实验二 胆红素氧化酶的初步分离纯化

一、实验目的

1、了解酶蛋白盐析和透析的原理；

2、掌握如何用硫酸铵盐析和用透析袋对粗蛋白进行透析。 二、实验原理

向蛋白质溶液中加入高浓度的中性盐，以破坏蛋白质的胶体性质，使蛋白质的溶解度降低而从溶液中析出的现象称为盐析。蛋白质在水溶液中的溶解度是由蛋白质周围亲水基团与水形成水化膜的程度，以及蛋白质分子带有电荷的情况决定的。当用中性盐 加入蛋白质溶液，中性盐对水分子的亲和力大于蛋白质，于是蛋白质分子周围的水化膜层减弱乃至消失。同时，中性盐加入蛋白质溶液后，由于离子强度发生改变，蛋白质表面电荷大量被中和，更加导致蛋白溶解度降低，使蛋白质分子之间聚集而沉淀。常用中性盐主要有硫酸铵、硫酸镁、硫酸钠、氯化钠、磷酸钠等。其中应用最广的是硫酸铵，它的优点是温度系数小而溶解度大。 蛋白质用盐析法沉淀分离后，需脱盐才能获得纯品，脱盐常用的方法为透析法。

蛋白质在溶液中因其胶体质点直径较大，不能透过半透膜，而无机盐及其他 低分子物质可以透过，故利用透析法可以把经盐析法所得的蛋白质提纯，即把蛋 白质溶液装入透析袋内，透析袋可用玻璃纸、火棉胶、动物膜、羊皮纸等制成， 将袋口用线扎紧，然后把它放进蒸馏水或缓冲液中进行透析，这时盐离子通过透 析袋扩散到水或缓冲液中，蛋白质分子量大，不能透过透析袋而被保留在袋内， 通过不断更换袋外蒸馏水或缓冲液，直至袋内盐分透析完为止。 三、实验器材与试剂

1．试剂：硫酸铵、透析袋

2．器材：布氏漏斗、真空泵、电炉

四、操作步骤

1、酶液收集：在培养基中加入适量的蒸馏水，并将培养基捣碎，然后放入摇床振荡30分钟，用布氏漏斗真空抽滤

2、硫酸铵的加入：在滤液中缓缓加入硫酸铵，边加边搅拌，至浓度80％（如何达到）左右，注意不要产生大量的气泡（为什么）

3、沉淀的收集：离心倒掉上清液

4、透析袋的处理：透析袋析使用前必须处理，将透析袋剪成一定长度（20cm），再将透析袋置于0.5mol/LEDTA溶液中煮0.5h（作用），弃去溶液，用蒸镏水洗净。（注意不要老是用）

5、透析：将袋的一端用透析夹夹紧，再将粗酶液从另一端加入透析袋中，然后放入盛有蒸馏水的烧杯中，然后每隔1小时换一次水，共3次，最后加入大量的蒸馏水静置过夜，第二天收集酶液放入冰箱中保存。注意透析袋要扎紧，不要弄破。

注意：以上1、3、5中每个步骤应留出0.5ml酶液同时要记录下溶液的体积做下面的试验

A、

相对酶活测定：2，2 -连氮-双(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸铵)(简称

ABTS)为酶的底物，在3mL反应体系中，含有2.7mlpH4.5 0.2mol/L乙酸-乙酸钠缓冲液，0.1ml酶液，0.2ml1mmol/L ABTS，按次序混合并摇匀，30秒后开始记录A420，每隔15秒记一个A420nm值，连续记录6个数据，再平均。一个酶活力单位（U）：在上述条件下，15秒钟内A420nm处吸光值的变化值。

Box + ABTS（无色）-----ABTS2+（绿色，在420nm有最大吸收峰值） B、 蛋白质测定：参考考马斯亮蓝法

C、 酶的纯化表的计算：

溶液 步骤 体积(ml) 量（mg） 酶过 滤液 硫酸铵 沉淀后 透析后 1 100％ 力（U） （U/mg） 倍数 总蛋白含 总酶活 比活力 纯化 回收率 五、 结果与分析

1、在盐析过程中要注意哪些事项？影响盐析效果和哪些因素有关？ 2、如何检测盐分子是否透析完全？ 3、酶回纯化率的计算。 六、胆红素氧化酶测定的原理：

以2，2 -连氮-双(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸铵)(简称ABTS)为酶的底物，采用UV-2201型紫外-可见分光光度计连续记录酶反应在25℃，420nm 波长下的时间历程曲线，并求取最初部分的斜率以计算酶活的方法．该方法直观、方便、准确且可靠。

ABTS法测酶活[32]：

参考文献略作改动，在3ml反应体系中，含有0.1ml酶液，2.7mlpH4.5 0.1mol/LHAc-NaAc缓冲液，0.2mL 1mmol/LABTS，混合30秒后，在420nm下，每隔

15秒测一个A420

1个酶活力单位：每分钟催化1μmolABTS氧化所需的酶量。 酶活力单位的计算（U/mL）：

由朗伯-比尔定律A=εLC，得C=A/εL （1） （其中，消光系数ε

420=3.6×10

4

（mol/L）-1·cm-1=36（μmol/mL）-1，L为比

色皿的光径，本试验中L=1cm）

又∵U=CV总/t （2） 将（1）代入（2），得：

U=CV总/t=A420/（εL）×（V总/t）= A420×V总/（εLt）

带入数据得：U= A420×3mL/（36（μmol/mL）-1×cm-1×1cm×15/60min） = A420/3

U/V酶=稀释倍数×(A420/3)/0.1

=稀释倍数×A420×10/3（U总=3mL，t=15秒，即15/60min，V酶=0.1mL）