川白芷种子质量检验方法研究

种子检验　杨枝中等：川白芷种子质量检验方法研究　川白芷种子质量检验方法研究　杨枝中，蒋运斌，穆向荣，袁茂华，马逾英　（成都中医药大学药学院，　四川成都６１１１３７）　Ｔｅｓｔｉｎｇ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｆｏｒ　Ｓｅｅｄ　Ｑｕａｌｉｔｙ　ｏｆ　Ａｎｇｅｌｉｃａ　ｄａｈｕｒｉｃａ　ｖａｒ．ｆｏｒｍｏｓａｎａ　ＹＡＮＧ　Ｚｈｉ・ｚｈｏｎｇ，ＪＩＡＮＧ　Ｙｕｎ・ｂｉｎ，ＭＵ　Ｘｉａｎｇ－ｒｏｎｇ，ＹＵＡＮ　Ｍａｏ－ｈｕａ，ＭＡ　Ｙｕ—ｙｉｎｇ　摘要：目的：研究川白芷种子的质量检验方法。方法：参照　目前，中药材种子生产规范化程度较低，绝大部分　《农作物种子检验规程》选择适合川白芷种子质量检验的方法。　中药材种子还没有相应的种子检验规程和质量标　结果：初步建立了川白芷种子质量检验方法：最少扦样量为　准　，仅甘草　、川牛膝　、白花蛇舌草　、丹参　、栝　１２　ｇ；过２０目筛后进行净度分析；真实性鉴定采用外观形态鉴　楼　等少数中药材种子有种子检验规程和质量标准　定和大小测量；重量测定采用千粒法；种子置于砂上，光照１２　ｈ，　２５℃／１８　ｑＣ昼夜变温，计数９—３０　ｄ进行发芽试验；低恒温（１０５　方面的研究。经产地调查，各产区的川白芷种子质量　±２）℃烘干时间４　ｈ测定含水量；０．７％ｑＴＣ溶液染色３　ｈ测定　优劣完全依靠当地药农的经验进行评价，产区普遍存　生活力；健康度测定直接将种子接种于ＰＤＡ培养基上，２８℃培　在自繁自育现象，缺乏相应的种子检验规程和质量标　养３　ｄ后观察统计。结论：将为川白芷种子质量检验规程的制　准，导致川白芷种子质量良莠不齐。因此，本研究对川　定提供参考依据。　白芷种子的净度、真实性鉴定、重量、含水量、生活力、　关键词：川白芷；种子；质量检验　健康度的检测方法以及发芽条件等进行了系统研究，以　中图分类号：Ｓ　５６７　文献标志码：Ａ　期为制定川白芷种子检验规程和分级标准提供依据。　文章编号：１００１—４７０５（２０１３）１２－０１１９－０４　１材料与方法　川白芷为著名的川产道地药材，来源于伞形科植　１．１试验材料　物杭白芷Ａｎｇｅｌｉｃａ　ｄａｈｕｒｉｃａ（Ｆｉｓｃｈ．ｅｘ　Ｈｏｆｆｍ．）Ｂｅｎｔｈ．　２份试验材料均采自四川省遂宁市永兴镇中脊村　ｅｔ　Ｈｏｏｋ．ｆ．ｖａｔ．ｆｏｒｍｏｓａｎａ（Ｂｏｉｓｓ．）Ｓｈａｈ　ｅｔ　Ｙｕａｎ的干燥　川白芷不同植株的种子，记为样品Ａ和样品Ｂ。经成　根　，主产于四川遂宁，南充、达州、渠县、安岳以及重庆　都中医药大学马逾英教授鉴定，均为杭白芷Ａｎｇｅｌｉｃａ　南川等地。近年来，四川泸州、简阳等地也有栽培。　ｄａｈｕｒｉｃａ（Ｆｉｓｃｈ．ｅｘ　Ｈｏｆｆｍ．）Ｂｅｎｔｈ．ｅｔ　Ｈｏｏｋ．ｆ＿ｖａｒ．　收稿日期：２０１３—０７—２９　ｆｏｒｍｏｓａｎａ（Ｂｏｉｓｓ．）Ｓｈａｎ　ｅｔ　Ｙｕａｎ的种子。　作者简介：杨枝中（１９８４一），男，四川绵阳人；硕士，在读博士研究生，主　１．２试验方法　要从事中药品质研究；Ｅ—ｍｉａｌ：ｙｚｚｂｏｏｋ＠１２６．ｃｏｒｎ。　通讯作者：马逾英（１９５８一），女，重庆人；教授，博士生导师，主要从事中　１．２．１扦样　药品种、质量和资源开发研究；Ｅ・ｍｉａｌ：ｍａ—ｙｕｙｉｎｇ＠１２６．ｃｏｒｎ。　按《农作物种子检验规程》（ＧＢ／Ｔ　３５４３．２）［８　３的内　药材种苗质量分级具指导作用，关于不同山药品种的　［６］明鹤，杨太新，杜艳华．祁山药芦头种苗质量分级的研究　零余子种苗质量分级尚需进一步研究。　［Ｊ］．种子，２０１３，３２（５）：１１３—１１５．　［７］中华人民共和国国家标准ＧＢ／Ｔ　３５４３—１９９５《农作物种子　参考文献：　检验规程》［Ｓ］．　［１］国家药典委员会．中华人民共和国药典２０１０年版（一部）　［８］曹琦，王慷林，孙卫邦，等．灯盏花种子质量分级标准研究　【ｓ］．北京：中国医药科技出版社，２０１０：２７．　［Ｊ］．种子，２０１２，３１（１）：１０７—１０９．　［２］郭巧生．药用植物栽培学光盘版［Ｍ］．高等教育出版社，　［９］孟慧，杨云，陈波．海南降香檀种子质量分级标准研究［Ｊ］．　２００９．　种子，２０１２，３１（３）　２０—２２．　［３］赵冰，李建明，秦哗，等．山药不同繁殖材料所产零余子的形　［１０］李丽红，许有鹏，李龙云，等．青蒿种子品质检验及质量标　态学观测［Ｊ］．中药材，２００３，２６（６）：３３８—３３９．　准的研究［Ｊ］．种子，２００８，２７（１１）：１—４．　［４］周锁奎．山药“优种大株零余子”快速繁殖法研究［Ｊ］．中药　［１１］郭巧生，张贤秀，王艳茹，等．夏枯草种子品质检验及质量　材，２００６，２６（３）：５３３．　标准初步研究［Ｊ］．中国中药杂志，２００８，３４（７）：８１２—８１６．　［５］饶贵珍，吴亚宏．零余子处理对山药出苗及种薯产量的影响　［１２］贺玉林，李先恩，淡红梅，等．远志种子质量品质检验分级　［Ｊ］．江西园艺，２０００（３）：３１—３３．　标准研究［Ｊ］．种子，２００７，２６（１）：１０９—１１０．　・１１９・　第３２卷第ｌ２期２０１３年１２月　种子（Ｓｅｅｄ）　容进行。采用徒手法扦取初次样品后，将混匀样品倒　在光滑洁净的桌面或玻璃板上，用分样板将样品先纵　向混合，再横向混合，反复混合４～５次，然后将种子摊　平成四方形，用分样板划２条对角线，使样品分成４个　三角形，再取２个对顶三角形内的样品继续按上述方　法分取，直到２个三角形内的样品接近２份试验样品　的重量为止（不少于２　５００粒种子）。　１．２．２净度分析　将扦样得到的种子，称取约１２．９　ｇ，过２０目筛除　去小型杂质，再置于光滑洁净的桌面或玻璃板上，在不　损伤发芽力的基础上，利用镊子将净种子与杂质、空壳　和其他种子区分开。重复３次。　净种子率（％）＝净种子质量／（净种子质量＋空　壳质量＋其他种子质量＋杂质质量＋过筛杂质质　量）×１００％。　１．２．３真实性鉴定方法研究　每个样品随机抽取５０粒净种子，４次重复，逐粒　观察种子形态、大小、颜色，表面特性及横切面油管分　布情况等，记录数据，确定鉴别特征。　１．２．４重量测定方法研究　将净度、真实性检验后的纯净种子均匀混合，分别　考察百粒重、伍百粒重和千粒重。百粒法：随机数取８　份供试样品，每份１００粒，分别称重记录，计算标准差　及变异系数；伍百粒法：随机数取３份供试样品，每份　５００粒，分别称重记录，计算标准差和变异系数；千粒　法：随机数取２份供试样品，每份１　０００粒，分别称重　记录，计算标准差和变异系数。　１．２．５发芽试验方法研究　不同发芽床考察：培养箱设置２５℃／１８℃昼夜变　温，光照１２　ｈ。考察了５种发芽床（纸上、纸间、砂上、　砂间、皱褶纸上）。不同光照考察：培养箱设置２５℃／　１８℃昼夜变温。于砂上为发芽床考察了３种光照（光　照２４　ｈ、光照１２　ｈ、黑暗２４　ｈ）。并确定最适发芽条件　和首末次计数时间。每份材料每种处理随机数取１００　粒种子，３次重复。　发芽率（ＧＲ）（％）＝ｎ／Ｎ×１００％（ｎ为最终发芽　数；Ⅳ为供试种子数）。　待突破种皮的胚轴长度达到真种子自身长度时计　为发芽，并作为初次计数时间。种子萌发达到最高，以　后再无新萌发种子的天数为末次计数时间。　１．２．６水分测定方法研究　将种子粉碎，要求粉粒细度通过１．０　ｍｍ圆孑Ｌ筛，　并立即装入磨口瓶混匀备用。采用高恒温（１３３±　２）℃和低恒温（１０５±２）ｏＣ　２种方法。分别将洁净的　・１２０・　称量瓶置于烘箱烘干２　ｈ左右，取出放入干燥器内冷　却，称重。用感应量０．００１　ｇ的天平称取样品４～５　ｇ，　３次重复。分别置烘箱中，每隔１　ｈ取出置干燥器冷却　称重１次。测定时样品暴露在空气中的时间应不少于　２　ｍｉｎ。直至２次称量值差在０．００２　ｇ以下确定为恒重。　种子含水率（％）＝（　一　）／（　一Ｍ　）×　１００％（Ｍ　为称量瓶质量；　为称量瓶和烘前样品质　量；Ｍ３为称量瓶和烘后样品质量）。　１．２．７　生活力测定方法研究　（１）红墨水法：３０～３５℃浸种过夜，将种子沿胚的　中线纵切成两半。１００个半粒为１个重复，４次重复。　置于０．２％红墨水中浸染１Ｏ～１５　ｍｉｎ。取出清水冲洗　后记录，胚染成红色为有生活力的种子。　（２）溴麝香草酚兰（ＢＴＢ）法：取０．１％ＢＴＢ溶液　１００　ｍＬ置于烧杯中，加入１　ｇ琼脂，用小火加热并不断　搅拌，待琼脂完全溶解后，趁热倒在干洁的培养皿中，　使其成一均匀的薄层，冷却后备用。将３Ｏ一３５℃浸种　过夜的种子，１００粒为１个重复，４个重复，将种胚朝　下，平放，间距至少１　ｃｍ。然后将培养皿置于３０～３５　ｃＩ＝下培养２—３　ｈ，在蓝色背景下观察，如种胚附近呈现　较深黄色晕圈是有生活力的种子。　（３）四唑（Ｔｒｃ）法：３０～３５℃浸种过夜，将种子沿　胚的中线纵切成两半。１００粒为１个重复，４次重复。　置于不同浓度的Ｔｒｃ溶液中，在３Ｏ～３５℃避光染色，　胚染成红色为有生活力的种子。　１．２．８种子健康检验方法研究　对２份种子分别采用以下３种方法处理：（１）随　机取１０粒种子，不做处理；（２）ｌ０粒种子置于１０　ｍＬ　无菌水中静置１．５　ｈ；（３）１０粒种子置于１０　ｍＬ无菌水　中超声０．５　ｈ。分别将３种方法处理后的川白芷种子　接种于ＰＤＡ培养基上，每个培养皿接种１０粒种子，重　复３次。置于恒温培养箱２８　ｃ【＝培养３　ｄ。　种子带菌率（％）＝带菌种子数／供试种子数×　１００％。　２结果与分析　２．１扦样　按《农作物种子检验规程》（ＧＢ／Ｔ　３５４３．２）要求，　川白芷种子批的最大质量为１　０００　ｇ，送检样品最少为　１２０　ｇ，净度分析试样最少为１２　ｇ（不少于２５００粒种子）。　２．２净度分析　２份供试种子的净度分析结果见表１。使用此方　法作净度分析，各试样增失差距均没有偏离原始质量　的５％，所以此方法和程序切实可行。　种子检验　杨枝中等：川白芷种子质量检验方法研究　２．３真实性鉴定　此，选择光照１２　ｈ作为川白芷种子发芽最佳光照时间。　表３不同处理下川白芷种子发芽试验结果（ｎ＝３）　搓虽垒　不同处理　川白芷种子形态特征：为具翅双悬果，长圆形至卵　圆形，扁平，长５～８　ｍｍ，宽４～６　ｍｍ，厚０．７～１．６　ｍｍ。　表面黄绿色或淡黄色，两端钝圆，基部有的带小果柄。　搓晶旦　发芽启动日发芽率发芽启动日发芽率　（ｄ）　（％）　（ｄ）　（％）　果实极易分离成２个小分果。分果背面有纵棱５条，　背棱３条，明显，侧棱延展成翅，接合面较平坦。横切　面可见棱槽中有油管１，合生面有油管２。有特异香　气，味微苦、辛。　表１　ＪＩＩ白芷种子净度分析（ｎ＝３）　注：２个川白芷种子样品中不舍其它种子。　２．４重量测定　采用３种不同方法对川白芷种子重量分析比较的　结果见表２。２份供试材料采用百粒法和五百粒法的　变异系数都大于４．０％；而采用千粒法，２份供试材料　的变异系数都小于４．０％。因此，选千粒法用作川白　芷种子重量测定方法。　表２川白芷种子重量测定方法比较　２．５发芽试验　２．５．１发芽床　川白芷样品Ａ种子在砂上和纸上２个发芽床上　的发芽率较高，且砂上的发芽率最高，明显高于纸上；　川白芷样品Ｂ种子在不同发芽床上发芽率差异，与样　品Ａ基本一致，也是砂上的发芽率明显高于其他发芽　床。综上试验结果，选择砂上作为川白芷种子最适宜　的发芽床（见表３）。　２．５．２光照时间　由表３可看出，光照１２　ｈ，样品Ａ和样品Ｂ种子的　发芽率均明显高于光照２４　ｈ和黑暗２４　ｈ　２种处理。因　注：多重比较采用Ｄｕｎｃａｎ法，同１列不同小写字母表示在　＝０．０５　水平下各处理间差异显著（下同）。　２．５．３计数时间的确定　在最佳发芽条件下的２份供试材料发芽曲线见图　１。川白芷种子吸胀速度很慢，自种子置于发芽床上，　川白芷样品Ａ种子发芽启动时间为ｌ７．６７　ｄ，川白芷样　品Ｂ种子发芽启动时间为１３．３３　ｄ。第２８天后发芽速　率明显下降，并趋于平缓，３０　ｄ后元种子发芽。因此将　末次计数时间定为３０　ｄ。结合后期对大量川白芷种子　进行发芽试验的数据，有一部分供试材料的发芽启动　时间在９　ｄ左右，因此将初次计数时间定为９　ｄ。　７ｏ．ＯＯ　６０．００　５Ｏ．００　琶４０．００　壁３耜　０．００　２０．Ｏ０　１０．００　０．０ｏ　１３　１５　１７　１９　２１　２３　２５　２７　２９　３１　３３　３５　时间（ｄ）　图１砂上、光照１２　ｈ的川白芷种子发芽曲线　表４川白芷种子水分测定方法比较（ｎ＝２）（％）　２．６水分测定　采用２种方法对川白芷种子水分进行测定（结果　见表４）。高恒温法烘干，样品Ａ材料烘２　ｈ后无显著　变化，样品Ｂ材料烘３　ｈ后无显著变化，综合考虑认为　高恒温法烘３ｈ为宜；低恒温法烘干，样品Ａ材料烘　．１２１．　第３２卷第ｌ２期２０１３年１２月　种子（Ｓｅｅｄ）　Ｖｏ１．３２　Ｎｏ．１２　Ｄｅｅ．　２０１３　３　ｈ后无显著变化，样品Ｂ材料烘４　ｈ后　表５　１ＴｒＣ法测定１１Ｉ白芷种子生活力（ｎ＝４）　Ａ无显著变化，综合考虑认为低恒温法烘　４　ｈ为宜。但２种水分测定方法的结果　有一定的差异，可能是高恒温法致使材　料中少许挥发油散失，且低恒温法烘４　～５　ｈ含水量无显著变化，可以认为低恒　温烘干４　ｈ已达恒重。因此选择低恒温　法烘干４　ｈ作为川白芷种子水分测定的最佳方法。　２．７生活力测定　红墨水法测定２份供试材料种子平均生活力均不　到１０％，胚染色很淡，染色部位不够清晰，子叶部分无　法染色。ＢＴＢ法测定２份供试材料种子平均生活力均　不到４０％，且制作培养基比较费时，重复性差。不同　浓度ＴＦＣ溶液对２份供试材料染色不同时间的试验　结果见表５。０．７％ＴＩ＇Ｃ溶液中避光染色３　ｈ为最佳。　切开的川白芷种子在低浓度（浓度＜０．７％）Ｔｒｃ溶液　中染色效果不佳；川白芷种子在０．７％ＴＹＣ溶液中染　色３　ｈ，胚呈现深红色，子叶呈现浅红色，且界限清晰，　易于计数，重复性好，染色３　ｈ的青杆材料种子生活力　为５１．７５％，紫杆材料种子生活力为７５．７５％。因此，　选择０．７％ＴＹＣ溶液避光染色３　ｈ作为快速测定川白　芷种子生活力的最佳方法。　２．８种子健康测定　采用３种不同方法处理后的川白芷种子中均能分　离出真菌和细菌，试验结果见表６。不同处理后的种　子带菌率与带菌种类有一定的差异，Ａ种方法，即不处　理川白芷种子直接接种于ＰＤＡ培养基上，分离得到的　微生物多样性最丰富，建议采用该方法进行川白芷种　子健康度测定。　表６不同方法处理的川白芷种子带菌率及微生物种类　样品Ａ　样品Ｂ　处理　方法　带菌率（％）　种类（种）　带菌率（％）　种类（种）　真菌　细菌　真菌细菌　真菌　细菌真菌细菌　２．９川白芷种子质量检验方法的确定　根据上述试验结果，确定了适宜川白芷种子质量　指标的检验方法（表７）。　３讨论　本研究从扦样、净度分析、真实性鉴定、重量测定、　发芽试验、水分测定、生活力测定、健康度测定８个方　面对川白芷种子质量检验方法进行研究，确定了适宜　川白芷种子质量指标的检验方法，为制定川白芷种子　．１２２．　检验规程和分级标准奠定了基础。　在川白芷发芽试验方法研究中发现，川白芷种子　发芽启动时间较长，发芽率偏低。在该研究中，并未对　川白芷种子进行发芽前处理考察。如需完善川白芷发　芽试验方法研究，还应考虑对种子引发剂的考察，无菌　水浸泡种子２—３　ｄ可缩短种子发芽启动时间，生长调　节剂（赤霉素等）可提高种子发芽率。　在川白芷种子真实性鉴定研究中，本试验仅做了　其形态特征鉴别研究，然而仅从种子的外观形态难于　鉴别不同产地白芷种子及劣质的“公白芷”种子，尚待　进行其他鉴别方法研究，该工作正在进行中。　表７川白芷种子质量检验方法　项目　方法　扦样　送检样品最少１２０　ｇ，净度分析试样最少１２　ｇ　净度分析　过２０目筛后进行净度分析　真实性鉴定　外观形态鉴定和大小测量　重量测定　千粒法　发芽试验　２５　ｏｃ砂上为／１８ｏｃ耋蓑　温，Ｎ，Ｎ计数１２９ｈ～，３０　ｄ　水分测定　低恒温（１０５　４－２）ｑＣ，烘干时间４　ｈ　生活力测定３两０半－３．。．５　亭霪　军　健康度测定　种子不作处理，ｇｇ￣ＴＰＤＡ培养基上，　２８℃培养３　ｄ参考文献：　［１］万德光，彭成，赵军宁．四川道地中药材志［Ｍ］．成都：四川　科学技术出版社，２００５：１７４．　［２］贺玉林，李先恩，淡红梅．远志种子质量分级标准研究［Ｊ］．　种子，２００７，２６（１）：１０６—１０７．　［３］于福来，王文全，方玉强，等．甘草种子质量检验方法研究　［Ｊ］．中国中药杂志，２０１１，３６（６）：７４６—７５０．　［４］刘千，吴卫，罗浩．川牛膝种子质量检验方法研究［Ｊ］．中国　中药杂志，２０１１，３６（１１）：１　４２１—１　４２６．　［５］卢魏巍，朱再标，郭巧生，等．白花蛇舌草种子质量检验方法　研究［Ｊ］．中国中药杂志，２０１２，３７（１０）：１　３６６—１　３７１．　［６］淡红梅，祁建军，周丽莉，等．丹参种子质量检验方法的研究　［Ｊ］．中国中药杂志，２００８，３３（１７）：２０９０—２０９３．　［７］单成刚，张教洪，朱连先，等．栝楼种子质量分级标准的研究　［Ｊ］．种子，２０１１，３０（５）：１１５—１１８．　［８］中华人民共和国国家标准．农作物种子检验规程（ＧＢ／Ｔ　３５４３—１９９５）［Ｓ］．北京：中国标准出版社，１９９５．　∞０∞０３３∞Ｏ如０１３