细胞色素pRSET－p450nor未能高效表达是否与这59个碱基序列有关，我们进行了p450nor基因的亚克隆。引物设计从ATG开始，去除了p450nor基因ATG上游的59个碱基序列。以pRSET－p450nor为模板进行PCR扩增，并将PCR产物首先克隆至克隆载体pBluescriptII，28上进而亚克隆至高效表达载体pET-面，结果实现了P450nor的高效表达。因此我们初步断定pRSET－p450nor未能高效表达的原因与p450nor基因ATG上游的59个碱基序列有关。
细胞色素P450nor在真菌反硝化中起着重要作用。本研究在原核中高效表达了细胞色素P450nor，为该蛋白的结构研究奠定了物质基础，并将为探讨细胞色素P450nor与真菌反硝化的分子机理奠定良好的基础。
参考文献：
1］FryeRF．ProbingtheworldofcytochromeP450enzymes［J］．Mo-［
lecularInterventions，2004，4（3）：157－162．
［2］NelsonDR，KoymansL，KamatakiT，etal．P450superfamily：up-dateonnewsequences，genemapping，accessionnumbersandno-1996，6（1）：1－42．menclature［J］．Pharmacogenetics，
p450nor，回收P450nor基因片段，将P450nor基因片段
28，亚克隆到表达载体pET-构建重组表达载体pET-p450nor。构建的重组表达质粒pET-p450nor转化大肠
杆菌TG1，用Kan平板筛选阳性克隆。提取重组质粒DNA，经BamHⅠ/HindⅢ双酶鉴定证明原核重组表达
p450nor构建成功（如图3）。质粒pET-2．3
P450nor基因在大肠杆菌中的表达及鉴定p450nor转化大肠杆菌将重组表达质粒pET-BL21，PAGE分析表达产物加入IPTG诱导表达，SDS-（图4）。结果表明：表达蛋白的分子量约为45kD。不
加IPTG，仅有极少量P450nor蛋白合成，与推测的P450nor分子量基本一致。
图5P450nor蛋白纯化前后的SDS－PAGE分析
图6未去除ATG上游59个碱基序列
［3］ShounH，FushinobuS．Physiologicalfunction，reactionmechanism，
andstructureofcytochroneP450nor［J］．Seikagaku，2008，80（6）：560－568．
［4］DaiberA，ShounH，UllrichV．Nitricoxidereductase（P450nor）
fromFusariumoxysporum［J］．JInorgBiochem，2005，99（1）：185－193．
［5］LehnertN，PraneethVK，PaulatF．Electronicstructureofiron（II）-porphyrinnitroxylcomplexes：molecularmechanismoffungalnitric．JComputChem，2006，27（12）：oxidereductase（P450nor）［J］1338－1351．
［6］GallowayJN，TownsendAR，ErismanJW，etal．Transformationof
thenitrogencycle：recenttrends，questions，andpotentialsolutions［J］．Science，2008，320（5878）：889－892．
［7］ZhouJG，JiangY，LiuDL，etal．Over-expressionoffungalcyto-chromeP450norgeneinSf9cellsbyusingbac-to-Bacbaculovirusex-pressionsystem［J］．ActaMicrobiologicaSinica，2004，44（2）：177－181．
［8］KayaM，MatsumuraK，HigashidaK，etal．Cloningandenhanced
expressionofthecytochromeP450norgene（nicA；CYP55A5）enco-dingnitricoxidereductasefromAspergillusoryzae［J］．BiosciBio-technolBiochem，2004，68（10）：2040－2049．
Fig5AnalysisresultofP450nor
bySDSPAGE
1：BL21；2：E．colipET－p450norIPTG未诱导；3：E．colipET－p450norIPTG诱导8h；4：超声波上清；5：超声波沉淀；6：Ni－NTA柱层析纯化后蛋白；7：Marker
时P450nor蛋白的SDS－PAGE分析Fig6AnalysisresultofP450norbySDSPAGEwithoutremovalofATGwith59bp1：Marker；2：BL21；3：E．colipET－p450norIPTG未诱导；4：E．colipET－p450norIPTG诱导2h；5：E．colipET－p450norIPTG诱导4h；6：E．colipET－p450norIPTG诱导6h
2．4
细胞色素P450nor的分离纯化
Ni-NTA亲和层析柱分离纯化细胞色素P450nor。
SDS-PAGE分析结果表明：在大肠杆菌中表达的细胞
NTA亲和层析柱一次纯化后，色素P450nor经Ni-杂蛋纯化的目的蛋白基本上为单一谱带。纯白明显减少，
化达到预期效果（如图5）。3
讨论
p450nor一直未能高效表达重组细胞色素pRSET-（如图6），为了探究其不能高效表达的原因，我们首先进行了测序。测序结果表明p450nor基因起始密码子
ATG与载体pRSET连接的BamHⅠ酶切位点之间有59个碱基序列，即p450nor基因上游序列的59个碱基序列。部分测序结果如下：GGATCCGACCTCGAGATCT7
因篇幅问题不能全部显示，请点此查看更多更全内容