第24卷第10期 应用化学 Vo1.24 No.10 2007年10月 CHINESE J0URNAL 0F APPUED CHEMISTRY 0ct.2007 二乙基巴比妥酸与牛血清白蛋白相互作用的荧光光谱法 迟燕华 庄 稼 毕欣颖。 周 磊。 (。西南科技大学化学系绵阳621010; 西南石油大学材料科学与工程学院成都) 摘要采用荧光光谱法、紫外一可见光谱法研究了二乙基巴比妥酸(BBT)与牛血清白蛋白(BSA)的相互作 用机理。结果发现,BBT对BSA有较强的荧光猝灭作用,分别在17和37 时,根据荧光猝灭数据,由Stem— Volmer方程求得动态猝灭常数” Ksv=1.427×10 和” Ksv=1.195×10 ,由Line weaver—Burk双倒数方程得 到了静态猝灭常数” KLB=9.848×10 和” KLB=1.778×10 。获得反应的结合常数K0=4.341×10 ,推导 出结合位点数n=1.136和△日、△s和AG等热力学参数。说明了温度升高有利于BBT—BSA的结合作用的反 应。并由此推出了结合反应的主要作用力类型。利用同步荧光技术,研究了BBT对BSA构象的影响。 关键词二乙基巴比妥酸,牛血清白蛋白.荧光光谱法.热力学参数 中图分类号:0657.3 文献标识码:A 文章编号:1000-0518(2007)10—1167-05 二乙基巴比妥酸(BBT,又名巴比妥,见Scheme 1)可镇静、催眠,对改善病人的睡眠、抗焦虑、解除烦 躁起到重要的作用。但是,此类药物具有中枢神经系统抑制作用,长期服用会导致成瘾和耐药性,大剂 量使用可致死。关于BBT药物成瘾和致生物耐药方 … 面的研究,是目前药学、医学、生物、化学等学科共同 ,,、 ,,、 \… 关注的问题。研究BBT与生物分子作用的状况有助 ‘\,、/ 于了解致瘾药物的药理作用、毒副作用及脱瘾等化 /\,、 学反应机理,从而科学的指导临床用药及相关的治 f f 疗和研究。本文利用荧光光谱法研究了BSA与BBT …\/… 相互作用的机理,这对阐明BBT等一类药物在体内 i『 的运输过程中与生物分子结合反应能否自发作用以 u 及其药理、毒理作用的研究提供了依据。 Sch。m M。 。 “ ru “ of D mylmalonylurea 1实验部分 1.1仪器和试剂 RF-5301PC型荧光分光光度计(日本,岛津公司);酸度计868型(美国,Thermo Orion):Heto—CBN 8-30型恒温制冷加热水浴(丹麦);移液器(德国,Eppendorf);隔水式恒温培养箱(上海一恒科技有限公 司)。牛血清白蛋白(生化试剂FW67000,上海丽珠东风生物技术有限公司)0.45 g/L(6.7× 10I6 mol/L),置冰箱0~4 oC保存;BBT(分析纯,天津市科密欧化学试剂开发中心,6.7×10I4 mol/L); Britton—Robinson(B—R)缓冲溶液(由0.04 mol/L的磷酸(H3 PO )、冰醋酸(HAc)、硼酸(H B0 )和 0.2 mol/L的NaOH溶液按一定的比例配制而成);Tris—HC1缓冲溶液;其余试剂均为分析纯;实验用水 为二次去离子水。 1.2实验方法 移取1.0 mL BSA溶液于10.0 mL容量瓶中,再加入适量BBT溶液,pH值由缓冲溶液控制,以二次 去离子水定容后摇匀,置于1 cm荧光比色皿中,固定荧光激发波长280 am,入射和出射狭缝均为 5.0 am,扫描荧光光谱并测量荧光强度。 2006—11—19收稿.2007-03-20修回 国家电分析化学重点实验室基金项目(2005007)和四川省科学技术重点攻关项目(03GGO09-024) 通讯联系人:迟燕华.女,教授;E-mail:chiyanhua@swust.edu.ca;研究方向:分子光谱:生化与环境分析 维普资讯 http://www.cqvip.com
1168 应用化学 第24卷 2结果与讨论 2.1荧光光谱 BBT本身没有荧光,牛血清白蛋白由于含有色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸等芳香氨基酸残基,具有内源 荧光。固定BSA浓度,逐渐增加BBT浓度。结果发现,BSA的荧光强度不断降低,但发射峰的位置和峰 形不变(见图1),表明BBT对BSA的荧光有猝灭作用。同时,BBT的uV—Vis光谱表明,它在300~ 400 nm波段基本没有吸收,不会引起此波段内的荧光光谱减弱。 /nm pH 图1 BBT对BSA的荧光猝灭光谱 图2 pH值对BBT猝灭BSA荧光强度的影响 Fig.1 Fluorescence quenching spectra of Fig.2 Effect of pH on fluorescence quenching BSA with BBT added ofBSA caused by BBT c(Bsa)=0.67 mol/L; c(BSA)=0.67 x10-6 mo//L; 10 C(BBT)/(mol・L一 ):n.0;b.0.067; c(BBT)=0.335×10-4 mol/L: C.0.201;d.0.335;e.0.469; A /A =280 nm/345 nm ,C(BBT)=0.335×10I4 mol/L(blank); A /A =280 nm/345 nm 2.2 pH值的影响 实验中固定BSA浓度,加入一定量不同pH值的B—R缓冲溶液,扫描BSA的荧光发射光谱。发现在 pH<4的酸性条件下,酸诱导BSA分子伸展,降低芳香氨基酸之间的能量转移,荧光峰蓝移,强度逐渐 降低;在pH>10的碱性环境中,BSA变性使肽链伸展,荧光强度开始迅速下降…。因此,实验应在中性 条件下进行。图2为pH值对BBT猝灭BSA荧光强度的影响。从图中可看出,在pH值为6~8的范围 内△F基本保持不变。因此,本文选择在酸度接近人体体液的pH=7.40 Tris—HC1生化缓冲溶液中进行。 2.3荧光猝灭与温度的关系 荧光猝灭通常可分为动态猝灭和静态猝灭。动态猝灭是猝灭剂和荧光分子之间因彼此扩散和碰撞 导致荧光物质荧光减弱的现象。其碰撞猝灭过程遵循Stem—Volmer方程 J: /F:1+后q oCQ=1+KsvCQ 式中, 为未加入猝灭剂时荧光物质的荧光强度;F为猝灭剂浓度等于c。时荧光物质的荧光强度;kq为 双分子猝灭过程的速率常数(L/(mol・s)); 为无猝灭剂存在下荧光分子的平均寿命;Ks 为Stern— Volmer猝灭常数(L/mo1),是双分子猝灭速率常数与单分子衰变速率常数的比率。由于生物大分子荧 光寿命 。约为1×10一s,故可根据猝灭常数K 求得猝灭速率常数k ,且各类猝灭剂对生物分子的最大 扩散碰撞猝灭速率常数为2.0×10m L/(mol・S)。 静态猝灭是猝灭剂和荧光物质相互作用生成了一定构型的化合物,从而导致荧光物质荧光强度减 弱的现象。静态猝灭符合Line weaver—Burk双倒数方程 : (F0一F)~=Fo +K c .式中, R为Line weaver—Burk猝灭常数。 按实验方法,固定BSA的浓度,改变BBT的浓度,分别在17和37℃时,以A =280 nm测BSA— 维普资讯 http://www.cqvip.com 第1O期 迟燕华等:二乙基巴比妥酸与牛血清白蛋白相互作用的荧光光谱法 BBT体系A =345 nm的荧光发射强度。以Fo/F~CQ绘制BBT猝灭BSA的Stern—Volmer曲线(见图3) 和以( 一F)~~C 作Line weaver—Burk双倒数曲线(见图4)。对图中的曲线进行线性拟合,得到线性 回归方程和相关系数见表1,动态猝灭和静态猝灭的常数见表2。 Fig.3 Stern—Volmer curves of fluorescence Fig.4 Line weaver—Burk curves of fluorescence quenching of BSA caused by BBT quenching of BSA caused by BBT c(BSA)=0.67×10~moL/L;pH=7.40; c(BSA)=0.67×10一moL/L;pH=7.40; A /A =280 nm/345 nm A /A =280 nm/345 nm 表1线性方程和相关系数 Table 1 Regression equations and correlation coefifcients 从Stern—Volmer方程及温度对猝灭常数的影响来看,温度升高K 减小,说明这种猝灭受基态的配 合作用的热力学所控制,可能是静态猝灭。 一般猝灭剂对生物大分子的最大动态猝灭速率常数K 值为2.0×10加L/(mol・S),通常以此来判 断猝灭类型。从表2看到,BBT对BSA的动态猝灭速率常数K 远大于2.0×10加L/(mol・S)。因此,研 究认为该体系的猝灭过程不是分子扩散和碰撞引起的动态猝灭,而是BBT和BSA分子之间形成复合物 引起的静态猝灭【8 为主。 表2结合反应常数和热力学参数 Table 2 Binding constants and the thermodynamic parameters 2.4 BSA-BBT体系的热力学函数 当温度变化不大时,结合反应焓变可看成常数,根据热力学公式: AG=AH—T・AS AG=一RTin K ln(K2/K )=(AH/R)・(1/T 一l/ ) 可求得反应的△ 、△s和AG等热力学函数的变化(见表2)。 在化学反应体系中,吉布斯函数AG负值越大,反应趋势越大;如果反应,平衡转化率越高。由表2 数据可见,当温度升高,体系的△s和AG值分别变化,AG负值增大,说明温度升高对反应有较大的影 响,有利于二者向结合反应的方向进行。 维普资讯 http://www.cqvip.com 应用化学 第24卷 2.5 BSA与BBT结合作用力类型 根据分子结构可知,蛋白质与有机小分子之间的作用力应当属于分子间的弱相互作用,包括氢键、 范德华力、静电引力和疏水力。通过计算反应前后热力学函数AH和△5的相对大小,可以判断有机小 分子与蛋白质之间的主要作用力。判别规则为[4]:AH=0,AS>0,为疏水力;△H<0,AS>0,为静电力; AH<0,AS<0,为范德华力。由表2可知,AH<0,AS<0,二者之间的作用力应为范德华力。 2.6结合位点数与结合常数 对于静态猝灭,荧光强度与猝灭剂的关系可由荧光分子与猝灭剂的结合常数表达式推导出[5 ]: 设蛋白质B有n个相同且独立的结合位点,则荧光体与猝灭剂间的猝灭反应可表示为: 平衡常数 为: 式(1)中,[B]是游离荧光体浓度,[Q]是猝灭剂浓度,[Q B]是配合物浓度,若荧光体总浓度为 [B。],则[B。]=[Q B]+[B],代人(1)式: = 在静态猝灭中,荧光体系的荧光强度与其游离浓度成正比(所生成的配合物是非荧光性的)。 器=[B。]一 F (3) 由式(2)和式(3)可得: lg _lg g[Q] (4) 将测试数据 和[Q]按上式做线性拟合得到该直线的回归方程lg((Fo—F)/F)=4.638+ 1。 1.136 lg[Q],r=0.999,进而求得BSA与BBT的结合位点数rt:1.136,可略为rt 1和结合常数Ko= 4.341×10 L/mol。 2.7 NaC!对BSA.BBT体系的影响 用强电解质NaCI溶液来控制体系的离子强度时,随NaCI浓度的增加,不但BSA本身荧光强度降 低,而且BBT—BSA体系荧光强度也降低。BSA的荧光强度随NaCI溶液浓度的增大而减小,原因可能是 NaCI的加人导致BSA构象的改变;当BBT存在时,加人少量NaCI,△F随NaCI浓度的增加而减小,当 NaCI达到0.4 mol/L时,△F几乎保持不变。这可能是NaCI的加人改变了BSA的构象,同时与BBT竞 争BSA上的结合位点,阻碍了BSA与BBT间的相互作用,可知BSA与BBT之间存在静电力作用。因 此。在测定BSA与BBT体系时应在较低离子浓度下进行。 图5 BBT猝灭BSA的同步荧光光谱 Fig.5 Synchronous fluorescence spectra of BSA quenched by BBT c(BSA):O.67×10一 mo ̄L;10 c(BBT)/(mol・L一 ):0.0;b.0.134;c.0.402;d.0.603;pH:7.04 A.△A:15 am:B.AA:60 am 维普资讯 http://www.cqvip.com
第10期 迟燕华等:二乙基巴比妥酸与牛血清白蛋白相互作用的荧光光谱法 1171 2.8 BBT猝灭BSA的同步荧光 蛋白质的同步荧光光谱研究|7 ]表明,当△A=15 llm时只显示蛋白质酪氨酸残基的光谱特性,当 △A=60 llm时的同步荧光光谱只表现色氨酸残基的荧光。因残基的最大发射波长与其所处环境的极性 有关,因而由发射波长的改变可以判断蛋白质构象的变化。若红移表明残基所处环境的极性增加;若蓝 移则表明残基所处的疏水性增加。 固定BSA的浓度,逐步增加BBT的浓度,测量了BSA的同步荧光光谱(图5),由BBT猝灭BSA的 同步荧光光谱可看出,色氨酸和酪氨酸的荧光均降低,但残基的发射波长没有明显改变,说明BBT的加 入对BSA的构象几乎没有影响。 参考文献 1 LIN Jun—Cai(林钧材).Blood Biochemistry(血液生物化学)[M].Beijing(北京):Demos sanitation Press(人民卫生 出版社)。1988:32 2 CHEN Guo—Zhen(陈国珍),HUANG Xian—Zhi(黄贤志),XU Jin.Gou(许金钩),WANG Zhun—Ben(王尊本).Fluores— cence Analytical Method(荧光分析法)[M].BeiJing(北京):Science Press(科学出版社),1990:502 3 YAN Cheng—Nong(颜承农),SHANGGUAN Yun—Feng(上官云凤),PAN Zu—Ting(潘祖亭),LIU Yi(刘义),QU Song— Sheng(屈松生).Spectroscopy and Spectral Anal(光谱学与光谱分析)[J],2004,32(3):317 4 Ross P D,Subramanian S.Biochemistyr[J],1981,20:3 096 5 ZHANG Hai—Rong(张海容),GUO Qi—Yuan(郭祀远),LI“n(李琳),CAI Miao—Yan(蔡妙颜),JIN Wei-Jun(晋卫 军),LIU Chang—Song(刘长松).Spectroscopy and Spectral Anal(光谱学与光谱分析)[J],2001,21(6):829 6 Vanya P Bogoeva,Maya A Radeva,Lyubomira Y Atanasova,Stoyanka R Stoitsova,Raina N Boteva.Bioehemiea et 一 iea Acta[J],2004,1 698:213 7 Hu Y J,“u Y,Wang J B,Xiao X H,Qu S S.Pharmaceutical and Biomedical Anal[J],2004,36:915 8 YANG Man—Man(杨曼曼),YANG Pin(杨频),ZHANG Li—Wei(张立伟).Chinese Sci Bull(科学通报)[J],1994, 39(1):31 9 Arabinda Malick,Subhash Chandra Bera,Subhendu Maiti,Nitin Chattopadhyay.Biophsical Chem[J],2004,112:9 Interaction of Diethylmalonylurea and Bovine Serum Albumin Studied by Fluorescence Method CHI Yan-Hua ,ZHUANG Jia ,BI Xin.Ying ,ZHOU Lei (。Department of Chemistry,Southwest University of Science and Technology,MianYang 621010; Departemnt of Materials Science and Engineering,Southwest Petroleum University,Chengdu) Abstract The interaction mechanism O diethylmal0nylurea(BBT)with bovine senlm albumin(BSA)was studied by fluorescence and UV-Vis spectra.It is shown that BBT has a powerful ability to quench the fluores- cence intensity of BSA.The fluorescence quenching data were analyzed according to Stern-Volmer equation and Line weaver-Burk equation at 1 7℃and 37℃to obtain the quenching constants, Ksv=1.427×1 0 and ℃Ksv=1.195×104℃KLB=9.848×10 and ℃K, LB=1.778×10 ,and the binding constant Ko= 4.341×10 ,and the thermodynamic parameters(AH,AS and AG).It was deduced that combining site n was 1.136.The increasing of temperature was favorable for the BBT.BSA interaction.According to the thermodynamic parameters,the major binding forces were determined.The effect of BBT on the conformation of BSA was analyzed v/a synchronous fluorescence spectroscopy. Keywords diethylmalonylurea(BBT),bovine senlm albumin(BSA),fluorescence spectrometry,thermody- namic parameter
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