下调HIPK2基因表达促进顺铂诱导的肾小管上皮细胞HKC凋亡

２０１７年７月　基础医学与临床　Ｊｕｌｙ　２０１７　第３７卷第７期　Ｂａｓｉｃ＆Ｃｌｉｎｉｃａｌ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ　Ｖｏ１．３７　Ｎｏ．７　文章编号：１００１—６３２５（２０１７）０７—１０３１．０６　ｘｒ３１＇究论文　下调ＨＩＰＫ２基因表达促进顺铂诱导的肾小管上皮细胞ＨＫＣ凋亡　李佳壶，吴洁，邱玲　（中国医学科学院北京协和医学院北京协和医院检验科，北京１００７３０）　摘要：目的探讨ＨＩＰＫ２对顺铂诱导的人肾小管上皮细胞（ＨＫＣ）凋亡的影响。方法构建顺铂诱导的ＨＫＣ细胞凋　亡模型，实时荧光定量ＰＣＲ和Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ检测ＨＩＰＫ２的表达；设计合成２条ＨＩＰＫ２　ｓｉＲＮＡ干扰片段，通过脂质体　转染ＨＫＣ细胞，建立ＨＩＰＫ２干扰的细胞株；实时荧光定量ＰＣＲ和Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ分别检测ＨＩＰＫ２　ｍＲＮＡ和蛋白的表　达；再用顺铂处理细胞，ＡｎｎｅｘｉｎＶ／ＰＩ检测细胞凋亡；Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ检测Ｂａｘ表达的影响。结果顺铂呈剂量依赖性诱　导的ＨＫＣ细胞凋亡过程中，ＨＩＰＫ２　ｍＲＮＡ和蛋白表达水平均明显下调（Ｐ＜０．０５）；转染ｓｉＲＮＡ后可显著降低ＨＩＰＫ２　在ＨＫＣ细胞内ｍＲＮＡ和蛋白的表达（Ｐ＜０．０５），且ＨＩＰＫ２表达降低后会促进顺铂诱导的ＨＫＣ细胞凋亡。结论　ＨＩＰＫ２可抑制顺铂诱导的ＨＫＣ细胞凋亡。　关键词：ＨＩＰＫ２；ＨＫＣ；凋亡；顺铂　中图分类号：Ｒ３４　文献标志码：Ａ　Ｄｏｗｎ—ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ　ＨＩＰＫ２　ｐｒｏｍｏｔｅｓ　ｃｉｓｐｌａｔｉｎ－ｉｎｄｕｃｅｄ　ａｐｏｐｔｏｓｉｓ　ｏｆ　ｈｕｍａｎ　ｋｉｄｎｅｙ　ｔｕｂｕｌａｒ　ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ　ｃｅｌｌｓ　ＬＩ　Ｊｉａ—ｙａｏ。ｗＵ　Ｊｉｅ．ＱＩＵ　Ｌｉｎｇ　（Ｄｅｐｔ．ｏｆ　Ｃｌｉｎｉｃａｌ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｐｅｋｉｎｇ　Ｕｎｉｏｎ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｃｏｌｌｅｇｅ　Ｈｏｓｐｉｔａｌ，ＣＡＭＳ＆ＰＵＭＣ，Ｂｅｉｊｉｎｇ　１００７３０，Ｃｈｉｎａ）　Ａｂｓｔｒａｃｔ：０ｂｊｅｃｔｉｖｅ　Ｔｏ　ｅｘｐｌｏｒｅ　ｔｈｅ　ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ＨＩＰＫ２　ｏｎ　ａｐｏｐｔｏｓｉｓ　ｏｆ　ｈｕｍａｎ　ｋｉｄｎｅｙ　ｔｕｂｕｌａｒ　ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ　ｃｅｌｌｓ（ＨＫＣ）　ｉｎｄｕｃｅｄ　ｂｙ　ｃｉｓｐｌａｔｉｎ．Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ　ｏｆ　ＨＫＣ　ｃｅｌｌｓ　ｗａｓ　ｉｎｄｕｃｅｄ　ｂｙ　ｃｉｓｐｌａｔｉｎ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ＨＩＰＫ２　ｗａｓ　ｄｅｔｅｃｔｅｄ　ｂｙ　ＲＴ－ｑＰＣＲ　ａｎｄ　Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ．Ｔｗｏ　ＨＩＰＫ２　ｓｉＲＮＡｓ　ｗｅｒｅ　ｄｅｓｉｇｎｅｄ　ａｃｃｏｒｄｉｎｇ　ｔｏ　ｇｅｎｅ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｏｆ　ＨＩＰＫ２　ａｎｄ　ｃｅｌｌ　ｌｉｎｅｓ　ｗｉｔｈ　ＨＩＰＫ２　ｋｎｏｃｋｄｏｗｎ　ｗｅｒｅ　ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ　ｔｈｒｏｕｇｈ　ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｎｇ　ｔｈｅ　ＨＩＰＫ２　ｓｉＲＮＡｓ　ｉｎｔｏ　ＨＫＣ　ｃｅｌｌｓ　ｂｙ　ｌｉｐｏ—　ｓｏｍｅ．Ｔｈｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ＨＩＰＫ２　ｍＲＮＡ　ａｎｄ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｗａｓ　ｄｅｔｅｃｔｅｄ　ｂｙ　ＲＴ－ｑＰＣＲ　ａｎｄ　Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ　ａｆｔｅｒ　ｉｎｄｕｃｅｄ　ｂｙ　ｃｉｓ—　ｐｌａｔｉｎ．Ｔｈｅｎ　ｃｅｌｌ　ａｐｏｐｔｏｓｉｓ　ｗａｓ　ｄｅｔｅｃｔｅｄ　ｂｙ　Ａｎｎｅｘｉｎ　ｖ／ＰＩ　ａｆｔｅｒ　ｔｈｅ　ＨＩＰＫ２一ｋｎｏｃｋｄｏｗｎ　ｃｅｌｌｓ　ｗｅｒｅ　ｔｒｅａｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ｃｉｓｐｌａ－　ｔｉｎ．Ｍｏｒｅｏｖｅｒ，ｔｈｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ｐｒｏ—ａｐｏｐｔｏｔｉｃ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｂａｘ　ｗａｓ　ｄｅｔｅｃｔｅｄ　ｂｙ　Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ　ａｆｔｅｒ　ＨＩＰＫ２　ｗａｓ　ｋｎｏｃｋｄｏｗｎ．　Ｒｅｓｕｌｔｓ　Ｔｈｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ＨＩＰＫ２　ｍＲＮＡ　ａｎｄ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｗａｓ　ｄｏｗｎ—ｒｅｇｕｌａｔｅｄ　ｏｂｖｉｏｕｓｌｙ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｐｒｏｃｅｓｓ　ｏｆ　ＨＫＣ　ａｐｏｐｔｏｓｉｓ　ｗｈｉｃｈ　ｉｎｄｕｃｅｄ　ｂｙ　ｄｏｓｅ．ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　ｃｉｓｐｌａｔｉｎ（Ｐ＜０．０５）．Ｔｈｅ　ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｓｉＲＮＡ　ｃｏｕｌｄ　ｓｉｇｎｉｉｆｃａｎｔｌｙ　ｒｅｄｕｃｅ　ｔｈｅ　ｅｘ—　ｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ＨＩＰＫ２　ｍＲＮＡ　ａｎｄ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｉｎ　ＨＫＣ（Ｐ＜０．０５），ｗｈｉｃｈ　ｐｒｏｍｏｔｅｓ　ｔｈｅ　ＨＫＣ　ｃｅｌｌｓ　ａｐｏｐｔｏｓｉｓ　ｉｎｄｕｃｅｄ　ｂｙ　ｃｉｓｐｌ—　ａｔｉｎ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎｓ　ＨＩＰＫ２　ｃａｉ１　ｓｕｐｐｒｅｓｓ　ｔｈｅ　ＨＫＣ　ｃｅｌｌｓ　ａｐｏｐｔｏｓｉｓ　ｉｎｄｕｃｅｄ　ｂｙ　ｃｉｓｐｌａｔｉｎ．　Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：ＨＩＰＫ２；ＨＫＣ；ａｐｏｐｔｏｓｉｓ；ｃｉｓｐｌａｔｉｎ　顺铂作为一种化疗药物被广泛应用于治疗多种　集、高排泄和高代谢，因此肾脏是顺铂毒副作用的主　肿瘤，其效果呈剂量依赖性，并在肾脏中呈现高聚　要靶器官。顺铂导致的肾损伤主要由于顺铂诱导肾　收稿日期：２０１７．０３．２２　修回日期：２０１７—０４—２４　｛　通信作者（ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ　ａｕｔｈｏｒ）：ｌｉｎｇｑｉｕｂｊ＠ａｌｉｙｕｎ．ＣＯＢ　１０３２　基础医学与临床　Ｂａｓｉｃ＆Ｃｈｎｉｃａｌ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ　小管上皮细胞凋亡导致的急性或慢性肾损伤¨　。　ＨＩＰＫ２（同源结构域相互作用蛋白激酶２，ｈｏｍｅｏｄｏｍａｉｎ—　ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｋｉｎａｓｅ　２）是一种丝／苏氨酸蛋白激　酶，可通过磷酸化传录因子参与基因转录调控，在细　６孔细胞培养板中，过夜培养后用Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ　２０００脂质体介导将ｓｉＲＮＡ一１，ｓｉＲＮＡ一２及无关阴性　对照ＮＣ分别转染至ＨＫＣ细胞中，详细步骤见试剂　说明书。转染细胞于３７　ｃＣ、５％ＣＯ　孵育箱中培　养，２４　ｈ后收集细胞，检测ＨＩＰＫ２　ｍＲＮＡ和蛋白表　达，或者转染２４　ｈ后向每组分别加入终浓度０、２和　１０　ｐ￣ｍｏｌ／Ｌ顺铂。　胞分裂增殖与凋亡等信号转导途径中均发挥重要作　用　］。近期有研究报道ＨＩＰＫ２是肾脏纤维化的关　键调节因子　Ｊ，然而ＨＩＰＫ２是否在肾损伤中起作用　仍不清楚，且目前ＨＩＰＫ２对顺铂诱导肾小管上皮细　１．２．３　ＲＴ—ｑＰＣＲ检测ＨＩＰＫ２及ＢＡＸ的表达水平：　胞凋亡的影响尚未有文献报道。前期研究通过基因　表达谱芯片分析发现，顺铂处理ＨＫＣ细胞会引起　ＨＩＰＫ２基因表达下调，说明ＨＩＰＫ２可能在顺铂诱导的　ＨＫＣ细胞凋亡过程中发挥作用。本研究通过在ＨＫＣ　细胞中利用ｓｉＲＮＡ沉默ＨＩＰＫ２基因表达，来探讨　ＨＩＰＫ２在顺铂诱导的ＨＫＣ细胞凋亡过程中的影响。　１材料与方法　１．１材料　１．１．１试剂：Ｈｙｃｌｏｎｅ　ＰＢＳ、ＤＭＥＭ—Ｆ１２和胰蛋白酶　（Ｔｈｅｒｍｏ公司）；Ｔｒｉｚｏｌ　Ｒｅａｇｅｎｔ、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ　２０００　Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ　ｈｆｅ公司）；ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ　ＲＴ　Ｒｅａｇｅｎｔ　Ｋｉｔ（ＴａＫａＲａ公司）；ＨＩＰＫ２抗体、ＧＡＰＤＨ　抗体（Ａｂｃａｍ公司）；ＢＡＸ抗体（Ｓａｎｔａ　Ｃｒｕｚ公司）；　Ａｎｎｉｘｉｎ　Ｖ．ＦＩＴＣ／ＰＩ试剂（万类生物公司）；胎牛血清　（Ｇｉｂｃｏ公司）；顺铂（Ｈｏｓｐｉｒａ　Ａｕｓｔｒａｌｉａ　Ｐｔｙ　Ｌｔｄ）。　１．１．２　细胞及细胞培养：人肾小管上皮细胞系　（ＨＫＣ）（北京协和医院肾内科提供），用含１０％胎牛　血清的ＤＭＥＭ—Ｆ１２培养液于含５％ＣＯ，、３７　ｏＣ恒温　孵育箱中培养。　１．１．３针对ＨＩＰＫ２的靶向小干扰ＲＮＡ合成：靶向　ＨＩＰＫ２的特异性干扰片段ｓｉＲＮＡ一１（５　一ＧＣＵＣＡＣＧＧ　ＡＡＧＣＣＡＵＵＡＵＡＴＹ一３　）、ｓｉＲＮＡ一２（５　一ＧＣＧＧＡＣＣＡＣＡ　ｃＡＡｃｃｕＡＡｕＴＴ一３　）、及无关阴性对照ｓｉＲＮＡ　（ｎｅｇａｔｉｖｅ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｓｉＲＮＡ，ＮＣ，５　一ＵＵＣＵＣＣＧＡＡＣＧＵＧ　ＵＣＡＣＧＵＴＴ一３　）（均由吉玛公司合成）。　１．２方法　１．２．１不同浓度顺铂处理ＨＫＣ细胞：取对数增殖　期ＨＫＣ细胞接种至６孔细胞培养板，第２天分别用　０、２和１０　Ｉｘｍｏｌ／Ｌ顺铂处理细胞，２４　ｈ后收集细胞，　分别提取ＲＮＡ和蛋白待检测。　１．２．２　Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ　２０００　Ｒｅａｇｅｎｔ介导的ｓｉＲＮＡ　转染及药物诱导：取对数增殖期的ＨＫＣ细胞接种于　顺铂作用２４　ｈ后，严格按照Ｔｒｉｚｏｌ试剂盒说明书抽　提细胞总ＲＮＡ，定量后反转录成ｃＤＮＡ备用。　ＨＩＰＫ２、ＢＡＸ及内参ＧＡＰＤＨ引物经ＧｅｎｅＢａｎｋ检　索，利用Ｐｒｉｍｅｒ５．０软件设计，由天一辉远公司合　成。ＨＩＰＫ２上下游引物：５　一ＣＣＣＧＴＧＴＡＣＧＡＡＧＧＴ　ＡＴＧＧＣ　３　．５＇－ＡＧＴＴＧＧＡＡＣＴＣＧＧＣＴＣＴＡｑｑｑＴＣ－３　；　ＢＡＸ上下游引物：５　一ｃＴＣＧＡＣＡＧＴＡＡＣＡＴＣＧＡＧＣ　ＴＧ．３　．５　一ＣＡＣＴＣＧＣＡＡＡＡＡＧＡＣＣＴＣＴＣＧ一３　；ＧＡＰＤＨ　上下游引物：５　一ＧＧＴＣＡＣＣＡＧＧＧＣＴＧＣ１］　Ａ一３　，　５　一ＧＡＧＧＧＡＴＣＴＣＧＣＴＣＣＴＧＧＡ．３　。每个实验重复　３次。　１．２．４　Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ检测蛋白表达：提取细胞总蛋　白，ＢＣＡ试剂盒测定蛋白浓度，经聚丙烯酰胺凝胶　电泳后，将胶上的蛋白电转至聚偏氟乙烯（ｐｏｌｙｖｉｎｙｌ—　ｉｄｅｎｅ　ｆｌｕｏｒｉｄｅ，ＰＶＤＦ）膜，５％牛奶封闭１　ｈ，一抗４℃　过夜，二抗室温１　ｈ，放射自显影。采用Ｉｍａｇｅ　Ｊ图像　分析系统进行各条带平均吸光度值（Ａ）分析，以目　的条带的Ａ值与内参ＧＡＰＤＨ条带　值的比值表示　目的蛋白的相对表达量。　１．２．５　Ａｎｎｅｘｉｎ　Ｖ／ＰＩ检测ＨＫＣ细胞凋亡水平：用　０．２５％的胰蛋白酶消化ＨＫＣ细胞，离心收集细胞，　ＰＢＳ洗２次，加入２００　ｔｘＬ结合缓冲液，混匀后加入　２　Ｌ　ＦＩＴＣ—Ａｎｎｅｘｉｎ　Ｖ，混匀，再加入２　ｔｘＬ　ＰＩ，避光反　应１５～３０　ｍｉｎ，流式细胞仪检测。　１．３统计学分析　采用ＳＰＳＳ　１６．０统计软件进行数据分析，计量　资料比较采用ｔ检验或秩和检验结果以均数±标准　差（Ｙ＋ｓ）表示。　２　结果　２．１顺铂处理的ＨＫＣ细胞中ＨＩＰＫ２表达下调　与对照组相比，用不同浓度（２、１０和５０￣ｘｍｏｌ／Ｌ）　的顺铂诱导ＨＫＣ细胞后，ＨＩＰＫ２基因ｍＲＮＡ表达　李仕矗　卜凋ＨＩＰＫ２基冈表达促进顺铂诱导的肾小篱卜皮细胞ＨＫＣ捌　广　１０３３　水平均下调（Ｐ＜０．０５），儿　顺铂浓度　剂量依赖性　（　１）．．此外，随着顺铂浓度的增高，ＨＩＰＫ２蛋闩表　达水平也逐渐Ｆ降（罔２）　！　：　！　：　！　：　ｃｉｓｐｌａｔｈａ　＜０．０　ｌ　ｃｏｎｌｐａｌ’（　（１　ｗｉｔｈ　ｃｏｎｔｒｏ［ｇｌ’ｏｕｐ　图ｌ　不同浓度顺铂对ＨＫＣ细胞ＨＩＰＫ２　ｍＲＮＡ　表达的影响　Ｆｉｇ　ｌ　Ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ｄｉｆｅｒｅｎｔ　ｃｉｓｐｌａｔｉｎ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ　ｏｎ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ＨＩＰＫ２　ｍＲＮＡ　ｉｎ　ＨＫＣ　（ｉ　，ｎ＝３）　ｋｕ　１］Ｏ　ＨＩＰＩ（２　Ａ　【　１Ｂ　＜０．０１（・‘）ｍｐａｒｅｄ　ｗｉｔｈ　０　ｐｍｍｌ／１　ｃｏｎｔ　ｒｏｌ　ｇｒｏｕｐ　图２　Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ检测不同浓度顺铂诱导ＨＫＣ　细胞２４　ｈ后ＨＩＰＫ２蛋白表达水平的影响　Ｆｉｇ　２　Ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｃｉｓｐｌａｔｉｎ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ　ｏｎ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ＨｌＰＫ２　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｉｎ　ＨＫＣ　ｂｙ　Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ（　，ｎ＝３）　２．２　ｓｉＲＮＡ下调ＨＫＣ细胞中Ｉ｜口【ＰＫ２的表达　针对ＨＩＰＫ２没计２条　同ｓｉＲＮＡ，转染ＨＫＣ细　胞２４　ｈ后，　ｊ对照组（ｓｉＲＮＡ　ｎｅｇａＩｉｒｅ　ｃｏｎｔｒｏ１）　ｆ比，　ｓｉＲＮＡ一１和ｓｉＲＮＡ一２组ｔｔｌＰＫ２　ｔｕＲＮＡ和　表达；ｌ｝　均　著降低（，ｊ＜０．０５），｝Ｉ‘ｓｉＲＮＡ一２抑制效果高于　ｓｉＲＮＡ　１（图３，４）、　２　Ｏ　Ｉ．ｓｉＲＮＡ　ｎｅｇａｔｉｖｅ　ｃｏｎｔｒｏｌ　）ｕｐ；２．ｓｉＲＮＡ—ｌ　ｇｒｏｕ１）；　３．ｓｉＲＮＡ一２　ｇｒｏｌｌｔ）：　Ｐ＜０．０ｌ　ＣＯＩｌｌｐａ１’‘　ｔ１　ｗｉｌｈ　ｓｉＲＮＡ　ｎｅｇａｔｉｖｅ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｇｌ’（ＩＬＩｐ　图３　实时荧光定量ＰＣＲ检测ｓｉＲＮＡ对ＨＫＣ　细胞ＨＩＰＫ２　ｍＲＮＡ表达的影响　Ｆｉｇ　３　Ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ＨＩＰＫ２　ｓｉＲＮＡ　ｏｎ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　Ｈ１ＰＫ２　ｍＲＮＡ　ｉｎ　ＨＫＣ　ｂｙ　ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ　ＰＣＲ（　±ｓ，ｎ＝３）　ｋｂ　２　３　１ｌ０　ＩＩＩｌ】Ｋ２　ＧＡＰＤＨ　２　３　１．ｓｉＲＮＡ　ｎｅｇａｌｉｖ￣－ｃｏｎｔｒｏｌ　ｇｌ‘（）ｌｉｐ：２．ｓｉＲＮＡ—Ｉ　ｇｌ’ｏｕｔｌ；　３．ｓｉＲＮＡ一２　ｇｒｏｕｐ：　＜０．０　１（‘（ｍｑ）ａｔ‘ｅｄ　ｗｉｌｈ　ｓｉＲＮＡ　ｇ—　ａｌｉｖｅ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｇｔ‘ｌ１Ｌｌｐ　图４　Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ检测ｓｉＲＮＡ对ＨＫＣ细胞ＨＩＰＫ２　蛋白表达的影响　Ｆｉｇ　４　Ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ＨＩＰＫ２　ｓｉＲＮＡ　ｏｎ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ＨＩＰＫ２　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｉｎ　ＨＫＣ　ｂｙ　Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ　（　。ｎ＝３）　１０３４　基础医学与临床　Ｂａｓｉｃ＆Ｃｌｉｎｉｃａｌ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ　均显著增加（Ｐ＜０．０５）（图５）。Ｚ　　相关蛋白Ｂａｘ表达的影响　【＿．《趸∞　２．３干扰ＨＩＰＫ２对顺铂诱导的ＨＫＣ细胞凋亡的　影响　２．４干扰ＨＩＰＫ２对顺铂诱导的ＨＫＣ细胞中凋亡　未加入顺铂时（０　ｔｘｍｏｌ／Ｌ），阴性对照ＮＣ、　ｓｉＲＮＡ一１、ｓｉＲＮＡ．２各组中早期凋亡细胞所占比例　分别为７．２％、１１．９％和１９．５％，与阴性对照ＮＣ相　比，ｓｉＲＮＡ．１和ｓｉＲＮＡ一２组中细胞凋亡增加（Ｐ＜　０．０５）；当加人２或１０￣ｍｏｌ／Ｌ顺铂时，阴性对照、　ｓｉＲＮＡ．１和ｓｉＲＮＡ一２各组中早期凋亡细胞比例增　加，２￣ｍｏｌ／Ｌ时分别为９．３％、１６．７％和１７．３％，　１０　Ｉｘｍｏｌ／Ｌ时分别为１０．９％、１７．７％和２１．７％。与　将ｓｉＲＮＡ．１和ｓｉＲＮＡ一２两条干扰序列转入　ＨＫＣ细胞后，ＨＩＰＫ２蛋白表达水平降低，同时Ｂａｘ　蛋白表达明显上升；当加入２或１０　ｐ￣ｍｏｌ／Ｌ顺铂时，　ＨＩＰＫ２蛋白表达水平进～步降低，相应的Ｂａｘ蛋白　表达进一步增高（图６）。　３讨论　ＨＩＰＫ２是一种重要的转录辅助调节蛋白　，可　ＮＣ组相比，ｓｉＲＮＡ一１和ｓｉＲＮＡ．２组中细胞凋亡比例　２　ｔｔｌｎｏＩ，Ｌ　Ｑ２－ＵＬ　０．４％　１０　ｔｕｎｏ１／Ｌ　０．２－ＵＲ　６．１％．　Ｑ２一ＵＲ　３．５０／０　－　，。　Ｑ２－ＵＬ　２　７％　Ｑ２一ＵＬ　２．２％　‘　Ｑ２－ＵＲ　．　．　、　：：－－．　ｌ　‘　．ｉ　，：　、　・・　＾．　＋　＋．　Ｑ２‘ＬＲ　７．２％　Ｑ２一ＬＬ　８２．Ｏ％　Ｑ２－ＬＲ　９．３％　Ｑ２。ＬＲ　ｌ０．９％　１Ｏ　１Ｏ０　１Ｏ　ｌＯ　Ｑ２一ＵＬ　１．２％　－　Ｑ２一ＵＲ　６　５％　●－　０Ｑ２－ＵＬ　０　７％　Ｑ２－ＵＲ　ｌ２　２％　Ｑ２－ＵＬ　ｌ　Ｏ％　Ｑ２一ＵＲ　４．８％　．　慧‘’　：　＝＝勰一　’　。，　蒋　！｜＿・　’　　‘ｔ　．蘑’　　・－　●＾　磷’　：　‘　－　Ｑ２・ＬＲ　】】．９％　Ｑ２－ＬＲ　ｌ６．７％　－Ｑ２－ＬＲ　ｌ７．７％　Ｑ２－ＵＬ　ｌ　２％　Ｑ２一ＵＲ　８．Ｏ％　Ｑ２一ＵＬ　０．７％　Ｑ２－ＵＲ　５　ｌ％　Ｑ２・ＵＬ　Ｏ　４％　Ｑ２・ＵＲ　７．５ｏ／０　：一　．　－　’　，　．　。　‘　，，’．　＾　’　．　壤　：　孑．：　：　．　。　。　，．…　簌　唾０　：．　．　・　’　●　●●　‘　●●　．　Ｑ２一ＬＬ　７１．２％　ｇ，２一ＬＲ　１９．５％　Ｑ２－ＬＲ　１７．３％　Ｑ２－ＬＲ　２１．７％　图５流式细胞计量术检测沉默ＨＩＰＫ２对顺铂诱导ＨＫＣ细胞凋亡的影响　Ｆｉｇ　５　Ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ｓｌｉｅｎｃｉｎｇ　ＨＩＰＫ２　ｏｎ　ａｐｏｐｔｏｓｉｓ　ｏｆ　ＨＫＣ　ｃｅｌｌｓ　ｉｎｄｕｃｅｄ　ｂｙ　ｃｉｓｐｌａｔｉｎ　ｂｙ　ｆｌｏｗ　ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ　拿件毒下调ＨＩＰＫ２基Ｌ大Ｊ表达促进顺铂诱导的肾小臀上皮细胞ＨＫＣ捌　１０　ｍｏｌ／Ｉ　ｌ０３５　Ｃ　ｓｉＲＮＡ—Ｊ　ＲＮＡ一２　ＨｌＰＫ２　ＢＡＸ　１．５　１．０　（）．５　０１．ｔｍｏｌ／Ｌ　２　ｔｕｎｏｌ／Ｌ　１　０ｍｎｏｌ／Ｌ　．２￣ｕｎｏｌ／Ｌ　１　０　ｍｎｏｌ／Ｌ　ｃｉｓｐｌａｔｈｌ　ｃｉｓｐｌａｔｉｎ　＜（）．０　Ｊ（’ｏｍｐａｌ　ｗｉｔｌ１　ｎｅｇａｔｉｗ　（’（ｍｔｌ’ｔＩＩ　ｉｎ　ｔｌ　Ｓａｌｌｌ（　ｇｒｏｕｐ　图６干扰ＨＩＰＫ２对顺铂诱导ＨＫＣ细胞中Ｂａｘ蛋白表达的影响　Ｆｉｇ　６　Ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ＨＩＰＫ２　ｓｉＲＮＡ　ｏｎ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　Ｂａｘ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｉｎｄｕｃｅｄ　ｂｙ　ｃｉｓｐｌａｔｉｎ　ｉｎ　ＨＫＣ（　，，　３）　渊控多种转录因子的转录渊控和转录后修饰　，　从而调控细胞的增殖、分化和凋ｒ＿等过程“一近　年来ＨＩＰＫ２在肾脏中的作Ｊ｛ｊ被发现　关注，主要　１和ｓｉＲＮＡ一２均可有效抑制ＨＫＣ细胞ｒ　ＨＩＰＫ２的　表达，使ＨＫＣ细胞凋　增加，且ｆ：扰效率更高的　ｓｉＲＮＡ．２促凋　效应更明　，表明沉默ＨＩＰＫ２能促　进顺钔引起的ＨＫＣ细胞凋亡　本结果相一致的　集中在肾脏纤维化　ＨＩＰＫ２可通过捌　ｐ５３、　Ｓｍａｄ３、Ｎｏｔｃｈ和Ｗｉｎｇｌｅｓｓ等通路在肾脏巾发挥促　纤维化和促炎性反应的作用　．、最新研究发现，　抑制ＨＩＰＫ２的表达可放缓肾脏纤维化进程，因此　ＨＩＰＫ２可作为治疗肾脏纤维化的靶点　本研究　足，敲除小鼠ｆｔｌＰＫ２基凶会造成小脑功能紊乱导致　行为异常，且小脑浦肯野细胞的凋　增加　，　ＨＩＰＫ２促进肿瘤细胞凋亡，但在ＨＫＣ等正常细胞巾　发挥抑凋亡作Ｊ｛ｊ，可能足ＨＩＰＫ２在不同环境下发挥　首次发现ＨＩＰＫ２在顺铂诱导的ＨＫＣ细胞凋　过　程中起到抑制凋亡作用，为ＨＩＰＫ２可能成为预防　功能的机制　同，而导致作用不同且功能有差异　、　Ｂａｘ是Ｂｃ・ｌ－２家族巾最主要的促凋　蛋闩，Ｂａｘ　药物诱导肾小管坏死的新分子靶点奠定实验　基础　活化可导致线粒体通透性改变，细胞色素ｃ释放，　ｃａｓｐａｓｅ一９前体激活，从而引起凋亡的发生　Ｂａｘ及　其相关凋亡通路在顺铂引发的。肾毒性中起着至关重　要的作用　。本研究发现ＨＫＣ细胞中ＨＩＰＫ２的表　达被抑制后，Ｂａｘ表达水平增加，且在顺铂　导ＨＫＣ　ＨＩＰＫ２在凋　中的作川已有报道但主要集中　在肿瘤方面的研究　ＨＩＰＫ２活化后　磷酸化ｐ５３，　激活其下游信号通路，发挥促进肿瘤细胞凋　的作　“　。下凋ＨＩＰＫ２的表达可减少南紫外线引起　细胞中ＨＩＰＫ２表达水平进一步降低时，Ｂａｘ的表达　也进一步增高，提示ＨＩＰＫ２可能通过调控ｂａｘ来抑　制凋亡　的人乳腺癌ＭＣＦ一７细胞的凋　“　可见ＨＩＰＫ２在　肿瘤细胞巾主要是促凋亡作片ｊ。本研究首先发现在　１１１￣．￥１３诱导的ＨＫＣ细胞凋亡中，ＨＩＰＫ２的ｍＲＮＡ及　综上所述，本研究为肾毒性药物诱导肾小管上　皮细胞凋亡机制的初步研究，ＨＩＰＫ２表达降低可能　是顺铂诱导ＨＫＣ细胞凋亡过程中重要的分子事件　、　蛋白表达水平均显著降低，说明ＨＩＰＫ２可能在此凋　亡过程中起作用；针对ＨＩＰＫ２的２条ｓｉＲＮＡ，ｓｉＲＮＡ一　１０３６　基础医学与临床　Ｂａｓｉｃ＆Ｃｌｉｎｉｃａｌ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ　２０１７．３７（７）　ＨＩＰＫ２可能通过调控Ｂａｘ的表达来抑制顺铂诱导的　讨，本研究为阐明化疗药物顺铂诱发肾脏毒副作用　的发生机制提供了线索。　ＨＫＣ细胞凋亡，但具体的过程和机制还有待深入探　参考文献：　［１］Ｒａｍｅｓｈ　Ｇ，Ｒｅｅｖｅｓ　ＷＢ．Ｓａｌｉｃｙｌａｔｅ　ｒｅｄｕｃｅｓ　ｃｉｓｐｌａｔｉｎ　ｎｅｐｈｒｏ—　ｔｏｘｉｃｉｔｙ　ｂｙ　ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｕｍｏｒ　ｎｅｃｒｏｓｉｓ　ｆａｃｔｏｒ—ａｌｐｈａ［Ｊ］．Ｋｉｄ—　ｎｅｙ　Ｉｎｔ，２００４，６５：４９０—４９９．　ｏｄｏｍａｉｎ　Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｋｉｎａｓｅ　２　Ｍｉｔｉｇａｔｅｓ　Ｋｉｄｎｅｙ　Ｆｉｂｒｏｓｉｓ　ｔｈｒｏｕｇｈ　Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ＴＧＦ—ｂｅｔａ１／Ｓｍａｄ３　Ｐａｔｈｗａｙ［Ｊ］．Ｊ　Ａｍ　Ｓｏｃ　Ｎｅｐｈｒｏｌ，２０１７．ｄｏｉ：１０．１６８１／　ＡＳＮ．２０１６０８０８４１．　［２］Ｚｈａｎｇ　Ｑ，Ｙｏｓｈｉｍａｔｓｕ　Ｙ，Ｈｉｌｄｅｂｒａｎｄ　Ｊ，ｅｔ　ａ１．　Ｈｏｍｅｏｄｏｍａｉｎ　ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｋｉｎａｓｅ　２　ｐｒｏｍｏｔｅｓ　ａｐｏｐｔｏｓｉｓ　ｂｙ　ｄｏｗｎｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ　ｔｈｅ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ　ｃｏｒｅｐｒｅｓｓｏｒ　［９］Ｆｅｎｇ　Ｙ，Ｚｈｏｕ　Ｌ，Ｓｕｎ　Ｘ，ｅｔ　ａ１．Ｈｏｍｅｏｄｏｍａｉｎ—ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｋｉｎａｓｅ　２（ＨＩＰＫ２）：ａ　ｐｒｏｍｉｓｉｎｇ　ｔａｒｇｅｔ　ｆｏｒ　ａｎｔｉ—　ＣｔＢＰ［Ｊ］．Ｃｅｌｌ，２００３，１１５：１７７—１８６．　［３］Ｊｉｎ　Ｙ，Ｒａｔｎａｍ　Ｋ，Ｃｈｕａｎｇ　ＰＹ，ｅｔ　ａ１．Ａ　ｓｙｓｔｅｍｓ　ａｐｐｒｏａｃｈ　ｉ—　ｄｅｎｔｉｆｉｅｓ　ＨＩＰＫ２　ａｓ　ａ　ｋｅｙ　ｒｅｇｕｌａｔｏｒ　ｏｆ　ｋｉｄｎｅｙ　ｉｆｂｒｏｓｉｓ［Ｊ］．Ｎａｔ　Ｍｅｄ，２０１２，１８：５８０—５８８．　ｃａｎｃｅｒ　ｔｈｅｒａｐｉｅｓ［Ｊ］．Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ，２０１７，８：２０４５２—２０４６１．　［１０］Ｃａｌｚａｄｏ　ＭＡ，Ｒｅｎｎｅｒ　Ｆ，Ｒｏｓｃｉｃ　Ａ，ｅｔ　ａ１．ＨＩＰＫ２：ａ　ｖｅｒｓａ—　ｔｉｌｅ　ｓｗｉｔｃｈｂｏａｒｄ　ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ　ｔｈｅ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　ｍａｃｈｉｎｅｒｙ　ａｎｄ　ｃｅｌｌ　ｄｅａｔｈ［Ｊ］．Ｃｅｌｌ　Ｃｙｃｌｅ，２００７，６：１３９—１４３．　［１　１］Ｄ’Ｏｒａｚｉ　Ｇ，Ｃｅｃｃｈｉｎｅｌｌｉ　Ｂ，Ｂｒｕｎｏ　Ｔ，ｅｔ　ａ１．Ｈｏｍｅｏｄｏｍａｉｎ—　ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｋｉｎａｓｅ一２　ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｅｓ　ｐ５３　ａｔ　Ｓｅｒ　４６　［４］Ｋｉｍ　ＹＨ，Ｃｈｏｉ　ＣＹ，Ｋｉｍ　Ｙ，Ｃｏｖａｌｅｎｔ　ｍｏｄｉｉｆｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｈｏｍｅｏｄｏｍａｉｎ—ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｋｉｎａｓｅ　２（ＨＩＰＫ２）ｂｙ　ｔｈｅ　ｕｂｉｑｎｉｔｉｎ—ｌｉｋｅ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ＳＵＭＯ一１［Ｊ］．Ｐｒｏｃ　Ｎａｉｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ，１９９９，９６：１２３５０—１２３５５．　ａｎｄ　ｍｅｄｉａｔｅｓ　ａｐｏｐｔｏｓｉｓ［Ｊ］．Ｎａｔ　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ，２００２，４：１１－９．　［１２］Ａｎｚｉｌｏｔｔ　Ｓ，Ｔｏｒｎｉｎｃａｓａ　Ｍ，Ｇｅｒｌｉｎｉ　Ｒ，ｅｔ　ａ１．Ｇｅｎｅｔｉｃ　ａｂｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｈｏｍｅｏｄｏｍａｉｎ．－ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｋｉｎａｓｅ　２　ｓｅｌｅｃ－－　［５］Ｌｉ　ＸＬ，Ａｍｉ　Ｙ，Ｈａｒａｄａ　Ｈ，ｅｔ　ａ１．Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ＨＩＰＫ２　ｇｅｎｅ　ｉｎ　ａｃｕｔｅ　ｍｙｅｌｏｉｄ　ｌｅｕｋｅｍｉａ　ａｎｄ　ｍｙｅｌｏｄｙｓｐｌａｓｔｉｃ　ｔｉｖｅｌｙ　ｉｎｄｕｃｅｓ　ａｐｏｐｔｏｓｉｓ　ｏｆ　ｃｅｒｅｂｅｌｌａｒ　Ｐｕｒｋｉｎｊｅ　ｃｅｌｌｓ　ｄｕｒｉｎｇ　ｓｙｎｄｒｏｍｅ　ｉｍｐａｉｒ　ＡＭＬ１一ａｎｄ　ｐ５３一ｍｅｄｉａｔｅｄ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ［Ｊ］．　Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，２００７，２６：７２３１—７２３９．　ａｄｕｌｔｈｏｏｄ　ａｎｄ　ｇｅｎｅｒａｔｅｓ　ａｎ　ａｔａｘｉｃ—ｌｉｋｅ　ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ［Ｊ］．Ｃｅｌｌ　Ｄｅａｔｈ　Ｄｉｓ，２０１５，６：ｅ２００４．ｄｏｉ：　１０．１０３８／ｃｄｄｉｓ．　［６］Ｓｏｍｂｒｏｅｋ　Ｄ，Ｈｏｆｍａｎｎ　ＴＧ．ＨＯＷ　ｃｅｌｌｓ　ｓｗｉｔｃｈ　ＨＩＰＫ２　ｏｎ　ａｎｄ　２０１５．２９８．　０ｆｆ［Ｊ］．Ｃｅｌｌ　Ｄｅａｔｈ　Ｄｉｆｆｅｒ，２００９，１６：１８７—１９４．　［７］Ｆａｎ　Ｙ，Ｗａｎｇ　Ｎ，Ｃｈｕａｎｇ　Ｐ，ｅｔ　ａ１．Ｒｏｌｅ　ｏｆ　ＨＩＰＫ２　ｉｎ　［１３］Ｗｅｉ　Ｑ，Ｄｏｎｇ　Ｇ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ　Ｊ，ｅｔ　ａ１．Ｔｈｅ　ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ　ｒｏｌｅ　ｏｆ　Ｂａｘ　ｉｎ　ｅｉｓｐｌａｔｉｎ　ｎｅｐｈｒｏｔｏｘｉｃｉｔｙ．［Ｊ］．Ｋｉｄｎｅｙ　Ｉｎｔ，２００７，　７２：５３—６２．　ｋｉｄｎｅｙ　ｉｆｂｒｏｓｉｓ［Ｊ］．Ｋｉｄｎｅｙ　Ｉｎｔ　Ｓｕｐｐｌ，２０１４，４：９７—１０１．　［８］Ｌｉｕ　Ｒ，Ｄａｓ　Ｂ，Ｘｉａｏ　Ｗ，ｅｔ　ａ１．Ａ　Ｎｏｖｅｌ　Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ　ｏｆ　Ｈｏｍｅ一　新闻点击　腹部脂肪与妊娠糖尿病风险有关　据美国ＷｅｂＭＤ医学新闻网（２０１５—１０—２３）报道，最新研究指出，在怀孕初期腹部有大量脂肪的女性于怀孕后期罹患糖尿　病的风险增加。　这篇研究针对近５００位１８～４２岁的妇女，他们在怀孕１１～１４周的时候以超声波检测腹部脂肪，那些脂肪较多的妇女比较　可能在怀孕２４～２８周时罹患糖尿病，但这篇研究只显示怀孕时腹部脂肪与糖尿病风险有关联性，而不是因果关系。　多伦多圣米歇尔医院的Ｌｅａｎｎｅ　Ｄｅ　Ｓｏｕｚａ博士认为，这篇研究强调怀孕初期筛检患者以及用腹部脂肪预测糖尿病的潜力。　研究人员认为，有妊娠糖尿病风险的孕妇可以采取预防措施，如采用健康的饮食与生活习惯，避免腹部体质量增加太　多等。　这篇研究刊等在２０１５—１１—０２（糖尿病护理》（Ｄｉａｂｅｔｅｓ　Ｃａｒｅ）。