(12)发明专利申请
(10)申请公布号 CN 107619795 A(43)申请公布日 2018.01.23
(21)申请号 201710607653.X(22)申请日 2017.07.24(83)生物保藏信息
CCTCCM2017225 2017.05.02
(71)申请人 石河子大学
地址 832003 新疆维吾尔自治区石河子市
北四路221号石河子大学化学化工学院(72)发明人 张根林 娄兴丹 党艳艳 (74)专利代理机构 北京科家知识产权代理事务
所(普通合伙) 11427
代理人 陈娟(51)Int.Cl.
C12N 1/16(2006.01)C12R 1/645(2006.01)
(54)发明名称
一种高富硒酵母及其富硒优化方法(57)摘要
本发明公开了一种高富硒酵母及其富硒优化方法，属于生物工程领域。该高富硒酵母，分类学命名为粘红酵母Rhodotorula glutinis，命名为X20，其保藏编号为：CCTCCM2017225。同时提供了一种通过添加磷酸盐诱导酵母高亲和力磷酸盐-硒转运蛋白表达，从而提高酵母对硒的转运能力和耐受性的富硒优化方法。该富硒优化方法，仅需在培养基中添加磷元素，操作程序简单，添加量少，成本低。
权利要求书2页 说明书6页
序列表1页 附图1页
CN 107619795 ACN 107619795 A
权 利 要 求 书
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1.一种高富硒酵母，分类学命名为粘红酵母(Rhodotorula glutinis X20)，其18SrDNA基因序列为：
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CN 107619795 A
权 利 要 求 书
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2.如权利要求1所述的一种高富硒酵母，其特征在于：所述的高富硒酵母的保藏编号为CCTCCM2017225。
3.权利要求1或2所述的一种高富硒酵母的富硒优化方法，其步骤包括：使用的培养基为2±0.2％(质量)的甘油、1±0.1％(质量)的酵母粉和2±0.2％(质量)的蛋白胨，并加入0.1～0.4mM/L的磷酸盐，培养12±0.5h后添加浓度为50～80μg/mL的硒盐，30±2℃震荡培养36±1h，用原子荧光光度计测定酵母的富硒量。
4.如权利要求3所述的一种高富硒酵母的富硒优化方法，其特征在于：所述的磷酸盐为磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾中的一种或几种。
5.如权利要求3或4所述的一种高富硒酵母的富硒优化方法，其特征在于：所述的用原子荧光光度计测定酵母的富硒量，其富硒量为：4500-5009μg/g。
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CN 107619795 A
说 明 书
一种高富硒酵母及其富硒优化方法
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技术领域
[0001]本发明属于生物工程领域，具体涉及一种富硒酵母及其富硒优化方法。
背景技术[0002]硒是人体和动物所必须的微量元素之一，具有提高机体免疫力、降低致癌因子的突变、清除体内自由基、抑制脂质过氧化反应等生物学功能，能够维持甲状腺激素代谢、心血管系统、抗氧化防御系统和免疫系统的正常功能。研究发现，克山病、大骨节病、白内障、糖尿病等40余种疾病均与硒的缺乏有关。我国属于严重缺硒国家，国土面积72％地区的土壤硒元素缺乏(<0.6mg/kg),其中30％的地区严重缺硒。我国硒的分布地主要有恩施、丰城、浙江龙游和新疆天山北坡。当前，我国大部分人群平均每天摄入量26-32μg，明显低于世界卫生组织制定的硒参考摄入量每天40-200μg，因此，富硒产品的发展对提高国民健康水平具有重要意义
[0003]酵母由于具有较高的富硒能力，且营养丰富，含有8种必须氨基酸、各种维生素和丰富的麦角固醇，被认为是一种安全有效的食品硒源。目前富硒酵母是将普通酿酒酵母或产朊假丝酵母培养基中添加适量的亚硒酸钠，于一定的培养条件下获得。但所用富硒酵母菌株大多为人工培育菌株，稳定性较差，且对硒的耐受性不强，富集硒能力有限。发明内容
[0004]本发明要解决的技术问题是：提供一种稳定性好，且对硒的耐受性强，富集硒能力强的高富硒酵母。
[0005]为解决上述技术问题，采用的技术方案是：一种富硒酵母，本菌株是从新疆天山北坡富硒地带的葡萄园中分离得到，该菌分类学命名为粘红酵母Rhodotorula glutinis，命名为X20，于2017年5月2日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCM2017225；保藏地址：湖北省武汉市，洪山区八一路大学，中国典型培养物保藏心，邮编：430072。[0006]所述的富硒酵母的18SrDNA基因序列为：
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CN 107619795 A说 明 书
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CN 107619795 A[0008]
说 明 书
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所述的富硒酵母，其菌株特征为：细胞呈卵形，其宽度大小为3.5～5.0μm，长度为
6.0～10μm，多边芽殖，有明显的红色色素，在YPD培养基上培养5-7天，菌苔颜色呈现珊瑚红到橙红或微带橘红色，表面可由光滑到褶皱，有光泽，质地粘稠。[0010]本发明所要解决的第二个技术问题是：提供一种酵母富硒优化方法。[0011]为解决第二个技术问题，采用的技术方案是：一种酵母富硒优化方法，其步骤包括：使用的培养基为2±0.2％(质量)的甘油、1±0.1％(质量)的酵母粉和2±0.2％(质量)的蛋白胨，并加入0.1～0.4mM/L的磷酸盐(目的是诱导酵母中高亲和力磷酸盐-硒转运蛋白的表达，提高酵母对硒的转运能力和耐受性)，培养12±0.5h后添加浓度为50-80μg/mL硒盐，30±2℃震荡培养36±1h，用原子荧光光度计测定酵母的富硒量。[0012]所述的磷酸盐为磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾中的一种或几种。
[0013]所述的用原子荧光光度计测定酵母的富硒量，其富硒量为：4500-5009μg/g。[0014]本发明的有益技术效果：
[0015]1)所述的高富硒酵母Rhodotorula glutinis X20，于2017年5月2日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCM2017225，培养方法简单，培养时间短，该高富硒酵母稳定性好，且对硒的耐受性强，富集硒能力强，富硒量高。[0016]2)本发明所述方法的富硒优化方法，仅需在培养基中添加磷元素，操作程序简单，添加量少，成本低。
[0009]
附图说明
[0017]附图1是粘红酵母Rhodotorula glutinis X20的扫描电镜图。
具体实施方式
[0018]下面结合实施例，对本发明的具体实施方式进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
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CN 107619795 A[0019]
说 明 书
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实施例1
[0020]富硒酵母的筛选
[0021]1)选取新疆石河子市和沙湾县北部含硒0.6～8.2mg/kg的中上等富硒土壤为采样地点，随机设置5个采样点，主要采集葡萄地表面下5cm～10cm适合微生物生长土壤，获取50个样品。
[0022]2)在150ml锥形瓶中加入99ml的无菌水和1g的土壤样品，放到30℃、180转的摇床中震荡孵育12h。吸取100ul锥形瓶中的溶液加入到马丁培养基(含有0.5％蛋白胨、1％葡萄糖、0.1％磷酸二氢钾、0.05％硫酸镁、2％琼脂、0.03％孟加拉红溶液、0.01％氯霉素)中培养，在30℃培养箱中培养4-5d。
[0023]3)根据酵母菌株和细胞的形态特征，用肉眼观察马丁培养基生长的菌落，挑取培养基中形态较为光滑、圆润的粉红色菌落，获得初始酵母菌株。[0024]4)为了从初始酵母中筛选出富硒能力较强的酵母菌株，选用在硒浓度为50mg/L的YPD培养基中进行培养，培养时间为36h，培养温度为30℃，利用原子荧光光度计检测酵母中硒含量，用紫外分光光度计检测其生物量，获得高富硒酵母X20，富硒量为790μg/g，生物量为4.64g/L。[0025]实施例2
[0026]富硒酵母的鉴定
[0027]1)通过扫描电镜观察酵母形态特征，发现细胞呈卵形，其宽度大小为3.5～5.0μm，长度为6.0～10μm，多边芽殖，有明显的红色色素，很多种因生荚膜而形成粘质状菌落。在YPD培养基上培养3-5天左右，菌苔颜色呈现由珊瑚红逐渐变为橙红。表面可由光滑到褶皱，有光泽，质地粘稠。
[0028]2)提取高富硒酵母X20的基因组，设计引物扩增其18SrDNA序列，送交测序公司测序，获得如下18SrDNA基因序列：
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CN 107619795 A说 明 书
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CN 107619795 A[0030]
说 明 书
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3)将上述序列提交至美国国家生物技术信息中心(National Center for
Biotechnology Information，NCBI)，利用BLAST工具比对分析，结果显示，提交的基因序列与数据库中的粘红酵母基因序列的匹配度为99％，结合形态特征确定该样品为粘红酵母X20，于2017年5月2日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCM2017225；保藏地址：湖北省武汉市，洪山区八一路大学，中国典型培养物保藏心，邮编：430072。[0032]实施例3
[0033]添加磷元素优化菌株富硒效果[0034]在含有2％甘油、1％酵母粉和2％蛋白胨的培养基中加入磷酸二氢钠，诱导酵母中高亲和力磷酸盐-硒转运蛋白的表达，提高酵母对硒的转运能力和耐受性。当培养基中分别添加0.1，0.2，0.3或0.4mM/L的磷酸氢二钠盐，培养12h时添加浓度为50～80μg/mL硒盐，30℃震荡培养36h，用原子荧光光度计测定酵母的富硒量，测得的高达4500-5009μg/g的富硒量。[0035]用原子荧光光度计测定酵母的富硒量为：4500-5009μg/g。
[0031]
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CN 107619795 A
序 列 表
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SEQUENCE LISTING<110> 石河子大学<120> 一种高富硒酵母及其富硒优化方法<160> 1<170> PatentIn version 3.1<210> 1<211> 1483<212> DNA<213> 粘红酵母Rhodotorula glutinis X20 18SrDNA<400> 1gctctcgcga gctcccaata gccaatccgg aggcctcact aagccattca atcggtagta 60gcgacgggcg gtgtgtacaa agggcaggga cgtaatcaac gcgatctgat gaatcacgct 120tactaggtat tcctcgttga agaacaataa ttgcaatgtt ctatccccat cacgacagag 180tttcacaaga ttacccatgc cttccggcaa aggtggtaga ctcgctggct ctgtcagtgt 240agcgcgcgtg cggcccagaa catctaaggg catcacagac ctgttattgc ctcaaacttc 300catcagctaa acgctgatag tccctctaag aagacagcag ctaaccaaag tcggctggtc 360tatttagcag gttaaggtct cgttcgttat cggaattaac cagacaaatc actccaccaa 420ctaagaacgg ccatgcacca ccaaccacaa gatcaagaaa gagctatcaa tctgtcaatc 480cttattgtgt ctggacctgg tgagtttccc cgtgttgagt caaattaagc cgcaggctcc 540acacctggtg gtgcccttcc gtcaattcct ttaagtttca gccttgcgac catactcccc 600cccgaacctc atttaaagat ttctcttcgg gtgccgacac agtcattaaa aatcctgtgc 660cgatccccaa ttggcatagt ttacagaaga gactacaacg gtatctaatc gttttcgatc 720ccccttcctt cgttcttgat caatgaaaac atccttggca aatgctttcg cagtagtttg 780tcttccggca atccaagaat ttcacctctg acgacggaat acaaatgccc ccaactatcc 840ctattaatca ttacggcgat ctcagaaacc aacaaaatgg gaacgcgcgt cctattctat 900tattccatgc taatgtattc gggcaaaggc ctgctttgaa cactctaatt ttttcaaagt 960aaacgtcct ggtttgcaacg acacccagta aaggacatcg ctgttcacca ggaggtaagg 1020tcccatcca acaagtacac accaagaagg cggaccggcg gacaggacccg aagttcgact 1080acgagctttt taacggcaac aactttaata tacgctattg gagctggaat taccgcggct 1140gctggcacca gacttgccct ccaattgatc ctcgttaagg gatttaaatt gtactcattc 1200caattgcaag acccgtaaga gccctgcatt gttatttatt gtcactatct cggcaaagtg 1260ttgccagggg ataatttgcg cgcctgctgc gtgtccttag acctgagggc cgtttctcag 1320gccctctctc cggaatcgaa cccttattcc ccgttacccg tcatcaccat ggtaggcctc 1380tatcctacca tcgaaagttg atagggcag atatttgaat gaagcatcgcc ggcgcaaggc 1440catgcgattc gagcagttat catgatcacc aagagacccg aag 1483
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CN 107619795 A
说 明 书 附 图
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图1
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