实时荧光定量PCR检测乙型肝炎病毒DNA的研究

摘要】 探讨：乙型肝炎血清标志物和乙型肝炎病毒DNA量之间的关系，分析荧光定量PCR在乙型肝炎检测中的作用。 HBVDNA定量是目前诊断乙型肝炎、判断病毒复制和评价患者肝脏病变、预后及药物疗效的重要指标之一，但在指导诊疗时仍需结合血清标记物、肝损害指标乃至HBV基因分型。方法：PCR核酸探针杂交法、RELISA、竞争定量PCR、实时荧光定量PCR，本文综述定量检测HBVDNA意义及PCR检测方法。结论: 实时荧光定量PCR检测乙型肝炎病毒DNA是反映HBV复制水平的可靠指标，有助于疾病的诊断及预后判断。

【关键词】 乙型肝炎病毒 核糖核酸 实时荧光定量PCR

全世界超过20亿人感染过乙肝病毒，大约3. 5亿人为乙型肝炎患者，每年约有100万人死于乙型肝炎病毒相关的肝硬化和肝癌。而我国更是全球乙型肝炎的高发国家之一，人群乙型肝炎病毒HbsAg的携带率高达10%。多年以来临床诊断HBV感染情况通常采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测乙肝病毒血清标志物模型(HBV -M，俗称两对半)，以了解和判断乙型肝炎病毒在体内的复制水平、传染性强弱等，对乙型肝炎的诊断、抗病毒疗效观察及预后判断均具有重要意义。实时荧光定量PCR是近几年发展起来的，可以定量检测HBV-DNA，由于其灵敏、快速、假阴、假阳性率极低，该技术已被广泛应用于临床检测，结合ELISA检测能够更为精确地了解HBV的感染情况。以下就对HBVDNA定量在诊断治疗上的定量原理和意义、定量方法作综述，探讨乙型肝炎血清标志物和乙型肝炎病毒DNA数量之间的关系，分析荧光定量PCR在乙型肝炎检测中的作用。

1HBVDNA含量与血清标记物(HBVM)的关系 1.1 HBVDNA含量与HBeAg抗HBe

HBeAg阳性是病毒复制活跃的标志，HBeAg阳性与检出HBVDNA的符合率接近100%，两者存在极强的相关性。一般认为若HBeAg阴性或抗 HBe阳性，则提示HBV复制减弱，病情得到控制。但大量文献指出，HBeAg转阴或抗HBe的出现并不说明病毒复制被控制，约50%抗HBe阳性的患者 血清检出HBVDNA。单春梅等指出这可能是因为HBVDNA前C／C区基因变异，1896位G→A突变，原来TGG变成终止子(TAG)，丧失 HBeAg合成分泌功能，逃脱细胞毒T淋巴细胞(CTL)的免疫攻击。这种变异在我国乙肝患者中普遍存在，是导致病情迁延、发生慢性肝炎、甚至肝硬化重要原因之一。 1.2 HBVDNA含量与HBsAg／抗HBs

HBsAg阳性代表机体感染HBV，不代表复制情况；HBsAb为中和抗体，标志着机体产生免疫力。HBsAg阴性不能排除HBV的感染，Liang等报道36例HBV M均阴性的慢肝患者，PCR检测有11例(31%)HBVDNA阳性。范火亮从健康体检者抽取100份全阴标本，其中有2份PCR检测HBVDNA 为阳性，说明ELISA检测HBV M全阴并不表示无HBVDNA复制。分析可能有几种原因：HBV的S区点突变导致HBsAg抗原性改变，HBsAg不被检出；急性感染的窗口 期；HBsAg检测方法灵敏度不足；血清亚型的漏检等。

1．3 HBVDNA含量与HBV前S1蛋白(PreS1)、前S2蛋白(PreS2)、大蛋白(LP)的关系 PreS1具有高度的免疫原性，在HBV感染和机体免疫应答过程中起重要作用，PreS1在乙肝早期诊断中有重要作用，能够反映HBV的复制情 况，PreS1阳性与HBVDNA阳性有显著性相关，PreS1抗原与HBVDNA符合率为652%。

PreS2有 较强的免疫原性，反映HBV复制的表型指标。乙型肝炎患者PreS2与HBeAg、HBVDNA呈伴随关系，PreS2的阳性率比HBVDNA 高，PreS2抗原与HBVDNA符合率为764%。但PreS2不可替代HBVDNA。PreS1、PreS2反映HBV的复制活跃比HBeAg更敏感。 1．4 HBVDNA含量与肝功能

有资料显示，血清HBVDNA的含量与肝功能指标均无相关性。张永红等指出HBVDNA和肝实质损害指标ALT、AST、PAB、ALB、 TBIL、PT均不存在相关性，P＞005，说明

HBVDNA载量并不反映肝功能受损的程度。HBV通过刺激宿主的免疫系统攻击受感染的肝细胞，间接引起 肝损伤，HBV的肝细胞免疫病理损伤以T淋巴细胞毒反应为主，靶抗原的表达是决定靶细胞破坏的重要因素之一，肝细胞膜上表达的HBcAg、HBeAg、前S1蛋白和前S2

蛋白是CTL攻击的主要靶抗原。 2 HBVDNA定量的临床意义

HBVDNA是直接反应HBV复制状态及传 染性的最佳指标，可用于判断乙肝感染的严重程度和传染性。HBVDNA的含量对观察抗病毒药物疗效、参考药物的剂量、用药时间以及是否需要联合用药有重要 意义。在临床工作中利用血清HBVDNA载量判断患者病情、预后及指导抗病毒药物的应用，要结合ALT含量、HBV M，乃至PreS1、PreS2、LP联合检测。献血员窗口期病毒核酸的筛查以及早期诊断。HBsAg在血清中的检出通常在乙肝病毒感染后的2～4个月出现，HBVDNA的检测可将“窗口期”提前到6～15天，对早期诊断和输血的安全性有重要的意义。监测肝损伤的程度、预测病情、判断预后。 3 HBVDNA定量的方法 3.1 PCRELISA

3.1.1 HBVPCR微板核酸杂交定量法

采用PCR扩增HBVDNA的S区，将扩增产物与包被探针及显色探针在微孔板内进行双探针杂交及ELISA显色，定量检测 HBVDNA。该技术特点是在液体中进行杂交、杂交时间缩、操作简便、特异性高、仪器要求不高、价格便宜。李成德等［14］用realtime PCR检测HBVDNA，并与微板杂交法的结果进行比较，realtime PCR的灵敏度高10～50倍；样本批内

变异系数均更低。微板杂交法难以避免扩增产物的污染，自动化程度低，影响定量的准确性。 3.1.2 COBAS Amplicor系统检测

HBVDNA是PCR定量方法的金标准，其具有良好的准确性和重复性。其特点是：采用内对照有效监控核酸抽提、扩增的效 率，能消除反应体系中干扰因素的影响，但试剂昂贵，难以推广使用。肖艳群等比较realtime PCR与COBAS Amplicor系统，realtime PCR省时、费用相对较低，易为临床实验室接受，灵敏度虽低于COBAS Amplicor，但检测下限103copies／mL能满足临床检测的需要，有较好的重复性，与COBAS Amplicor有良好的相关性。 3.2竞争定量PCR(cPCR)

cPCR是在同一反应管中，待测模板与竞争模板用同一对引物同时扩增，其中一个引物标记荧光，酶切后电泳或高效液相法分开两种产物，测定荧光强度，根据已知模板推测未知模板的起始拷贝数。定量的基础是假设扩增效率没有差别，且竞争模板难制备，影响定量准确性。PRSimpson等用竞争定量PCR 检测HBVDNA，竞争模板为合成并扩增的HBs基因，用闪烁接近法(scintillation proximity assay，SPA)分析PCR扩增产物，分别计数，不需要分离过程，一般cPCR的灵敏度为103copies／mL，SPA法分析产物要损失灵敏度， 提高特异性，方法灵相当于4×103copies／mL，线形范围在4个数量级左右。 3.3实时荧光定量PCR(realtime PCR，RTPCR)

realtime PCR是在PCR体系中加入荧光染料或荧光标记探针，在激发光的作用下释放荧光光能，荧光强度的变化可以动态反映PCR扩增产物量的变化，通过自动化仪器 对荧光的采集与分析来实现对初始模板的检测和定量。

4 实时荧光定量PCR检测HBV-DNA和Elisa法检测HBV的结果对比

2013年5月至2013年6月收集HBV感染血清标本165例，主要仪器有ABI7500实时荧光定量PCR仪和Ther-moMK3酶标仪。检测结果，见表1。

5 讨 论

Elisa法检测血清标本中的HBV-M是HBV感染病原学诊断的传统指标，该方法方便快捷，且技术成熟，对判断患者感染HBV情况有着重要的作用。但是ELISA检测是通过血清中的蛋白标志物间接地了解HBV的复制情况，依赖于人体免疫反应，有一定的滞后期，不能作为判断患者是否具有传染性的直接证据。同时由于乙型肝炎病毒感染窗口期和基因变异的存在，ELISA检测还有假阴性可能，会严重影响乙型肝炎的检测和治疗。而荧光定量PCR技术弥补了传统ELISA检测HBV的不足，直接检测血清中乙型肝炎DNA，判断患者体内是否存在病毒颗粒复制。由于HBV复制减弱，导致HBeAg水平低于检测限，但是并未停止复制，在HBV DNA检测中浓度多在103－104；乙型肝炎病毒前C区发生突变，导致e抗原分泌障碍，但是乙型肝炎病毒DNA仍旧继续复制。后面一个解释同样适用于HBsAg、HBcAb阳性组合，居高不下的HBV DNA水平使得这些患者具有很强的传染性，这是单独进行ELISA试验所不能提供

的信息。综上，判断乙型肝炎患者是否具有传染性方面，FQ -PCR检测较ELISA检测更为直接明了，但是HBV-M指标检测同时还反映了人体对于病毒的免疫反应，在判断疾病进程方面有更为显著的作用，因此两者是互补互存的关系，结合起来将更加有利于病情和病程的判断。 6 结 论

总之，在诊断治疗乙型肝炎的过程中，HBVDNA定量越来越受到重视，通过HBVDNA定量，结合检测血清标记物、肝损害指标、HBV基因分型以及检测 一些和复制有关的蛋白如PreS1、PreS2、LP，能更准确地判断患者病情、预后及指导抗病毒药物的应用。实时荧光定量PCR法灵敏度高、特异性强、快速、自动化程度高、且易于推广。国内临床上 用于

HBVDNA定量的方法基本都是实时荧光定量PCR测定，试剂购买商业试剂盒，灵敏度、特异性、稳定性等都能满足要求，但也存在容易污染的问题，并且仪器和试剂盒的成本还不能被大多地区接受。仍需进一步研究增加方法可靠性，并降低检测成本。 参考文献：

［1］ 朱永芳编实用荧光聚合酶链反应(PCR)技术［M］北京：中国计量出版社，2003 ［2］ 梁晓峰，陈园生，王晓军等中国3岁以上人群乙型肝炎血清流行病学研究［J］中华流行病学杂志，2005，26：655～658

［3］ 单春梅，王万相乙型肝炎患者HBVDNA与HBV M及HBVDNA前C／C区变异的对比研究［J］实用医技杂志，2006，13(10)：1629～1631

［4］ 姜燕，姜宏，黄园园乙型肝病毒感染者血清HBeAg模式与HBVDNA定量关系的研究［J］临床肝胆病杂志，2005，21(5)：281～282