以靛酚乙酸酯为底物的酯酶同工酶显色方法的研究

第２７卷第２期　２０１０年４月　生物学杂志　ＪＯＵＲＮＡＬ　ＯＦ　ＢＩＯＬＯＧＹ　Ｖｏ１．２７　Ｎｏ．２　Ａｐｒ，２０１０　ｄｏｉ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１００８—９６３２．２０１０．０２．０９１　以靛酚乙酸酯为底物的酯酶同工酶显色方法的研究　（１．广西大学生命科学与技术学院，南宁５３０００５；２．谢庆武　，肖桂秋　　，黄敏萍　华南师范大学生命科学学院，广州５１０６３１）　摘要：建立一种以靛酚乙酸酯为底物的酯酶同工酶的显色新方法。酯酶样品的聚丙烯酰胺凝胶电泳（ＰＡＧＥ）凝　胶用磷酸缓冲液漂洗约ｌＯｍｉｎ后，浸入含有０．００２％靛酚乙酸酯的溶液显色５～１０ｍｉｎ，可显出清晰的蓝色酯酶带。　先将酯酶凝胶板浸于有机磷农药溶液中，然后再用靛酚乙酸酯显色液显色，比较同工酶谱，从同工酶带由深蓝色变　为浅蓝色的颜色变化，可以看出对有机磷农药敏感的同工酶所受到的抑制程度。　关键词：酯酶；同＿Ｙ－酶；靛酚乙酸酯；有机磷农药　中图分类号：Ｑ５５；￥４８１　．８　文献标识码：Ｂ　文章编号：１００８—９６３２（２０１０）０２—００９１—０２　Ｓｔｕｄｙ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｓｔａｉｎｉｎｇ　ｍｅｔｈｏｄ　ｆｏｒ　ｅｓｔｅｒａｓｅ　ｉｓｏｚｙｍｅｓ　ｕｓｉｎｇ　ｄｉｃｈｌ０ｒＯｉｎｄ０ｐｈｅｎ０ｌ　ＸＩＥ　Ｑｉｎｇ—ＷＵ　，ＸＩＡＯ　Ｇｕｉ—ｑｉｕ　，ＨＵＡＮＧ　Ｍｉｎ—ｐｉｎｇ　（１．Ｃｏｌｌｅｇｅ　ｏｆ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　ａｎｄ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｇｕａｎｇｘｉ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｎａｎｎｉｎｇ　５３０００５；　２．Ｃｏｌｌｅｇｅ　ｏｆ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｓｏｕｔｈ　Ｃｈｉｎａ　Ｎｏｒｍａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ　５１０６３１，Ｃｈｉｎａ）　Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ａ　ｎｅｗ　ｓｔａｉｎｉｎｇ　ｍｅｔｈｏｄ　ｆｏｒ　ｅｓｔｅｒａｓｅ　ｉｓｏｚｙｍｅｓ　ｕｓｉｎｇ　ｄｉｃｈｌｏｒｏｉｎｄｏｐｈｅｎｏｌ　ａｓ　ｓｕｂｓｔｒａｔｅ　ｗａｓ　ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ．Ａｆｔｅｒ　ｒｉｎｓｅｄ　ｉｎ　ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　ｂｕｆｆｅｒｅｄ　ｓｏｄｉｕｍ　ｏｆｒ　ａｂｏｕｔ　１０ｍｉｎ，ｔｈｅ　ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ　ｇｅｌ　ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ（ＰＡＧＥ）ｇｅｌｓ　ｗｅｒｅ　ｉｎｃｕｂａｔｅｄ　ｉｎ　ａ　ｓｏｌｕｔｉｏｎ　ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ　０．００２％　ｄｉｃｈｌｏｒｏｉｎｄｏｐｈｅｎｏｌ　ｆ＿０ｒ　１０～１５　ｍｉｎ，ａｎｄ　ｔｈｅｎ　ｔｈｅ　ｃｌｅａｒ　ｂｌｕｅ　ｂａｎｄｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｅｓｔｅｒａｓｅ　ｉｓｏｚｙｍｅｓ　ｗｅｒｅ　ｖｉｓｕａｌｉｚｅｄ．Ｗｈｅｎ　ｔｈｅ　ｇｅｌｓ　ｗｅｒｅ　ｆｉｒｓｔ　ｉｎ—　ｃｕｂａｔｅｄ　ｉｎ　ａ　ｓｏｌｕｔｉｏｎ　ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ　ｏｒｇａｎｏｐｈｏｓｐｈｏｒｕｓ　ｐｅｓｔｉｃｉｄｅ。ｆｏｌｌｏｗｅｄ　ｂｙ　ｉｎｃｕｂａｔｉｎｇ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｄｉｃｈｌｏｒｏｉｎｄｏｐｈｅｎｏｌ—ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ　ｓｔａｉｎｉｎｇ　ｓｏｌｕ—　ｔｉｏｎ，ｂｙ　ｃｏｍｐａｒｉｎｇ　ｔｈｅ　ｅｓｔｃｒａｓｅ　ｐａｔｔｅｒｎｓ，ｔｈｅ　ｅｓｔｅｒａｓｅ　ｉｓｏｚｙｍｅ　ｗｈｉｃｈ　ｗａｓ　ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ　ｔｏ　ｔｈｅ　ｏｒｇａｎｏｐｈｏｓｐｈｏｒｕｓ　ｐｅｓｔｉｃｉｄｅ　ｗａｓ　ｆｏｕｎｄ　ｔｏ　ｂｅ　ｉｎ—　ｈｉｂｉｔｅｄ　ｂｅｃａｕｓｅ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｄｉｓｔｉｎｇｕｉｓｈａｂｌｅ　ｃｏｌｏｕｒ　ｃｈａｎｇ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｉｓｏｚｙｍｅ　ｂａｎｄｓ　ｆｒｏｍ　ｄｅｅｐ・ｂｌｕｅ　ｔｏ　ｌｉｇｈｔ—ｂｌｕｅ．　Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｅｓｔｅｒａｓｅ　ｉｓｏｚｙｍｅ；ｄｉｃｈｌｏｒｏｉｎｄｏｐｈｅｎｏｌ；ｏｒｇａｎｏｐｈｏｓｐｈｏｒｕｓ；ｐｅｓｔｉｃｉｄｅ　酯酶同工酶的电泳分析在生物分类研究　“　、生　残留检测市场都已得到广泛的应用。该速测卡生产的　物抗药性机理研究　、致病机理研究　、物种起源关　关键技术是对农药敏感的酶源的筛选和提取。对农药　系探索　等方面应用广泛。经典的酯酶显色方法以　敏感的酯酶可来自动物、植物和微生物，其中酯酶同工　ｄ一乙酸萘酯（０【一ＮＡ）和Ｄ一乙酸萘酯（ｐ—ＮＡ）为底物，用　酶中不同的酶带对农药的敏感度可能差别很大。如果　偶氮色素（常用坚牢蓝ＲＲ盐）显色　，尽管后来有　能够快速检测这些酯酶同工酶对农药的敏感度，将有　一些作者对该显色方法进行了一些改良　，但底物　助于酶源的筛选。由于目前尚未见用靛酚乙酸酯为底　都离不开乙酸萘酯。该法的缺点在于显色时问较长，　物进行酯酶同工酶显色的报道，所以我们对该法开展　底物因溶解性不好而容易析出。　了初步的研究，取得了较好的显色结果。　乙酰胆碱酯酶在神经传导物质乙酰胆碱的分解方　１　材料和方法　面具有关键的作用。有机磷和氨基甲酸酯类农药能抑　１．１　材料　制乙酰胆碱酯酶，造成乙酰胆碱的积累，从而影响正常　酯酶产生菌ＣｈＥ１、ＣｈＥ２、ＣｈＥ３、ＣｈＥ４、ＣｈＥ５为本　的神经传导，使昆虫或其他动物中毒甚至致死。乙酰　实验室筛选、保存的菌株。　胆碱酯酶受有机磷和氨基甲酸酯类农药不可逆抑制之　１．２　主要仪器　后，不能将红色的靛酚乙酸酯水解为蓝色的靛酚，根据　电泳仪与垂直电泳槽，凝胶扫描仪，ＨＹＧ—ＩＩ恒温　该原理所研制出来的农药速测卡在国际和国内的农药　摇床，ＪＹ９２一ＩＩ型超声波细胞破碎仪，高速冷冻离心机。　收稿日期：２００９—０２—２５　作者简介：肖桂秋（１９８３一），男，汉，硕士研究生，专业方向微生物生物技术，Ｅ－ｍａｉｌ：ｘｉａｏｇｕｉｑｉｕ＠１２６．ｃｏｒｎ；　通讯作者：谢庆武（１９５９一），男，汉，副研究员，硕士生导师，研究方向微生物生物技术，Ｅ—ｍａｉｌ：ｘｉｅｑｉｎｇｗｕ＠ｓｉｎａ．ｃｏｍ。　９１　第２７卷第２期　２０１０年４月　生物学杂志　ＪＯＵＲＮＡＬ　ＯＦ　ＢＩＯＬＯＧＹ　ＶｏＩ＿２７　Ｎｏ．２　Ａｐｒ，２０１０　１．３　方法　３０ｒａｉｎ，新法显色需５～１０ｒａｉｎ，显色结果见图１。　靛酚乙酸酯由南宁金肽公司提供，　１　２　３　４　５　１　２　３　４　５　１．３．１　主要试剂一醋酸萘酯为上海青浦合成试剂厂产品，Ｂ一醋酸萘酯　为上海试剂一厂产品，坚牢蓝ＲＲ盐为中国医药集团　上海化学试剂公司产品，丙烯酰胺、双丙烯酰胺、Ｔｒｉｓ、　甘氨酸、甘油、盐酸等均为国产分析纯试剂。　１．３．２显色液配制　显色液ａ：取ｏｔ－醋酸萘酯、Ｂ一醋酸萘酯、坚牢蓝ＲＲ　各５０ｍｇ，分别用１０ｍＬ丙酮溶解后混合，再用０．１　ｍｏｌｆＬ，ｐＨ值６．４磷酸缓冲液定容至５０ｍＬ。　显色液ｂ：取５００ｔｘＬ　０．２％靛酚乙酸酯母液（用丙　酮溶解０．２ｇ靛酚乙酸酯并定容至１００ｍＬ），加入到　５０ｍＬ　０．１ｍｏｌ／Ｌ，ｐＨ值７．０的磷酸缓冲液中。　１．３．３酯酶粗酶提取　将菌株接种到装有１００ｍＬ　ＬＢ培养基的２５ＯｒａＬ三　角瓶中，３７℃振荡培养２４ｈ后，离心收集菌体，经０．０５　ｍｏｌ／Ｌ，ｐＨ值７．０磷酸缓冲液洗涤２次后，用适量的　０．０５ｍｏｌ／Ｌ，ｐＨ值７．０的磷酸缓冲液悬浮后，加ＰＭＳＦ　至终浓度１ｍｍｏｌ／Ｌ，然后进行超声波破壁，低温离心收　集上清即为粗酶液。　１．３．４　聚丙烯酰胺凝胶电泳（ＰＡＧＥ）　聚丙烯酰胺不连续凝胶电泳参考陈曾燮等　，浓　缩胶浓度６％（用核黄素催化光聚合），分离胶浓度　８％（用过硫酸铵催化聚合）。样品进入浓缩胶时电压　恒定在７０Ｖ，进入分离胶后恒定在２００Ｖ，４℃条件下　进行电泳。　１．３．５　酯酶同工酶显色　１．３．５．１　以醋酸萘酯为底物的显色法（以下简称经　典法）　电泳结束后，将凝胶板浸入显色液ａ中，于　３７＂１２保温至酶带清晰出现（２０～３０ｍｉｎ）后，马上进行凝　胶扫描记录。　１．３．５．２　以靛酚乙酸酯为底物的显色法（以下简称　新法）　电泳结束后，将凝胶板浸入０．１ｍｏｌ／Ｌ，ｐＨ值　７．０磷酸缓冲液中振荡漂洗１０ｍｉｎ，再浸入显色液ｂ　中，于３７＂１２保温直至酶带清晰出现（５～１０ｍｉｎ）后，马　上进行凝胶扫描记录。　１．３．６酯酶同工酶受有机磷农药抑制后的显色　将凝胶板经０．１ｍｏｌ／Ｌ，ｐＨ值７．０磷酸缓冲液漂洗　后，浸入不同浓度的有机磷农药中２０ｍｉｎ后，再浸入酯　酶显色液ｂ中进行显色。　２　结果与分析　２．１　以靛酚乙酸酯为底物的酯酶同工酶显色　在一块ＰＡＧＥ平板的左右两部分将酯酶样品１～５　（分别从ＣｈＥ１、ＣｈＥ２、ＣｈＥ３、ＣｈＥ４、ＣｈＥ５菌株提取）按　相同上样量加入两套样品，电泳结束后纵向分成２块，　然后分别用经典法和新法进行显色，经典显色需ｌ５～　９２　Ａ　Ｂ　图１　分别用靛酚乙酸酯显色（Ａ）和ＮＡ一坚牢蓝显色　（Ｂ）的酯酶样品１～５的酯酶同工酶谱　Ｆｉｇ　１　Ｅｓｒｔｅｒｓｅ　ｉｓｏｚｙｍｅ　ｐａｔｔｅｒｎｓ　ｆｏｒ　ｅｓｒｔｅｒｓｅ　ｓａｍｐｌｅｓ　１　５　ｓｔａｉｎｅｄ　ｒｅｓｐｅｃ—　ｔｉｖｅｌｙ　ｗｉｔｈ　ｄｉｅｈｌｏｒｏｉｎｄｏｐｈｅｎｏｌ（Ａ）ａｎｄ　ＮＡ・Ｆａｓｔ　ｂｌｕｅ（Ｂ）　如图ｌ所示，经典法显色的酶带显粉红色，新法显　色的酶带显蓝色，所得的酶谱基本上是相同的。　２．２酯酶受有机磷农药抑制后的同工酶显色　在一块ＰＡＧＥ平板上将酯酶样品３、４、５按相同上　样量加入３套样品，电泳结束后纵向分成３块，然后分　别浸入０．００、０．０２和０．２ｍｇ／Ｌ的敌敌畏溶液２０ｍｉｎ　后，再浸入显色液ｂ中进行显色，ａ　结果见图２。ｅ　ｂ　ｆ　　ｇ　ｄ　Ｃ　１　２　３　１　２　３　１　２　３　Ａ　Ｂ　Ｃ　图２经不同浓度敌敌畏（Ａ：０．００ｍｇ／Ｌ，Ｂ：０．０２ｍｇ／Ｌ，Ｃ：０．２０ｍｇ／Ｌ）　抑制后酯酶样品（１：ＣｈＥ３，２：ＣｈＥ５，３：ＣｈＥ４）在靛酚乙酸酯中显色的　酶谱的比较　Ｆｉｇ　２　Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｅｓ￣ｅｒｓｅ　ｐａｔｔｅｒｎｓ　ｆｏｒ　ｅｓｒｔｅｒｓｅ　ｓａｍｐｌｅｓ　１～３（１：　ＣｈＥ３，２：ＣｈＥ５，３：ＣｈＥ４）ｓｔａｉｎｅｄ　ｗｉｔｈ　ｄｉｃｈｌｏｒｏｉｎｄｏｐｈｅｎｏｌ（Ａ：０．０ｍｇ／Ｌ，　Ｂ：０．０２ｍｇ／Ｌ，Ｃ：Ｏ．２ｍｇ／Ｌ）ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ　ｔｈｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ　ｗｉｔｈ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｄｏｓｅｓ　ｏｆ　ｄｉｃｈｌｏｒｏｖｏｓ　如图２所示，经不同浓度的敌敌畏抑制后，不同的　酶带显色变化明显不同，将同工酶图谱进行比较，可以　看出ｂ带、ｆ带显色变化非常明显，ｄ带、ｅ带、ａ带、ｃ带　和ｆ带的显色基本不变，由此可以判断ｂ带和ｆ带对敌　敌畏都很敏感，其余的酶带都不敏感，经过纯化的ｂ带　和ｆ带的酯酶都有可能用于敌敌畏残留的检测。　３讨论　（下转９５页）　第２７卷第２期　２０１０年４月　生物学杂志　ＪＯＵＲＮＡＬ　ＯＦ　ＢＩＯＬＯＧＹ　ＶｏＬ　２７　Ｎｏ．２　Ａｐｒ，２０１０　按照专业方向的需要，分别建立起石蜡切片、分子、生　理生化、微生物发酵、细胞、组培、污染生态实验室。在　教学内容，进行筛选、组合，吸取精华内容，并及时吸收　反映现代经济技术发展的最新内容和最新成果，尤其　是本专业国内外最新的观点和成果，使硕士生了解学　科的前沿。（２）进一步加强对外交流，增强与兄弟院　校合作，扩大学院在国内外的知名度。（３）逐步完善　课程内容上，积极开设设计性、综合性、创造性的开放　实验，同时，鼓励学生将物理学、化学和医学等领域的　技术应用到解决生物学的问题中来，还要积极把生物　学实验和产学研紧密结合起来，培养具有适应现代科　技创新的新世纪实验人才。　３．６开设系列讲座，拓宽知识面　自从生命科学一级硕士点开设以来，学院１３益增　硕士生教学的评估体系，提高授课效率。要从课程内　容、教学方式、产出质量等多维度出发全面考核硕士课　程教学评估体系。对于课程内容，要将连续几次的研　究生课程教学评估结果，作为重新修改、设置研究生课　加与国内外合作交流，２００４年以来，通过“走出去、请　程的依据。在教学方式上，要吸收先进的教育理念，强　进来”的方式，先后邀请众多国内外学者来学院作报　调自主学习，鼓励“以学生为中心”及“解疑为本”的学　告。并先后举办召开了“全国植物进化生物学学术研　习方法。相信在不久的将来会培养出一批具有生物学　讨会”，“分子进化与生物多样性国际研讨会预备会”　理论基础知识与专门知识，掌握现代生物学实验技术，　等交流大会，大大增进了学院与全国兄弟院校的交流　了解生物学发展的前沿领域和动态，能够适应我国经　和合作，同时拓宽了硕士生的知识面，也提高了硕士点　济、科技、教育发展需要，面向２１世纪从事生物学教学　建设的经验和教训。　和研究的高层次人才。　４展望　今后，研究生课程设置应充分体现“厚基础、精专　参考文献：　业、分层次、讲实用、重科学、具前瞻”的原则，具体从以　［１］李红英．我国硕士研究生课程设置的现状、问题及改进［Ｊ］．煤　下几个方面着手：（１）跟踪国际生物学发展的热点和　炭高等教育，２００６，２４（２）：７６—７８．　［２］陈忠文．职业教育发展面临的问题与对策［Ｊ］．科学时代（综合　前沿，及时更新课程设置。从科学性、专业性、应用性、　版），２００７，１１：１２５—１２８．　前沿性的原则出发，对教学内容进行扩充、调整、更新　［３］汪旭晖．我国高等院校精品课程建设的战略性思考［Ｊ］．教育研　和完善。用现代教育观念审视、选择和组织好传统的　究，２００８．２：１９１—１９２．　（上接９２页）　微生物学通报，２００５，３２（４）：２０～２４．　以靛酚乙酸酯为底物进行酯酶同工酶显色，理论　［３］孙霞，王波，张天宇．链格孢菌酯酶同工酶分析及其分类学意　上是可行的，实验所得到的结果也比较好。该法的主　义［Ｊ］．茵物研究，２００７，５（４）：２２９—２３２．　要优点是显色所需时间比较短，所显酶带为蓝色，反差　［４］郭晓霞，郑哲民，于广志．酯酶同工酶多态性及其在昆虫分类学　比较大，由于目前国内用于市场上蔬菜农药残留检测　中的应用价值．昆虫知识［Ｊ］，２０００，３７（６）：３７１—３７４．　［５］乔传令，王靖，邢建民．不同地区小菜蛾种群的抗药性及酯酶同　的农药速测卡的显色试剂是靛酚乙酸酯，与该同工酶　工酶的研究［Ｊ］．农药学学报，２０００，２（４）：３３—３９．　显示法所用底物完全相同，因此特别适用于有机磷农　［６］李孟楼，郭新荣，庄世宏，等．马桑毒素致毒后试虫酯酶同工酶变　药残留检测酶源的筛选和纯化的研究。主要缺点是酶　化的时序分析［Ｊ］．西北林学院学报，２０００。１５（４）：５７—６１．　带容易扩散，凝胶板不易保持。　ｆ７］肖　芸，王燕，戴志敏，等．肝病患者血清酸性ａ一醋酸萘酯酶及　显色前胶板必须用磷酸缓冲液振荡漂洗，否则在　其同工酶的变化［Ｊ］．世界华人消化杂志，２００４，１２（８）：１９３２—　分离胶ｐＨ值８．９的碱性条件下，靛酚乙酸酯容易自动　１９３３．　［８］胡能书，万贤国．同工酶技术及其应用［Ｍ］．长沙：湖南科学技术　分解为蓝色的靛酚，使酶促显色无法进行，此外，在磷　出版社，１９８５，７５—７６．　酸缓冲液中酯酶同工酶的显色效果也较好。浓缩胶采　［９］付焕延．遗传学实验［Ｍ］．济南：山东科学技术出版社，１９８７，　用核黄素来催化聚合，可防止过硫酸铵产生的自由基　１１４．　对酯酶的氧化，否则酶活力会大大降低。　［１Ｏ］卢　萍，刘　军，邬惠梅．一种新的酯酶同工酶染色方法『Ｊ１．　该新显色法在靛酚乙酸酯浓度的选择和防止酶带　内蒙古师大学报（自然科学汉文版），１９９９，２８（４）：３２７—３２８．　扩散等方面仍然有一些可能改进之处，有待今后进一　［１１］赵赣，钱芳，凌彬冰，等．酯酶同工酶的醋酸萘酯一铁氰化钾　染色法的研究［Ｊ］．上海交通大学学报（农业科学版）２００３，２１：　步研究　８７—９０．　ｆ１２］赵赣，钱芳，曹永长，等．酯酶同工酶的一种新染色法的初步　参考文献：　研究［Ｊ］．江西农业大学学报（自然科学版）２００２，２４（３）：３８０—　［１］丁锐．利用酯酶同工酶谱鉴定黑稻品种纯度的研究［Ｊ］．种子　３８２．　科技，２００５，３（４）：２２４—２２６．　［１３］陈曾燮，刘兢，罗　丹．生物化学实验［Ｍ］．北京：中国科学技　［２］秦俊哲，谷砷睿，陈合．１４个灵芝菌株的酯酶同工酶分析［Ｊ］．　术大学出版社，１９９４，２１—２５．　９５