NaCl对萝卜幼苗逆境指标及蛋白激酶活性的影响

2004

Vol.29 No.4JournalofSouthwestChinaNormalUniversity(NaturalScienceEdition)

文章编号:10005471(2004)04065104

NaCl对萝卜幼苗逆境指标及蛋白激酶活性的影响

吴能表1, 何 凤1, 杨丽萍2, 肖文娟1

11西南师范大学生命科学学院,重庆400715;21甘肃省敦煌市敦煌中学,甘肃敦煌736200

¹

摘要:研究了NaCl对萝卜(Raphanussativus)幼苗叶片内SOD,POD,CAT活性,Vc、脯氨酸、可溶性糖、蛋白质含量和蛋白激酶活性的影响以及激酶活性与部分金属离子的关系.结果表明,015%的NaCl能使萝卜体内SOD,POD,CAT活性,Vc、蛋白质含量以及生物量降低.与此同时,提高体内脯氨酸、可溶性糖,促进蛋白激酶活性增加,反应体系的Ca2+,Mn2+,Mg2+对蛋白激酶活性的发挥有显著影响.关 键 词:萝卜;盐胁迫;逆境指标;蛋白激酶中图分类号:Q946

文献标识码:A

研究作物的耐盐机理对盐碱地区农业生产具有深远意义,在对外界刺激的信号传递和应答过程中,蛋白质磷酸化作用起着非常重要的作用

[1]

.大量研究表明,几乎所有的生理和病理过程,如糖代谢、光合作

用、细胞的生长发育、基因表达、神经递质的合成与释放,甚至癌变都与蛋白质的磷酸化和去磷酸化有关[2,3],盐胁迫也不例外.同时,蛋白质的磷酸化依赖于激酶活性.本文以萝卜(Raphanussativus)为材料,研究NaCl对萝卜逆境指标的影响和可溶性蛋白激酶活性与EGTA(ethyleneglycolbis(2-aminoethylether)tetraaceticacid)、Mn2+、Mg2+和Ca2+等离子的关系,为揭示逆境生理机理和逆境信号传导途径提供重要资料.

1 材料和方法

111 材 料

供试材料为萝卜品种圣红1号.室温浸种1d,撒播于盛有珍珠岩基质的钵盆中,用含有015%NaCl的Hoagland完全营养液浇灌,每日1次,处理1个月,与不加NaCl的材料对照,取其叶片用于各项指标的测定.112 方 法

丙二醛(MDA)含量采用硫代巴比妥酸(TBA)比色法

[4]

测定;脯氨酸(Pro)含量采用磺基水杨酸法

[5]

测

定;可溶性糖含量采用蒽酮硫酸水合热法[6]测定;SOD采用NBT法,按Stewartand的测定系统[7]进行;POD采用愈创木酚法[8];CAT采用紫外分光光度法[9];Vc含量采用2,6-二氯酚靛酚滴定法[10];蛋白质的提取与酶液的制备参照文献[11]的方法;蛋白质的含量测定参照文献[12]方法;蛋白激酶(ProteinKinase,PK)活性的测定参照文献[13]的方法.

2 结果与分析

211 盐胁迫对萝卜体内渗透调节物质的影响

植物对渗透胁迫的适应往往是通过积累胞内的有机或无机溶质来进行渗透调节,脯氨酸和可溶性糖是

¹

收稿日期:20030901

基金项目:国家自然科学基金资助项目(39970516,30170646).

作者简介:吴能表(1969-),男,四川平昌人,副教授,主要从事植物生理生化、蛋白质组学与植物信号传导等的研究.

652西南师范大学学报(自然科学版) 第29卷

普遍存在的渗透调节物质.NaCl处理使萝卜体内脯氨酸或可溶性糖含量升高,分别为对照的112194%,109109%,而体内蛋白质含量却降低,仅为对照的88195%(表1).可溶性糖和脯氨酸含量的升高有利于细胞水势的降低,提高抗脱水能力.蛋白质含量的降低可能是与盐胁迫下蛋白质合成减少、部分蛋白质对盐胁迫的适应而水解成小分子物质(如脯氨酸)有关.

表1 盐胁迫对萝卜脯氨酸、可溶性糖、蛋白质含量和蛋白激酶活性的影响Table1 EffectofNaClStressontheContentofProline,SolubleSugarand

Protein,andontheActivityofProteinKinaseinRaphanussativus

NaCl浓度/%0015

显著性检验(P)

脯氨酸含量/Lg#g-1FM35155?610640115?311501033(显著)

可溶性糖含量/Lmol#g-1FM44?1448?701045(显著)

蛋白质含量/mg#g-1FM2138?01122112?012301036(显著)

蛋白激酶活性/cpm#mg-1protein83250?58115288?7401004(极显著)

212 盐胁迫对萝卜膜保护系统与膜脂过氧化作用的影响

经015%的NaCl处理后,萝卜体内SOD,POD,CAT活性和Vc含量都有明显降低,其中Vc含量下降幅度最大,达到38189%,其次是CAT降低33135%,POD降低26109%,SOD下降17120%;与之相反,作为膜脂过氧化产物的MDA却有较大幅度的升高,达到对照的2186倍(表2).说明在盐胁迫条件下,萝卜细胞酶保护系统调节能力大大削弱,自由基的消除能力相应减少,膜脂被氧化程度较大,氧化产物MDA含量升高,膜已受到一定程度的损伤.

表2 盐胁迫对SOD,POD,CAT酶活性和Vc,MDA含量的影响Table2 EffectofNaClStressontheActivityofSOD,POD,CAT,

andontheContentofVc,MDAinRaphanusSativus

NaCl浓度/%0015

显著性检验(P)

SOD活性/U#g-1FM12115?116910106?017801036(显著)

POD活性

/$A470nm#min-1#g-1FM

3106?0132

2107?013301001(极显著)

CAT活性/U#g-1FM66147?715049113?714501000(极显著)

Vc含量/Lg#g-1FM90?1455?1101002(极显著)

MDA含量/Lmol#g-1FM010107?010010010307?01003301000(极显著)

213 不同离子及其浓度对萝卜激酶活性的影响

萝卜经过盐胁迫处理后,激酶活性有较大增加,达到对照的138148%.为探讨不同二价金属离子对萝卜激酶活性的影响,在盐胁迫提取酶液的反应体系中分别加入Mn2+,Mg2+、不同浓度Ca2+及钙离子螯合剂)))EGTA进行处理,以1mmol#L-1CaCl2+10mmol#L-1MgCl2的活性为100%,其他测定值与之比较,多个处理之间存在显著差异(表3).

表3 不同离子对盐胁迫引起的萝卜PK活性的影响

Table3 EffectsofIonsontheActivityofProteinKinaseinRaphanussativusTreatedbyNaCl

外加离子及浓度/mmol#L¹1CaCl2+10MgCl2+10Mn-Cl2

º2CaCl2+10MgCl2»1CaCl2+10MgCl2¼1CaCl2+10MnCl2½5CaCl2+10MgCl2¾10MgCl2

¿10CaCl2+10MgCl2

À1CaCl2+10MgCl2+2EG--1

平均活性264503(229143%)144817(125161%)115288(100%)95497(82183%)92670(80138%)86388(74193%)60943(52186%)

X-i1539324911012942499895801047727770995

****

X-i609432035608387454345345543172725445

**

X-i86388178115

****

X-i9267017183352147226182827

*

X-i9549716904649320

*

X-i115288X-i14481714921529529

**

119686

**

******

584292890091096282

**

***

*********

19831

***

**

45550

15393(13135%)

TA-1

注:显著性检验(SSR法)活性单位为cpm#mg蛋白质;*表示在0105水平有显著性差异,**表示在0101水平有显著差异.

21311 Ca对激酶活性的影响

在反应体系不变(表3#»)的情况下,外加钙离子螯合剂EGTA对盐胁迫下PK活性有极显著的影响,

2+

第4期 吴能表,等:NaCl对萝卜幼苗逆境指标及蛋白激酶活性的影响其活性只有对照的13135%(表3#À).

反应体系中外加不同浓度的Ca

2+

653

.结果发现,2mmol#L

-1

为最佳浓度,其活性达到对照的125161%,

不加钙的PK活性仅为对照的74193%,但此活性高于加入EGTA者,可能是酶液中本身含有一定浓度的Ca2+.当Ca2+浓度超过2mmol#L-1时,随着Ca2+浓度的升高,PK活性逐渐降低.说明该激酶对钙离子浓度非常敏感,适当浓度的Ca2+能够明显地活化PK活性,高于或低于一定浓度都不利于激酶活性的充分发挥.

21312 Mn,Mg对PK活性的影响

在对照体系中除去Mg2+,代之10mmol#L-1MnCl2(表3#¾),其活性为对照的82183%;在对照体系中额外加入10mmol#L-1MnCl2,PK活性比对照高出129143%,说明Mn2+和Mg2+对于增强PK活性皆是必需的.

2+

2+

3 讨 论

植物在盐胁迫条件下往往导致水分供应不足,因此抗脱水是一个重要的生理环节,可溶性糖、游离脯氨酸是植物细胞内重要的渗透调节物质,它们能够增加胞内溶质浓度,降低细胞的冰点,防止细胞过度脱水,从而减少环境胁迫对细胞的伤害[12].胁迫下植物体内可溶性糖含量和游离脯氨酸含量与植物抗性之间存在相关性[13].盐胁迫处理后萝卜幼苗体内脯氨酸和可溶性糖含量明显升高,说明脯氨酸、可溶性糖对盐胁迫下的萝卜幼苗可发挥显著渗透调节作用.

正常情况下,细胞内自由基的产生和清除处于动态平衡,许多逆境可以打破这种平衡[14].一旦这种平衡遭到破坏,自由基就会在体内积累,膜内脂质双分子层中的不饱和脂肪酸就易被氧化分解,使细胞内许多功能分子的结构和功能受到破坏,如膜脂过氧化、膜的通透性增大等

[15]

,从而造成植物体内代谢紊乱,

甚至造成膜整体的破坏和过敏性死亡[16].生物体内广泛存在能清除活性氧代谢的保护酶,它们把活性氧转化成低活性物质,从而保护膜系统.除了酶保护系统之外,植物体内还存在膜保护物质,其中抗坏血酸是一种重要的膜保护物质,作为一种低分子量的抗氧化剂,Vc能够清除多种活性氧,抑制不饱和脂肪酸氧化,防止降解,对稳定膜结构十分重要.MDA是植物细胞膜脂过氧化产物之一,能与细胞内的各种物质发生强烈反应,因而引起对酶和膜的严重损伤

[14]

,正常生长的植株体内MDA含量较低,当植株处于不良环

境时,会因不良环境的恶劣程度引起MDA含量的相应上升.盐胁迫处理后,SOD,POD,CAT活性和Vc含量明显下降,MDA含量升高,说明NaCl浓度为015%时,就已经造成了较大程度的膜脂过氧化作用,膜已受到一定程度的破坏,萝卜抗氧化力很弱.

Ca2+,Mn2+,Mg2+,EGTA都对PK活性有极显著影响.不同钙水平下PK活性差异极大,该激酶能被强烈Ca2+激活,以2mmol#L-1CaCl2为最佳效果.Mn2+,Mg2+都能分别提高激酶活性,但它们的激活效果有差异,在体系内同时加入这两种离子的效果大于单独作用的效果,但小于两者之和,说明这两种离子的作用机制是不同的,它们之间不能相互取代,这与文献[17]的研究结果一致.Mn2+,Mg2+的作用很可能是作为PK的活化剂而调节酶的活性,这有待进一步研究证实.参考文献:

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EffectofNaClontheStressIndexesandonthe

ActivityofProteinKinaseinRaphanussativus

WUNeng-biao1, HE Feng1, YANGL-iping2, XIAOWen-juan1

11SchoolofLifeScience,SouthwestChinaNormalUniversity,Chongqing400715,China;21DunhuangMiddleSchoolofGansuProvince,DunhuangGansu736200,China

Abstract:EffectsofNaClontheactivitiesofSOD,POD,CAT,proteinkinase,thecontentsofVc,proline,solublesugar,solubleprotein,etc.,andtherelationshipbetweenmetalionsandtheactivityofproteinkinaseinRaphanussativuswerestudied.ItshowedthattheactivitiesofSOD,POD,CATandproteinkinase,thecon-tentsofVcandsolubleproteinofRaphanussativustreatedby015%NaClreduced.Ontheotherhand,thecontentofproline,solublesugarandtheactivityofproteinkinaseenhanced;Ca2+,Mn2+,Mg2+hadansignif-icanteffectontheactivityofproteinkinase.

Keywords:Raphanussativus;saltstress;stressindex;proteinkinase

责任编辑 胡 杨