柯萨奇病毒A组16型疫苗候选株减毒特性的分析

中国生物制品学杂志２０１５年５月第２８卷第５期Ｃｈｉｎ　Ｊ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ　Ｍａｙ　２０１５，Ｖｏ１．２８　Ｎ０．５　・４４１・　疫苗研究　柯萨奇病毒Ａ组１　６型疫苗候选株　减毒特性的分析　杨水芝，谢天宏，李华，姜广菊，龙润乡，杨婷，岳磊，罗芳宇，朱凡丽，谢忠平　中国医学科学院北京协和医学院医学生物学研究所云南省重大传染病疫苗工程技术研究中心　云南省重大传染病疫苗研发重点实验室，云南昆明６５０１　１８　摘要：目的对柯萨奇病毒Ａ组１６型（ｃｏｘｓａｃｋｉｅｖｉｒｕｓ　Ａ１６，ＣＡ１６）减毒活疫苗候选株进行初步分析，为ＣＡ１６减毒活　疫苗的研制奠定基础。方法将两株ＣＡ１６疫苗候选株（ＫＭ１６８和ＫＭ１５４）进行低温连续传代减毒，对不同代次病毒　进行减毒特性的分析。将候选株病毒收获液免疫ＩＣＲ乳鼠（颅内注射）及ＩＣＲ成鼠（腹腔注射），分别评价减毒疫苗候　选株的毒力、免疫原性以及乳鼠作为减毒活疫苗残余毒力评价动物模型的可行性；对病毒进行ＶＰ１片段的测序，分　析遗传稳定性。结果两个候选株经低温连续传代后，均具有稳定的生长特性及良好的免疫原性，感染性滴度均保持　在约７．０　ＬｇＣＣＩＤ，。／ｍｌ，免疫小鼠后抗体阳转率达１００％，最高ＧＭＴ约１：３０。乳鼠及成鼠感染病毒后，在大部分组织　中能检测到ＣＡ１６病毒；ＫＭ１５４株在第１２代后未对乳鼠产生临床致病性及致死率，病理检测结果主要表现为少量炎　性细胞集结，无明显组织损伤，随着传代增加，组织损伤明显减少。两个候选株经低温连续传代后，能保证ＶＰ１片段　的遗传稳定性。结论低温连续传代可使ＣＡ１６的毒力明显降低，有望筛选出减毒活疫苗的候选株；１　２日龄ＩＣＲ　乳鼠可以作为ＣＡ１６减毒活疫苗的候选株毒力评价的动物模型。　关键词：柯萨奇病毒；疫苗；减毒株　中图分类号：Ｒ３７３．２＋３　Ｒ３９２—３３文献标识码：Ａ文章编号：１００４—５５０３（２０１５）０５．０４４１—０８　Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ　ｏｆ　ｌｉｖｅ　ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ　ｃｏｘｓａｃｋｉｅｖｉｒｕｓ　Ａ１６　ｃａｎｄｉｄａｔｅ　ＶａＣＣｌｎｅ　ｓｔｒａｉｎ　ＹＡＮＧ　Ｓｈｕｉ－ｚｈｉ，ＸＩＥ　Ｔｉａｎ－ｈｏｎｇ，ＬＩ　Ｈｕａ，ＪＩＡＮＧ　Ｇｕａｎｇ－ｊｕ，ＬＯＮＧ　Ｒｕｎ—ｘｉａｎｇ，　ＹＡＮＧ　Ｔｉｎｇ，ＹＵＥ　Ｌｅｉ，ＬＵＯ　Ｆａｎｇ—ｙｕ，ＺＨＵ　Ｆａｎ—ｌｉ，ＸＩＥ　Ｚｈｏｎｇ－ｐｉｎｇ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　ｏｆＭｅｄｉｃａｌ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｆＭｅｄｉｏｃａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅ＆Ｐｅｋｉｎｇ　Ｕｎｉｏｎ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｃｏｌｌｅｇｅ．Ｙｕｎｎａｎ　Ｋｅｙ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｆ　ｏＶａｃｃｉｎｅ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　ａｎｄ　Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　ｏｎ　Ｓｅｖｅｒｅ　Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ　Ｄｉｓｅａｓｅｓ，Ｋｕｎｍｉｎｇ　６５０１１８，　Ｙｕｎｎａｎ　Ｐｒｏｖｉｎｃｅ，Ｃｈｉｎａ　Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ　ａｕｔｈｏｒ：ＸＩＥ　Ｚｈｏｎｇ－ｐｉｎｇ，Ｅ－ｍａｉｌ：ｘｚｐ２１８＠１２６．ｃｏｍ　Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ　Ｔｏ　ｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｉｌｙ　ａｎａｌｙｚｅ　ｔｈｅ　ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ　ｏｆ　ｌｉｖｅ　ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ　ｃｏｘｓａｃｋｉｅｖｉｒｕｓ　Ａ１６（ＣＡ１６）ｖａｃｃｉｎｅ　ｃａｎｄｉｄａｔｅ　ｓｔｒａｉｎ　ａｎｄ　ｌａｙ　ａ　ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｖａｃｃｉｎｅ．Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｔｗｏ　ＣＡ１６　ｖａｃｃｉｎｅ　ｃａｎｄｉｄａｔｅ　ｓｔｒａｉｎｓ，　ＫＭ１６８　ａｎｄ　ＫＭ１５４，ｗｅｒｅ　ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ　ｂｙ　ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ　ｓｕｂｃｕｌｔｕｒｅ　ａｔ　ｌｏｗ　ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｓ，ａｎｄ　ｔｈｅ　ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ　ｏｆ　ｖａｒｉｏｕｓ　ｐａｓｓａｇｅｓ　ｗｅｒｅ　ａｎａｌｙｚｅｄ．Ｓｕｃｋｌｉｎｇ　ａｎｄ　ａｄｕｌｔ　ＩＣＲ　ｍｉｃｅ　ｗｅｒｅ　ｉｍｍｕｎｉｚｅｄ　ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ｃａｎｄｉｄａｔｅ　ｓｔｒａｉｎ　ｂｙ　ｉｎｔｒａｃｅｒｅｂｒａｌ　ａｎｄ　ｉｎｔｒａｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ　ｉｎｊｅｃｔｉｏｎｓ　ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ　ｔｏ　ｅｖａｌｕａｔｅ　ｔｈｅ　ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ　ａｎｄ　ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ　ａｓ　ｗｅｌｌ　ａｓ　ｔｈｅ　ｆｅａｓｉｂｉｌｉｔｙ　ｏｆ　ｎｅｗｂｏｒｎ　ｍｉｃｅ　ａｓ　ａ　ｍｏｄｅｌ　ｆｏｒ　ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｒｅｓｉｄｕａｌ　ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ　ｏｆ　ｌｉｖｅ　ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ　ｖａｃｃｉｎｅ．Ｔｈｅ　ＶＰ１　ｆｒａｇｍｅｎｔ　ｏｆ　ｖｉｒｕｓ　ｗａｓ　ｓｅｑｕｅｎｃｅｄ　ｔｏ　ａｎａｌｙｚｅ　ｔｈｅ　ｇｅｎｅｔｉｃ　ｓｔａｂｉｌｉｔｙ．Ｒｅｓｕｌｔｓ　Ｂｏｔｈ　ｔｈｅ　ｃｏｌｄ－ａｄａｐｔｅｄ　ｃａｎｄｉｄａｔｅ　ｓｔｒａｉｎｓ　ｓｈｏｗｅｄ　ｓｔａｂｌｅ　ｇｒｏｗｔｈ　ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ　ａｎｄ　ｇｏｏｄ　ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ，ｏｆ　ｗｈｉｃｈ　ｔｈｅ　ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ　ｔｉｔｅｒｓ　ｗｅｒｅ　ａｂｏｕｔ　７．０　ＬｇＣＣＩＤ５０／ｍ１．Ｔｈｅ　ａｎｔｉｂｏｄｙ　ｐｏｓｉｔｉｖｅ　ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ　ｒａｔｅ　ｏｆ　ｉｍｍｕｎｉｚｅｄ　ｍｉｃｅ　ｒｅａｃｈｅｄ　１００％，ｗｈｉｌｅ　ｔｈｅ　ｍａｘｉｍｕｍ　ＧＭＴ　ｒｅａｃｈｅｄ　１：３０．ＣＡ１６　ｗａｓ　ｄｅｔｅｃｔｅｄ　ｉｎ　ｍｏｓｔ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｔｉｓｓｕｅｓ　ｏｆ　ｓｕｃｋｌｉｎｇ　ａｎｄ　ａｄｕｌｔ　ｍｉｃｅ．ＫＭ１５４　ｓｔｒａｉｎ　ｏｆ　ｍｏｒｅ　ｔｈａｎ　ｐａｓｓａｇｅ　１２　ｓｈｏｗｅｄ　ｎｏ　ｐａｔｈｏｐｏｉｅｓｉｓ　ｏｒ　ｌｅｔｈａｌｉｔｙ　ｔｏ　ｓｕｃｋｌｉｎｇ　ｍｉｃｅ，ｏｆ　ｗｈｉｃｈ　ｔｈｅ　ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ　ｅｘａｍｉｎａｔｉｏｎ　ｓｈｏｗｅｄ　ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ　ｏｆ　ａ　ｓｍａｌｌ　ｑｕａｎｔｉｔｙ　ｏｆ　ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ　ｃｅｌｌｓ　ｗｈｉｌｅ　ｎｏ　ｏｂｖｉｏｕｓ　ｉｎｊｕｒｙ　ｏｆ　ｔｉｓｓｕｅ，ａｎｄ　ｔｈｅ　ｉｎｊｕｒｙ　ｄｅｃｒｅａｓｅｄ　ｓｉｇｎｉｉｆｃａｎｔｌｙ　ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ　ｐａｓｓａｇｅｓ．Ｔｈｅ　ｇｅｎｅｔｉｃ　ｓｔａｂｉｌｉｔｙ　ｏｆ　ＶＰ１　ｆｒａｇｍｅｎｔ　ｗａｓ　ｅｎｓｕｒｅｄ　ａｆｔｅｒ　ｓｕｂｃｕｈｕｒｅ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｔｗｏ　ｃａｎｄｉｄａｔｅ　ｓｔｒａｉｎｓ　ａｔ　ａ　ｌｏｗ　ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ　Ｓｕｂｃｕｌｔｕｒｅ　ａｔ　ａ　ｌｏｗ　ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ　ｄｅｃｒｅａｓｅｄ　ｔｈｅ　ｖｉｕｌｅｎｃｅ　ｏｆ　ＣＡ１６　ｓｉｒｇｎｉｉｆｃａｎｔｌｙ，ｉｎｄｉｃａｔｉｎｇ　ｔｈａｔ　ｉｔ　ｗａｓ　ｈｏｐｅｆｕｌ　ｔｏ　ｓｃｒｅｅｎ　ｔｈｅ　ｃａｎｄｉｄａｔｅ　ｓｔｒａｉｎｓ　ｆｏｒ　ｌｉｖｅ　基金项目：云南省重点新产品开发计划项目（２０１２ＢＣ００６）　通讯作者：谢忠平，Ｅ－ｍａｉｌ：ｘｚｐ２１８＠１２６．（２０１／１　・４４２・　中国生物制品学杂志２０１５年５月第２８卷第５期Ｃｈｉｎ　Ｊ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ　Ｍａｙ　２０１５，Ｖｏ１．２８　Ｎｏ．５　ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ　ｖａｃｃｉｎｅ．Ｓｕｃｋｌｉｎｇ　ＩＣＲ　ｍｉｃｅ　ａｔ　ａｇｅ　ｏｆ　１—２　ｄ　ｍｉｇｈｔ　ｂｅ　ｕｓｅｄ　ａｓ　ａｎ　ａｎｉｍａｌ　ｍｏｄｅｌ　ｆｏｒ　ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ　ｏｆ　ｌｉｖｅ　ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ　ＣＡ１６　ｖａｃｃｉｎｅ．　Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：Ｃｏｘｓａｃｋｉｅｖｉｒｕｓ；Ｖａｃｃｉｎｅ；Ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ　ｓｔｒａｉｎ　手足口病（ｈａｎｄ，ｆｏｏｔ　ａｎｄ　ｍｏｕｔｈ　ｄｉｓｅａｓｅ。ＨＦＭＤ）　是由多种肠道病毒引起的丙类法定传染病，发病多　见于婴幼儿；以发热和手、足、口腔、臀部等部位的皮　疹或疱疹为主要特征，少数严重患者可并发呼吸道　感染、肺水肿、心肌炎、无菌陛脑膜炎、脑干炎和脊髓　灰质炎样麻痹等相关疾病，病情进展快，重症患者可　致死亡ｌ】引。２００８年我国正式将ＨＦＭＤ纳入了丙类　法定传染病的管理，尽管ＨＦＭＤ得到了国家的高度　重视，但疫情并未得到控制，截至今年９月，全国发　病人数达２３９余万人，死亡４６４人，均居丙类传染病　之首　。　柯萨奇病毒Ａ组１６型（ｃｏｘｓａｃｋｉｅｖｉｒｕｓ　Ａ１６，ＣＡ１６）　是引起手足口病的主要病原体之一，１９５１年在南非　首次被分离出来　５］，与ＥＶ７１共同或者交替流行。　ＣＡ１６属于小ＲＮＡ病毒科肠道病毒属，其基因组为　单股正链ＲＮＡ，相对分子质量约７　４００，编码病毒结　构与非　构蛋白，结构蛋白包括ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３和　ＶＰ４，其中结构蛋白ＶＰ１是病毒的主要中和抗原决　定簇所在部位，也是ＣＶ血清分型依据，其核苷酸序　列也是ＣＶ基因分型的依据。　目前针对ＣＡ１６病毒的研究被广泛地开展起　来，但尚处于实验室阶段。本实验室前期从ＨＦＭＤ　临床疑似患者咽试子样品中分离出ｌ０余株ＣＡ１６　分离毒株，经细胞适应传代筛选，在初步筛选的基　础上进行２轮蚀斑克隆纯化优选２个克隆株，根据　Ｚｈａｎｇ等＿６］对ＣＡ１６的分型标准，可将ＣＡ１６分为　Ａ、Ｂ两种基因型。还有学者根据ＶＰ１片段的差异将　ＣＡ１６分为Ａ、Ｂ、Ｃ　３个基因型，本实验选择的两个　毒株基因型均为Ｂｌｂ型，根据前期实验结果［　，对　选出的两个毒株进行进一步的减毒试验，并评价了　减毒后其生长特性、免疫原性、乳鼠致病性、遗传稳　定性等生物特征的改变，为ＣＡ１６减毒活疫苗的制备　奠定了基础。　１材料与方法　１．１毒株ＣＡ１６病割　ＫＭ１６８，滴度７．３７　ＬｇＣＣＩＤ５加ｌ；　ＫＭ１５４，滴度７．７８　ＬｇＣＣＩＤ５０／ｍ１）由本所病原生物　学检测技术研究组从昆明地区ＨＦＭＤ临床疑似患　者样品中分离并保存；ＣＡ１６标准株Ｇ２０由本所病　毒免疫室提供。　１．２细胞Ｖｅｒｏ细胞（第１４８代）购自ＷＨＯ，由本　所质量检定室提供；人二倍体ＫＭＢ。　细胞株（第３０　代）由本所建株及保存。　１．３实验动物清洁级ＩＣＲ　１　１３龄乳鼠及４周龄　成鼠（体重１８　２２　ｇ）由本所灵长类中心小动物实　验部提供，动物合格证号：ＳＹＸＫ（滇）２０１０００７。　１．４主要试剂　核酸提取试剂盒购自爱思进生物　技术（杭州）有限公司；ＴａＫａＲａ　ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐ　Ｏｎｅ　Ｓｔｅｐ　ＲＴ—ＰＣＲ　Ｋｉｔ购自宝生物工程（大连）有限公司。　１．５病毒的传代培养取生长状态良好的Ｖｅｒｏ细　胞／ＫＭＢ。　细胞，按１：３的比例进行传代，３７℃　培养至细胞长成单层，接种２０—３０　１病毒液，置　３５℃／３３℃培养箱中吸附１．５　ｈ；补加含２０％牛血　清的ＭＥＭ细胞维持液，３５℃／３３℃培养至细胞病　变达７５％以上时，收获病毒液，置一３０　ｑＣ冻存。病毒　在Ｖｅｒｏ细胞中盲传３代后，用第３代在Ｖｅｒｏ细胞　中扩增１个代次收获ＶＰ４，将ＶＰ４在ＫＭＢ　细胞上　３５　ｑｃ传代，收获ＫＰ１，将ＫＰ１于同样条件下传代，收　获ＫＰ２，将ＫＰ２在ＫＭＢ．，细胞上３３℃连续传代，收　获ＫＰ３　ＫＰ１７。　１．６毒株感染性滴度的检测　采用微量细胞病变　法。将长成致密单层的ＫＭＢ，　细胞制成细胞悬液，　调整细胞浓度至１．０×１０　个／ｍ１，加至９６孔板中，　１００　ｌ／孔；将待测毒株进行１０倍系列稀释后，选择　１０　～１０　稀释度加至含有细胞悬液的９６孑Ｌ板中，　１００　Ｉｘｌ／孔，每个稀释度８孔，３７℃或３３℃，５％ＣＯ２　温箱中静置培养，每日观察细胞生长情况，第７天计　数病毒数，采用Ｋａｒｂｅｒ公式计算病毒的感染性滴度　（ＬｇＣＣＩＤ５０／ｍ１）。　１．７减毒株免疫原性的评价　１．７．１小鼠免疫取ＩＣＲ成鼠，按毒株数量随机进　行分组，每组１０只，每个毒株每个代次分别为１组，　经腹腔注射ＫＭ１５４株（ＫＰ１１和ＫＰ１２）及ＫＭ１６８株　（ＫＰ１１和ＫＰ１２）病毒收获液，０．５　ｍｌ／只，设注射等　量ＰＢＳ的空白对照组，于初免后第２８天经小鼠尾　静脉采血后，采用相同剂量、相同部位进行加强免疫　１次，于加强免疫后第７天摘除眼球采血，并取　脑、脊髓、肠、心脏、肺、脾脏、肾脏、肝脏、四肢肌肉　等组织，加入细胞维持液碾磨，离心取上清，进行　ＶＰ１片段核酸的定性检测，分离血清，检测中和抗　体效价。　中国生物制品学杂志２０１５年５月第２８卷第５期Ｃｈｉｎ　Ｊ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ　Ｍａｙ　２０１５．Ｖｏ１．２８　Ｎｏ．５　・４４３・　１．７．２中和抗体效价的检测采用体外微量细胞　病变中和法。将血清于５６℃灭活３０　ｍｉｎ后，用稀释　液进行２倍系列稀释，加至９６孑Ｌ板中，１００　ｌ／孔；　将ＣＡ１６标准株Ｇ２０（ＫＰ１５）稀释至２　０００　ＣＣＩＤ５０／ｍｌ，　加至９６孔板中，５Ｏ　ｌ／孔，３７℃中和９０　ｍｉｎ；取　ＫＰ３０生长状态良好的致密单层ＫＭＢ　，细胞，按１：３　的比例传代，３７℃培养至细胞长成单层，制备细胞　悬液（细胞浓度约１　Ｘ　１０　个／ｍ１），１００　Ｉｚｌ／孔，３７　ｏＣ，　５％ＣＯ　孵箱静置培养。每１３观察并记录细胞病变　情况，于第７天判定结果。以中和抗体效价≥１：４　判为阳性。　１．８减毒株致病性的检测取ＩＣＲ乳鼠，每窝为１　组（约８—１３只），每个毒株２组，Ａ组用于临床症状　观察，Ｂ组用于病理学检测。取３３℃低温传代后的　ＫＰ７、ＫＰ１２、ＫＰ１７病毒收获液，分别经颅内注射乳鼠，　设注射等剂量ＰＢＳ的对照组。每日观察并记录Ａ　组乳鼠发病及死亡情况，连续观察３０　ｄ；同时Ｂ组　于第４、ｌ５、２２、３０天，解剖乳鼠，取脑、脊髓、肠、心　脏、肺、脾脏、肾脏、肝脏、四肢肌肉等组织，加入细胞　维持液碾磨，离心取上清，进行核酸的定性检测，同　时将组织固定、切片、ＨＥ染色，观察病理学改变。试　验重复３次。　１．９病毒ＶＰ１核酸定性检测及测序参考文献［７］　方法进行。用核酸提取试剂盒提取病毒核酸，扩增　ＶＰ１片段。选取候选株的原始代次及３３℃传代后　的ＫＰ４、ＫＰ１２、ＫＰ１５，对毒株ＶＰ１进行测序。引物序　歹Ⅱ如下：ＶＰ１Ｆ：５　．ＧＣＡＡＡＣＧＧＣＴＡＡＣＡＴＡＣＡ－３　，ＶＰ１Ｒ：　５　．ＴＧＴＣＣＡＡＡＣ，ｒＩＴＣＣＣＡＡＣ　３　，扩增片段大小为　９３２　ｂｐ。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司　合成。ＰＣＲ产物经ｌ％琼脂糖凝胶电泳鉴定，并送生　工生物工程（上海）股份有限公司测序。利用Ｍｅｇａｌｉｇｎ　软件对ＶＰ１核酸及氨基酸序列进行分析对比。　２结果　２．１毒株３３℃连续传代后的生长特性分析毒株从　感染Ｖｅｒｏ细胞到感染ＫＭＢ。　细胞，感染性滴度降低，　当温度经３５℃变至３３℃后，两个毒株的感染性滴度　逐渐上升，ＫＭ１５４株从ＫＰ３至ＫＰ７感染性滴度均有　小幅度波动，ＫＰ７以后保持在约７．０　ＬｇＣＣＩＤ５０／ｍｌ　的相对稳定状态，ＫＭ１６８株培养温度变至３３℃后，　感染性滴度一直处于相对稳定状态，仅部分代次出现　小波动，见图１，表明两个毒株已经适应了在ＫＭＢ。　细胞上３３℃条件下的传代环境，可正常复制且具有　相对稳定的生长特性。　｛　宜　≥　Ｕ　建　填　蓄　蕾蕾蕾　毒株代次　注：ＶＰ４为病毒盲传３代后在Ｖｅｒｏ细胞中扩增收获的病毒液；　ＫＰ１，ＫＰ２为病毒在ＫＭＢ．　细胞上３５℃条件下传代；ＫＰ３一ＫＰ１７为　病毒在ＫＭＢ．　细胞上３３℃条件下传代。　图１　ＫＭ１５４和ＫＭ１６８株经低温传代后的感染性滴度　Ｆｉｇ　１．Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ　ｔｉｔｅｒｓ　ｏｆ　ＫＭ１５４　ａｎｄ　ＫＭ１６８　ｓｔｒａｉｎｓ　ａｆｔｅｒ　ｓｕｂｃｕｌｔｕｒｅ　ａｔ　ｌｏｗ　ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｓ　２．２毒株３３℃连续传代后的温度特征分析两个　毒株在３３℃连续传代后，在３７℃及３３℃条件下检　测的感染性滴度差异较小，见表１。　卯　表１毒株温度特征分析　Ｔａｂ　１．Ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｔｈｅｒｍａｌ　ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ　ｏｆ　２ＫＭ１５４　ａｎｄ　ＫＭ１６８　￡！　ｓｔｒａｉｎｓ　毒株代次—ＫＭ１５４￣（ＬｇＣＣＩＤｓｏ／　ｍ１）ｎ　￡！，　ＫＭ１６ｎ　８￣（ＬｇＣＣＩＤｓ０／　ｍ１）　——————————————————３３℃　３７℃　差值　３３℃　３７　ｏＣ　差值　＂　”　＂　２．３毒株３３℃连续传代后免疫原性分析免疫后　成鼠血清中ＧＭＴ值均较低，但基本均能检测到有效　的抗体水平，加强免疫后第７天，除ＫＭ１６８株的ＫＰ１１＂　　外，阳转率均达到１００％，见表２，表明两个毒株经　３３　ｃＩ＝低温传代后，０．５　ｍｌ／只的低免疫剂量仍能刺　激机体产生有效的免疫应答。　２．４成鼠组织的核酸检测结果在检测的９种组　织中，除肠组织外，其余组织中均能检测到ＣＡ１６病　毒，见图２，表明ＣＡ１６虽然不导致成鼠产生临床症　状，但在成鼠体内能正常传播繁殖。　２．５毒株３３℃连续传代后的致病性分析　２．５．１乳鼠发病情况及体重变化对照组乳鼠正　常生长，无死亡及其发病情况；ＫＭ１５４株ＫＰ７感染　的乳鼠致死率为２０％（２／１０），ＫＰ１２及ＫＰ１７感染的　乳鼠均无发病及死亡情况，ＫＭ１６８株ＫＰ７发病率为　６６．７％（８／１２），ＫＰ１７发病率为６２．５％（５／８），见表３。　发病典型的乳鼠出现前肢或后肢麻痹、消瘦、运动消　中国生物制品学杂志２０１５年５月第２８卷第５期Ｃｈｉｎ　Ｊ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ　Ｍａｙ　２０１５．Ｖｏ１．２８　Ｎ０．５　・４４７・　敏感性要强于ＫＭＢ１７细胞；其次，受环境温度变化　的影响，病毒对细胞的敏感性降低，至ＫＰ２时，病毒　功能的改变，例如宿主蛋白的上调，致使病毒的复制　受限＿１　。本实验结果也证实了乳鼠作为ＣＡ１６减毒　已稍有适应，感染性滴度略微上升。　减毒候选株应保证良好的免疫原性。本实验结　果显示，在无佐剂及低剂量的情况下将两个毒株免　疫ＩＣＲ成鼠，两个毒株均能刺激成鼠体内产生一定　水平的ＣＡ１６特异性中和抗体，但是整体的ＧＭＴ值　株残余毒力评价的动物模型的可行性。　本实验室在前期的研究中利用３７℃条件下，用　Ｖｅｒｏ细胞中常规传代的ＫＭ１５４、ＫＭ１６８原始代次　（第７代次以前）感染乳鼠，乳鼠致死率均达到约７０％，　且能导致乳鼠大脑、肌肉、脊髓等组织的严重损伤。　将病毒转至３３℃传至ＫＰ４时，ＫＭ１５４株致乳鼠的　较低，可能由于免疫的活病毒量不高，加强免疫后　阳转率达１００％，表明减毒后ＫＭ１５４及ＫＭ１６８株均　能刺激小鼠体内有效的免疫应答，具有较好的免疫　死亡率已明显下降至约２０％，但发病小鼠还存在前　后肢同时麻痹的情况，且均死亡［　。表明随着代次　原性。　为了探讨减毒株在３３℃低温连续传代后，温度　条件改变时其生长特性的变化，我们还对减毒株在　３３及３７℃条件下的感染性滴度进行了对比，结果发　现，两种实验条件下毒株的感染性滴度接近，并未体　现出类似Ｐｏｌｉｏ病毒Ｓａｂｉｎ减毒株的温度特征。　新生乳鼠可作为ＣＡ１６致病性评价的动物模　型，有研究者给新生乳鼠颅内注射ＣＡ１６病毒（ｃ亚　型），小鼠出现后肢麻痹、消瘦等症状，病理切片显　示了肌肉、心肌的损伤Ｅ　。在此之前，１９５５年Ｓｉｃｋｌｅｓ　等Ｅ　］研究发现，ＣＡ１６对新生乳鼠具有强烈的致病　性，但感染的原因并不清楚，１９９３年Ｈｙｙｐｉ￣等［９　利　用ＣＡ１６　５个亚型（Ａ２、Ａ９、Ａ２１、Ｂ３和Ｂ４）感染乳　鼠，并检测组织中病毒核酸，结果显示，ＣＡ１６能感染　骨骼和心肌组织，其中Ｂ型能感染更多的组织，还　有学者研究发现，间隔２周注射灭活ＣＡ１６疫苗的　母鼠能保护其乳鼠受致死性的感染［ｍ］，之后关于新　生乳鼠作为ＣＡ１６疫苗评估的动物模型还有很多报　道。本实验利用两株Ｂｌｂ　Ｅ　］亚型的ＣＡ１６减毒株感　染１日龄乳鼠，以评价减毒株的毒力情况，结果显　示，３３℃传至ＫＰ７时，两个毒株对乳鼠均有不同程　度的致病及致死率，传至ＫＰ１２时，部分毒株发病率　及死亡率降低或消失；此￣＇ｌ－ｇＬ鼠组织病理检测结果　未见典型的损伤，且至第３０天，大部分组织的病理　改变消失；高代次感染的乳鼠病理改变的组织数量　和病变程度会下降；对乳鼠组织的核酸检测结果显　示，乳鼠脑、脾脏、肾脏、肺、肝脏、心脏、四肢肌肉、脊　髓组织均是ＣＡ１６病毒的复制场所，并在感染乳鼠　后第４天达到１个复制高峰，随着机体对病毒的抵　御，至第１２～１５天，病毒含量逐渐减小，甚至检测　不到病毒，随后病毒适应机体环境，恢复正常的生长　繁殖，在ＥＶ７１的ＩＣＲ乳鼠模型研究中也发现了类　似的情况＿１。。。病毒的这种复制特性也可能受其自　身及宿主的影响，研究表明，ＣＡ１６感染后存在自限　性，这种自限性导致其在感染宿主细胞后一些细胞　的升高，毒株导致小鼠的发病率及死亡率会有所降　低，特别是ＫＭ１５４株；小鼠的发病时间逐渐延长，从　ＫＰ４的第６天以后到ＫＰ７的第９天以后再到ＫＰ１２　的第１０天以后，或不发病；ＫＰ４感染发病的乳鼠全　部死亡，而ＫＰ７感染后，较多发病乳鼠最终均正常　存活；从低代次到高代次，组织病变数逐渐减少，病　变程度逐渐减低。提示３３℃低温传代后，随着代次　的升高，毒株导致乳鼠的致病性已显著减弱，直至不　导致乳鼠发病及死亡。　我们对感染了ＫＭ１５４（ＫＰ１２）及ＫＭ１６８（ＫＰ１２）　的成鼠组织进行了核酸检测，发现除肠道外的其余　组织中均能检测到ＣＡ１６病毒核酸。在本实验中，无　论是乳鼠还是成鼠，在肠道组织中均检测不到ＣＡ１６　病毒，可能采用碾磨的方法未能将肠道组织中的病　毒完全释放，而在本实验室的前期研究中，采用剪切　的方法，可在感染了ＣＡ１６病毒的乳鼠肠道组织中　检测到ＣＡ１６病毒，并发现肠道是ＣＡ１６病毒复制的　一个主要场所＿７］。表明ＣＡ１６病毒在小鼠体内确实　可进行传播并广泛感染各种组织，该结果提示，小鼠　也许可作为ＣＡ１６减毒活疫苗免疫原性评价的动物　模型，但本实验中，其刺激小鼠体内产生的有效抗体　水平不高，仅达到约１：３０，因此，小鼠是否是最好　的动物模型尚需进一步研究。　毒力的恢复是减毒株必须考虑的危险因素之　一，若病毒在低温传代过程中保持遗传的稳定性，则　减少了毒力恢复的一个重要因素，其次ＶＰ１片段为　ＣＡ１６病毒中和抗原决定簇所在部位，对机体的免疫　影响最大，疫苗研究必须考虑其在传代过程中的稳　定性。因此，本实验选取了ＣＡ１６毒株的ＶＰ１片段　进行测序，结果表明，两个毒株在３３　ｃ《＝的传代过程　中保持了ＶＰ１片段的遗传稳定性；与原始代次的比　对中，两个毒株均有氨基酸变异位点发生。病毒在　适应环境的过程中会通过自身的变异来更好地与宿　主达到一种“平衡”，逃避宿主对其识别及消灭，两个　毒株氨基酸的变异或许是其适应过程的一种机制，　・４４８・　中国生物制品学杂志２ｏ１５年５月第２８卷第５期Ｃｈｉｎ　Ｊ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ　Ｍａｙ　２０１５，Ｖｏ１．２８　Ｎｏ．５　也或许是其毒性减弱的关键因素，具体原因尚需进　一步的实验及分析。本实验初步评价了两个毒株在　３３℃传代过程中的遗传稳定性。　ＨＦＭＤ已成为一种全球性广泛流行的传染病，　ＣＡ１６是引起手足口病的主要病原体之一，以往认为　其导致的ＨＦＭＤ症状较轻微，而把研究重点放在了　致病致死率更强的ＥＶ７１上。ＥＶ７１新生乳鼠模型的　研究显示，ＥＶ７１具有嗜神经特性，其可能通过神经　组织进入大脑，从而引起神经系统并发症［１３］，而目　前许多研究表明，ＣＡ１６在我国各地出现了不同程度　的流行Ｉ１　，多个国家和地区的研究也表明，ＣＡ１６的　感染也可导致重症及死亡病例　，但其具体的发病　机制尚不清楚，相关研究仍处于细胞或动物研究阶　段，目前还没有针对其引起的ＨＦＭＤ的特效治疗方　案，主要还是依据症状采取相应的治疗方法，同时预　防并发症的发生［】　。疫苗是控制ＨＦＭＤ的关键，而　相关疫苗的研究报道并不多。目前有文献报道了关　于ＣＡ１６重组样病毒颗粒（ＶＬＰｓ）疫苗［１　，还有关于　ＣＡ１６全病毒灭活疫苗的报道［”］。本实验将ＣＡ１６高　免疫原性的毒株经连续低温传代减毒后，进行了减　毒特性的评价，结果发现，３３　ｃＩ＝连续低温传代后，病　毒能保持稳定的生长特性和良好的免疫原性，且　ＫＭ１５４株ＫＰ１２感染的乳鼠未出现发病及死亡情况，　同时在能检测到ＣＡ１６核酸的组织中未显示明显的　病理改变，部分发生病变的组织会随着小鼠的成长　或毒株代次的升高而消失，因此，ＫＭ１５４株可作为　减毒疫苗的候选株，继续进行减毒，为ＣＡ１６减毒活　疫苗的研发奠定了基础。　参考文献　国家卫生计生委疾病预防控制局．卫生部关于将手足口病纳　入法定传染病管理的通知［ＥＢ／ＯＬ］．（２００８．０５．０６）［２０１４．１０．　２８］．ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｏｈ．ｇｏｖ．ｃｎ／ｊｋｊ／ｓ３５７７／２００８０５／ｌａ８ｂｂ３６６８　ｂ７ｄ４５４０ａｆｂ０５３　１ｄｆｃｅｆ９７８ｄ．ｓｈｔｍ１．　［２］　卫生部．手足口病预防控制指南（２００９版）［Ｊ］．全科医学临　床与教育，２０１０，８（２）：１２５．１２７。１３３．　［３］　王小燕，邓慧玲，符佳．手足口病２１０３例临床表现及流行病　学分析［Ｊ］＿陕西医学杂志，２０１０，３９（１）：５６．５８．　［４］　中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会．２０１４年２月全　国法定传染病疫情概况［ＥＢ／ＯＬ］．（２０１４－０３－０８）［２０１４－１０－２８］．　ｈｔｔｐ：／／ＷＷＷ．ｃｈｉｎａｃｄｃ．ａｎ／ｔｊｓｊ／ｆｄｃｒｂｂｇ／２０１４０３／ｔ２０１４０３１０＿　９３９９７．ｈｔｍ．　［５］　Ｓｉｃｋｌｅｓ　ＧＭ，Ｍｕｔｔｅｒｅｒ　Ｍ，Ｆｅｏｒｉｎｏ　Ｐ，ｅｔ　ｏ１．Ｒｅｃｅｎｔｌｙ　ｃｌａｓｓｉｆｉｅｄ　ｔｙｐｅｓ　ｏｆ　Ｃｏｘｓａｃｋｉｅ　ｖｉｒｕｓ，ｇｒｏｕｐ　Ａ；ｂｅｈａｖｉｏｒ　ｉｎ　ｔｉｓｓｕｅ　ｃｕｈｕｒｅ　［Ｊ］．Ｐｒｏｃ　Ｓｏｃ　Ｅｘｐ　Ｂｉｏｌ　Ｍｅｄ，１９５５，９０（２）：５２９－５３１．　［６］　Ｚｈａｎｇ　Ｙ，Ｗａｎｇ　ＤＹ，Ｙａｎ　ＤＮ，ｅｔ　ａ１．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｅｖｉｄｅｎｃｅ　ｏｆ　ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｔ　ｅｐｉｄｅｍｉｃ　ａｎｄ　ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ　ｏｆ　ｓｕｂｇｅｎｏｔｙｐｅ　Ｂ１　Ｃｏｘｓａｃ—　ｋｉｅｖｉｒｕｓ　Ａ１６一ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｈａｎｄ，ｆｏｏｔ，ａｎｄ　ｍｏｕｔｈ　ｄｉｓｅａｓｅ　ｉｎ　Ｃｈｉｎａ［Ｊ］．Ｊ　Ｃｌｉｎ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，２０１０，４８（２）：６１９．６２２．　［７］　Ｊｉａｎｇ　ＧＪ，Ｌｉ　Ｈ，Ｙａｎｇ　Ｔ，ｅｔ　ｏ１１．Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ　ｏｆ　ｃｌｉｎｉｃａｌ　ｉｓｏｌａｔｅｓ　ｏｆ　ｃｏｘｓａｅｋｉｅｖｉｒｕｓ　ｇｒｏｕｐ　Ａ　ｔｙｐｅ　１６［Ｊ］．Ｃｈｉｎ　Ｊ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ，２０１４，２７（５）：６０７—６１１，６１６．（ｉｎ　Ｃｈｉｎｅｓｅ）　姜广菊，李华，杨婷，等．柯萨奇病毒Ａ组１６型临床分离株　的生物学特性分析［Ｊ］．中国生物制品学杂志，２０１４，２７　（５）：６０７．６１１，６１６．　［８］　Ｍａｏ　ＱＹ，Ｗａｎｇ　Ｙ，Ｇａｏ　Ｒ，ｅｔ　ｏ１．Ａ　ｎｅｏｎａｔａｌ　ｍｏｕｓｅ　ｍｏｄｅｌ　ｏｆ　ｃｏｘｓａｅｋｉｅｖｉｒｕｓ　Ａ１６　ｆｏｒ　ｖａｃｃｉｎｅ　ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ　ｌＪ　Ｊ．Ｊ　Ｖｉｒｏｌ，２０１２，　８６（２２）：１１９６７．１１９７６．　［９］　Ｈｙｙｐｉａ　Ｔ，Ｋａｌｌａｊｏｋｉ　Ｍ，Ｍａａｒｏｎｅｎ　Ｍ，ｅｔ　．Ｐａｔｈｏｇｅｎｅｔｉｃ　ｄｉｆｆｅ－　ｒｅｎｃｅｓ　ｂｅｔｗｅｅｎ　ｃｏｘｓａｃｋｉｅ　Ａ　ａｎｄ　Ｂ　ｖｉｒｕｓ　ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ　ｉｎ　ｎｅｗｂｏｒｎ　ｍｉｃｅ［Ｊ　３．Ｖｉｕｒｓ　Ｒｅｓ，１９９３，２７（１）：７１．７８．　［１０］　Ｌｉ　ＪＬ，Ｃｈａｎｇ　ＪＬ，Ｌｉｎ　Ｘ，ｅｔ　．Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ　ｆｒｏｍ　ｌｅｔｈａｌ　ｃｈａｌｌｅｎｇｅ　ｉｎ　ａ　ｎｅｏｎａｔａｌ　ｍｏｕｓｅ　ｍｏｄｅｌ　ｂｙ　ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ｆｒｏｍ　ｃｏｘｓａｃｋｉｅｖｉｒｕｓ　Ａ１６　ｖａｃｃｉｎｅ　ｃａｎｄｉｄａｔｅｓ　ｌＪｊ．Ｊ　Ｇｅｎ　Ｖｉｒｏｌ，２０１４，　９５（Ｐｔ　５）：１０８３—１０９３．　［１１］　Ｄｕｏ　ＪＹ．Ｅｓｔａｂｌｉｓｈ　ｏｆ　ａｎ　ＥＶ７　１　ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ　ＩＣＲ　ｍｏｕｓｅ　ｍｏｄｅｌ　ａｎｄ　ｉｔｓ　ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ　ｉｎ　ｖａｃｃｉｎｅ　ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ［Ｄ］．Ｂｅｉｊｉｎｇ：Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ＆Ｐｅｋｉｎｇ　Ｕｎｉｏｎ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｃｏｌｌｅｇｅ，２０１０．（ｉｎ　Ｃｈｉｎｅｓｅ）　朵建英．肠道病毒７１型（ＥＶ７１）小鼠模型的建立及在疫苗评　价中的应用［Ｄ］．北京：中国医学科学院北京协和医学院，　２０１Ｏ．　［１２］　张晨宇，李树锦，程邦宁．手足口病病原体ＥＶ７１和ＣｏｘＡ１６　的研究进展［Ｊ］．安徽预防医学杂志，２０１３，１９（４）：２７９—２８２．　［１３］　Ｏｎｇ　ＫＣ，Ｄｅｖｉ　Ｓ，Ｃａｒｄｏｓａ　ＭＪ，ｅｔ　ｏ１．Ｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ—ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ　ｗｈｏｌｅ—ｖｉｒｕｓ　ｖａｃｃｉｎｅ　ｐｒｏｔｅｃｔｓ　ａ　ｍｕｒｉｎｅ　ｍｏｄｅｌ　ｏｆ　ｅｎｔｅｒｏｖｉｒｕｓ　７　１　ｅｎｃｅｐｈａｌｏｍｙｅｌｉｔｉｓ　ａｇａｉｎｓｔ　ｄｉｓｅａｓｅ［Ｊ］．Ｊ　Ｖｉｒｏｌ，２０１０，８４（１）：　６６１．６６５．　［１４］　Ｚｈａｎｇ　Ｊ，Ｓｕｎ　ＪＬ，Ｃｈａｎｇ　ＺＲ，ｅｔ　ｏ２．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｈａｎｄ。　ｆｏｏｔ，ａｎｄ　ｍｏｕｔｈ　ｄｉｓｅａｓｅ　ｉｎ　Ｃｈｉｎａ　ｂｅｔｗｅｅｎ　２００８　ａｎｄ　２００９［Ｊ］．　Ｂｉｏｍｅｄ　Ｅｎｖｉｒｏｎ　Ｓｃｉ．２０１１，２４（３）：２１４　２２１．　［１５］　朱志红，唐基忠．儿童手足口病的临床治疗方法分析［Ｊ］．实　用心脑肺血管病杂志，２０１４，２２（６）：１１７．１１８．　［１６］　Ｌｉｕ　Ｑ，Ｙａｎ　Ｋ，Ｆｅｎｇ　Ｙ，ｅｔ　ｏ１．Ａ　ｖｉｒｕｓ・ｌｉｋｅ　ｐａｒｔｉｃｌｅ　ｖａｃｃｉｎｅ　ｆｏｒ　ｃｏｘｓａｃｋｉｅｖｉｒｕｓ　Ａ１６　ｐｏｔｅｎｔｌｙ　ｅｌｉｃｉｔｓ　ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ　ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　ｔｈａｔ　ｐｒｏｔｅｃｔ　ｍｉｃｅ　ａｇａｉｎｓｔ　ｌｅｔｈａｌ　ｃｈａｌｌｅｎｇｅ［Ｊ］．Ｖａｃｃｉｎｅ，２０１２，３０　（４７）：６６４２．６６４８．　［１７］　Ｃａｉ　Ｙ，Ｌｉｕ　Ｑ，Ｈｕａｎｇ　Ｘ，ｅｔ　ａ１．Ａｃｔｉｖｅ　ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ　ｗｉｔｈ　ａ　Ｃｏｘｓａｃｋｉｅｖｉｕｒｓ　Ａ１６　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ　ｖａｃｃｉｎｅ　ｉｎｄｕｃｅｓ　ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ　ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　ａｎｄ　ｐｒｏｔｅｃｔｓ　ｍｉｃｅ　ａｇａｉｎｓｔ　ｌｅｔｈａｌ　ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ　［Ｊ］．Ｖａｃｃｉｎｅ，２０１３，３１（１８）：２２１５．２２２１．　收稿日期：２０１４．１１－２８　编辑：王佳风