大肠菌群的检测

目 录

摘 要 .......................................................... 错误！未定义书签。 关键词 .......................................................... 错误！未定义书签。 Abstract ........................................................ 错误！未定义书签。 Key words ....................................................... 错误！未定义书签。 1 乳糖胆盐发酵法 .................................................... 错误！未定义书签。

1.1实验原理 ..................................................... 错误！未定义书签。 1.2 实验前准备 .................................................. 错误！未定义书签。 1.2.1 检验样品 ............................................... 错误！未定义书签。 1.2.2 设备及材料 .............................................................. 1 1.2.3 培养基和试剂 ............................................................ 1 1.2.4 检验程序 ................................................................ 1 1.3 实验方法步骤 ................................................ 错误！未定义书签。 1.4 实验结果 ..................................................................... 3 1.5 实验注意事项 ................................................ 错误！未定义书签。 2 最可能数（MPN）法 ................................................. 错误！未定义书签。

2.1 实验原理 .................................................... 错误！未定义书签。 2.2 实验前准备 .................................................. 错误！未定义书签。 2.2.1 检验样品 ............................................... 错误！未定义书签。 2.2.2 检验器材 ............................................... 错误！未定义书签。 2.2.3 检验程序 ............................................... 错误！未定义书签。 2.3 实验方法步骤 ................................................................. 4 3 结果与讨论 ......................................................................... 4 参考文献 ............................................................................. 8 致 谢 ................................................................................ 9 附录一 .............................................................................. 10

I

华中农业大学学士学位论文（设计）

论大肠菌群检测方法

摘 要

大肠菌群是指一群好氧及兼性厌氧，在37℃、24h能分解乳糖产酸产气的革兰氏阴性无芽孢杆菌。大肠菌群主要来源于人畜粪便，故以此作为粪便污染指标来评价食品的卫生质量，具有广泛的卫生学意义。它反映了食品是否被粪便污染，同时间接地指出食品是否有肠道致病菌污染的可能性。食用大肠菌群超标的食品，可能会引起急性中毒、呕吐、腹泻等症状。将乳糖胆盐发酵法和最可能数（MPN）法这两种最常用的方法进行实验对比，得出最有效的方法。检测食品的大肠菌群，结果显示：381份样品中两种方法对大肠菌群的检测结果相同，合格率均为86.6%，两者符合率100%。乳糖胆盐发酵法是常规三步法，操作繁琐，效率低，不太适合大量检测工作的需要。快速检测能使原来的检测周期由72小时缩短到18小时，同时大大简化操作程序。。

关键词

大肠菌群检测；实验对比；检测结果；合格率；效率；大量检测工作

Concerning escherichia coli detection methods

Coliforms refers to a good group of oxygen and facultative anaerobic, in 37 ℃, 24h can decompose lactose and produces acid and gas of gram-negative without bacillus Coliforms mainly comes from zoon- osis-borne feces. Therefore, as faecal pollution indicators to assess the hygienic quality of food, Has the extensive hygiene significance. It reflects the food whether excrement polluted. Meanwhile indirectly says the food whether there is the possibility of contamination intestinal pathogenic bacteria. Edible coliforms excessive amounts of food. May cause acute poisoning, vomiting, diarrhea. Will lactose bile salts,

fermentation and most likely number (MPN) method these two kinds of the most commonly used method compared, it is concluded that the most effective approach. Detection of food, and the results showed that coliforms 381 sample of two methods of coliform group testing results are identical, qualified, both coincidence rate 100%. 86.6 Lactose bile salts fermentation is conventional three-stage method, the

operation trival, low efficiency, doesn't suit the needs of the work of detection. Fast detection can make the original testing cycle by 72 hours shorten to 18 hours, while greatly simplified operating procedures.

key words

Coliforms detection；Experimental comparison;Test results; Pass rate;Efficiency; Lots of testing work

II

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前言

大肠菌群并非细菌学分类命名，而是卫生细菌领域的用语，它不代表某一个或某一属细菌，而指的是具有某特性的一组与粪便污染有关的细菌，这些细菌在生化及血清方面并非完全一致，其定义为：需氧及兼性厌氧、在37℃能分解乳糖产酸产气的革兰氏阴性无芽孢杆菌。一般认为该菌群细菌可包括大肠埃希氏菌、柠檬酸杆菌、产气克雷白氏菌和阴沟肠杆菌等。大肠菌群分布较广，在温血动物粪便和自然界广泛存在的地方，人畜粪便对外界环境的污染是大肠菌群在自然界存在的主要原因。正常人类粪便以典型的大肠杆菌为主，而腹泻患者粪便则大肠菌群其他型别有明显的增加。所以单一以大肠菌杆菌作为指示菌，不仅检出方法繁琐不够快速，而且并不确切，比不上以大肠菌群作为指示菌所具有良好的指标条件和特异性。故以大肠菌群作为食品被粪便污染的指标细菌，现已广泛的应用于世界上许多国家，其中也包括我国在内。此外，大肠菌群还可以同时间接地指出食品中是否有肠道致病菌的可能性，早在19世纪末就有人用检查大肠杆菌的方法来确定水中有无伤寒沙门氏菌。谁收到沙门氏菌的污染，有时水中该菌的数量很少，不宜直接检出。若水中检出一定数量的大肠菌群，则说明水已被粪便污染，沙门氏菌或其他肠道致病菌就有可能存在。

如果大肠菌群存在于食品中，表明食品未做有效的消毒处理、加工后保存条件不良或消毒又受到污染。快速检验大肠菌群，有助于食品的卫生管理，维护消费者的健康安全。国标GB/T4789.3-2003大肠菌群测定中乳糖胆盐发酵法是常规三步法：乳糖胆盐处发酵、伊红美蓝培养和乳糖复发酵、革兰氏染色证实实验。由于操作繁琐，费时费力，不太能适应大量检测的工作需要。因此寻找快速、准确、标准化的大肠菌群测定方法，能够省去了繁杂的试剂配制、分装、消毒等工作，提高了工作效率，符合现代检测想快速、准确方向发展的需要。

1 乳糖胆盐发酵法

1.1实验原理

大肠菌群系指一群能发酵乳糖，产酸产气，需氧和兼性厌氧的革兰式阴性无芽孢杆菌。一般认为该菌群细菌包括：大肠埃希氏菌、柠檬酸杆菌、产气克雷白氏菌和阴沟肠杆菌等。该菌主要来源于人畜粪便，故以此作为粪便污染指标来评价食品的卫生质量，具有广泛的卫生学意义。他反应了食品是否被粪便污染，同时间接地指出食品中是否有肠道致病菌的可能性。

1.2 实验前准备

1.2.1 检验样品

食糖、糖果、饮料、蜂蜜、饼干、果冻、饮用水等7类食品共381份 1.2.2 培养基和试剂

冰箱：0℃～4℃；恒温培养箱：36℃±1℃;恒温水浴锅：46℃±1℃；显微镜：10﹡～100﹡； 均质器或灭菌乳钵；架盘药物天平：0g—500g,精确至0.59；灭菌吸管1ml(具0.01L刻度)； 100ml（具0.1ml刻度）；灭菌锥形瓶：500mLo；灭菌玻璃珠：直径约5mm；灭菌培养皿：直径90mm；灭菌试管：16mm或160mm；灭菌刀、剪子、镊子等 1.2.3培养基和试剂

乳糖胆盐发酵管;伊红美蓝琼脂平板；乳糖发酵管；EC肉汤；磷酸盐缓冲液；0.85%灭菌生理盐水；革兰氏染色液

1.2.4检验程序（图一）

1

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图一 乳糖胆盐发酵法

1.3 实验方法步骤

1.3.1 检样稀释

以无菌操作将检样25 (mL）放于含有225ml灭菌生理盐水或其他稀释液的灭菌玻璃瓶内（瓶内预置适当数量的玻璃珠）或灭菌乳钵内，经充分振摇或研磨做成1：10的均匀稀释液。固体检样在加入稀释液后，最好用灭菌均质器，以8 000r／min～10 000r/min的速度处理1min，做成l：10的均匀稀释液。

用1mL灭菌吸管吸取1：10稀释液1mL，沿管壁徐徐注人含有9ml灭菌生理盐水或其他稀释液的试管内，振摇试管混匀，做成1：100的稀释液。

另取1mL灭菌吸管，按上条操作依次做l0倍递增稀释液，每递增稀释一次，换用1支1mL灭菌吸管．

1.3.2 乳糖发酵试验

根据食品卫生标准要求或对检样污染情况的估计，选择三个稀释度，每个稀释度，接种三管。乳糖发酵试验将待检样品接种于乳糖胆盐发酵管内，接种量在1mL以上者，用双料乳糖胆盐发醉管，1mL及1mL以下者，用单料乳糖胆盐发酵管。每一稀释度接种三管，置36℃ 士1℃ 温箱内，培养24h士2h，如所有乳糖胆盐发酵管都不产气，则可报告为大肠菌群阴性，如有产气者，则按下列程序进行。

2

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1.3.3分离培养

将产气的发酵管分别转种在伊红美蓝琼脂平板上，置36℃ 土1℃ 温箱内，培养18h～24h，然后取出，观察菌落形态，并做革兰氏染色和证实试验。 1.3.4证实试验

在上述平板上，挑取可疑大肠菌群菌落1个一2个进行革兰氏染色，镜检为革兰式阴性无芽孢杆菌，挑取该菌落的另一部分，接种乳糖复发酵管，置36℃ 士1℃ 培养箱内培养24h士2h，观察产气情况。凡乳糖管产气、革兰氏染色为阴性的无芽胞杆菌，即可报告为大肠菌群阳性。

1.4实验结果

若伊红美兰琼脂培养皿上显示为深紫色，具有金属光泽的菌落；或者是紫黑色，不带或略带金属光泽的菌落；再或者是淡紫色，中心色较深的菌落。就说明大肠菌群为可以菌落了。根据证实大肠菌群阳性的管数，查MPN检索表．报告每100mL (g）大肠菌群的MPN值。查表附录一

1.5实验注意事项

1.5.1程序

大肠菌群的国标检验方法采用三步法。第一步乳糖发酵试验是样品的发酵结果，不是菌种的发酵试验，所以初发酵阳性管，经过后两步。大量检测数据证明，食品中大肠菌群检验程序的符合率、初发酵与证实实验相差很大，不同食品三步法的符合情况也不一致。一般来说，如果平板上有较多典型大肠菌群菌落，革兰氏染色为阴性杆菌，即可做出判定。如果平板上典型甚少或均不够典型，则应多挑菌落作证实试验，以免出现假阴性。 1.5.2MPN检索表

MPN检索表种植提供了3个稀释度，即1,0.1,0.01ml(g);若改用10,1,0.1ml(g)时，表内数字降低或增加十倍。其余可类推。

在MPN检索表第一栏阳性管数下面列出的ml（g）是指原样品的量，并非稀释后的量，对固体样品更应注意。如固体样品1g经10倍稀释后，虽加入1ml量，但实际其中只有含0.1g样品，应按0.1g计。

2 最可能数（MPN）法

2.1 实验原理

大肠菌群可能产生β-半乳糖苷酶，分解液体培养基中的酶底物——4-甲基伞形酮-β-D-半乳糖甘(以下简称MUGal)，使4-甲基伞形酮游离，因而在波长366mm的紫外光灯照射下呈现蓝色荧光。

2.2实验前准备

2.2.1检验样品

食糖；糖果；饮料；蜂蜜；饼干；果冻；饮用水等7类食品共381份 2.2.2检验器材 磷酸盐缓冲液；8.5%生理盐水；MUGal肉汤；Aliz-gal琼脂；培养箱：37℃±1℃ ；平皿：直径 90mm； 冷藏箱：0℃±4℃；天平：感量 0.01g；均质器或乳钵；玻璃珠：直径约 5mm；紫外灯（波长 366nm）； 试管：20mm x 150 mm； 吸管：1.0mL 和 10.0mL广口瓶或三角瓶：容量 500mL；试管架等。 2.2.3实验程序

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2.3实验方法步骤

2.3.1样品的制备

以无菌手续取 25mL（或 25g）样品，加于含 225 mL 无菌磷酸盐缓冲液（或生理盐水）的广口瓶（或三角瓶）内（瓶内预置适当数量的玻璃珠），充分振摇或用均质器以 8 000 r/m～10 000 r/m 均质 1 min成 1∶10 稀释液。

用 1mL 无菌吸管吸取 1∶10 样品稀释液 1.0mL，注入含 9.0 mL 无菌磷酸盐缓冲液（或生理盐水）

的试管内。振摇均匀，即成 1∶100 样品稀释液。 另取 1.0 mL 无菌吸管，按上法制备 10 倍递增样品稀释液。每递增一次，换一支 1.0 mL 无菌吸管。

根据食品卫生标准要求或对样品污染程度的估计，选择三个适宜的连续稀释度，每个稀释度接种三管培养基（MPN 法）或两个平皿（平板法）。 2.3.2 大肠菌群的 MPN 计数

将待检样品和样品稀释液接种MUGal肉汤管， 每管1.0 mL(接种量在1.0 mL以上者， 接种双料MUGal

肉汤管)，每个样品接种三个连续稀释度，每个稀释度接种 3 管培养基。同时另取2 支 MUGal 肉汤管（或双料 MUGal 肉汤管）加入与样品稀释液等量的上述无菌磷酸盐缓冲液（或生理盐水）作空白对照。

将接种后的培养管置于 37 ℃ ± 1℃ 培养箱培养 18～24h。

将培养管置于暗处，用波长 366nm 的紫外光灯照射，如显蓝色荧光，为大肠菌群阳性管；如未显蓝色荧光，则为大肠菌群阴性管。 2.2.2实验结果

结果报告：根据大肠菌群阳性管数，查 MPN 表（见附录 A）,报告每 100mL（g）食品中大肠菌群MPN 值。

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3结果与讨论

采用乳糖胆盐发酵法测定和最可能数（MPN）法，对食糖、糖果、饮料、蜂蜜、饼干、果冻、饮用水等7种食品381份样品进行大肠菌群检测，结果显示：检验合格的样品均为330份，两种方法对样品检验的合格率相同，均为86.6%，两者合格符合率100％；两种方法对大肠菌群的检测结果相符的有365份，符合率95.8％；不合格的51份样品有16份的结果略有不同，占所有样品的4.2%。如表二三四

表一 食糖、糖果、蜂蜜、饼干和果冻的乳糖胆盐发酵法和MUGal肉汤法测定结果比较

阳性管数 1g×3 0 1 1 2 2 2 2 3 3 3 3 3 3

0.1g×3 0 0 1 0 0 1 0 0 1 2 3 3 3 0.01g×3 0 0 0 0 1 0 2 0 0 0 0 1 3 大肠菌群（个/100ml） <30 40 70 90 140 150 200 230 430 930 2400 4600 ≥24000 乳糖胆盐发酵法（份） 274(样品总数) 243 7 4 2 2 3 2 3 4 1 1 1 1 MUGal肉汤法（份） 274(样品总数) 243 5 3 5 3 2 3 2 3 2 1 1 1 表二 饮料和饮用水的乳糖胆盐发酵法和MUGal肉汤法测定结果比较

阳性管数 大肠菌群（个/100ml） 0.1g×3 0 0 0 5

乳糖胆盐发酵法（份） 107(样品总数) MUGal肉汤法（份） 107(样品总数) 87 4 1 10g×3 0 1 1

1g×3 0 0 1 <3 4 7 87 4 1 华中农业大学学士学位论文（设计）

2 2 2 2 3 3 3 3 3 0 0 1 0 0 1 2 2 3 0 1 0 2 0 0 0 1 1 9 14 15 20 23 43 93 150 460 2 1 0 2 1 3 3 2 1 2 0 1 1 2 3 3 2 1 表三 乳糖胆盐发酵法和MUGal肉汤法测定结果合格率比较

样品种 食糖 糖果 蜂蜜 饼干 果冻 饮用水 合计 样品 96 89 75 32 28 65 381 乳糖胆盐发酵法 合格份数 5 71 70 29 25 54 330 合格率（%） 5.2 79.8 93.3 90.6 89.3 83.1 86.6 47 71 70 29 25 54 MUGal肉汤 合格份数 合格率（%） 48.96 79.8 93.3 90.6 89.3 83.1 86.6 330 乳糖胆盐发酵法是根据大肠菌群分解乳糖胆盐中的乳糖，产酸产气，并且使伊红美蓝培养基中伊红与美蓝结合而成黑色化合物，故菌落呈黑紫色，在实际工作中，熟悉大肠菌群菌落特征色泽和形态，对检出率影响很大。为了避免假阴性的判断，通常需要多挑菌落，只挑取一个菌落，由于机率问题，尤其当菌落不典型时，很难避免假阴性的出现。判断受影响的因素比较多，挑取菌落数与大肠菌群的检出率有密切关系，所以挑菌落一定要挑取典型菌落，如无典型菌落则应多挑几个，以免出现假阴性，因而造成工作量加大。并且一般来说，产气量与大肠菌群检出率呈正相关，但随样品种类而有不同，有米粒大小气泡也有阳性检出。对未产气的发酵管有疑问时，可以用手轻轻敲动或摇动试管，如有气泡上浮，即应考虑有气体产生，做进一步实验观察。正中情况的阳性检出率可达半数以上。对可疑菌落的选择和判断非常重要，因此这种检验方法对检验人员的操作经验和熟练程度要求比较严格。

最可能数（MPN）的方法，是根据大肠菌群可产生β－半乳糖干苷酶，分解液体培养基MUGal肉汤中的酶底物――4-甲基伞型酮－β－D－半乳糖苷(简称MUGal)，使4-甲基伞型酮游离，因而在366nm的紫外线灯照射下呈现蓝色荧光，能够更直接得出结果，省去进一步的证实试验，因此从培养到报到结果的时间可缩短为18～24 h，同时能够避免假阴性的出现。 国标乳糖胆盐发酵法是常规三步法，由于操作繁琐，费时费力，不太能适应大量检测工作的需求。快速检测能使原来的检测周期由72小时缩短到18小时，同时大大简化操作程序。MUGal肉汤试

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剂保存期限较长，操作方便，从培养到鉴定的时间相对缩短，有利于生产上的在线分析，及时了解食品指标的情况，发现问题能及时给予调整。MUGal肉汤法与乳糖胆盐发酵法所采用的均为九管法，更有利于在结果上作比较。

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参考文献

[1] GB/T4789-2003。中华人民共和国国家标准，食品卫生微生物学检测；

[2]〔英〕W.F.Harrigan著，李卫华等译 食品微生物实验室手册（第三版）中国轻工业出版社2004，111,115；

[3] 罗雪云，刘宏道 食品卫生微生物检测标准手册[M].北京：中国标准出版社，1995:18～25； [4] 中华人民共和国国家标准.食品卫生微生物学检验，GB/T4789.32003:1318；

[5] 刘京梅,张凌,赵君等;饮用水中大肠菌群检测技术的研究进展[J] 2006年02期; 55-59； [6] 中国预防医学科学院标准处编.食品卫生国家标准汇编（3）GB14934-94［S］.北京:中国标准出版社，1995，101；

[7] 梁小莲，吕秋莎.大肠菌群纸片与培养发酵法检测食具消毒效果比较［J］.中国卫生检验杂志，2001，（11）:272；

[8] 余淑冰，梁景涛，陈淑玲.检测大肠菌纸片可疑结果的实验研究［J］.中国热带医学，2004，4（4）:618～619.

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附录一 1g检样中最近似值(MPN)表

使用三管法,接种量分别为0.1,0.01和0.001g。

━━━━━━━━━━━┳━━━━┳━━━━━━━━━━┳━━━━

阳 性 管 数 ┃ ┃ 阳 性 管 数 ┃

━━━━━━━━━━━┫ MPN ┣━━━━━━━━━━┫ MPN

0.1 0.01 0.001 ┃ ┃ 0.1 0.01 0.001 ┃ ━━━━━━━━━╋━━━╋━━━━━━━━━╋━━━━ 0 0 0 ┃ ＜3 ┃ 2 0 0 ┃ 9.1 0 0 1 ┃ 3 ┃ 2 0 1 ┃ 14 0 0 2 ┃ 6 ┃ 2 0 2 ┃ 20 0 0 3 ┃ 9 ┃ 2 0 3 ┃ 26 0 1 0 ┃ 3 ┃ 2 1 0 ┃ 15 0 1 1 ┃ 6.1 ┃ 2 1 1 ┃ 20 0 1 2 ┃ 9.2 ┃ 2 1 2 ┃ 27 0 1 3 ┃ 12 ┃ 2 1 3 ┃ 34 0 2 0 ┃ 6.2 ┃ 2 2 0 ┃ 21 0 2 1 ┃ 9.3 ┃ 2 2 1 ┃ 28 0 2 2 ┃ 12 ┃ 2 2 2 ┃ 35 0 2 3 ┃ 16 ┃ 2 2 3 ┃ 42 0 3 0 ┃ 9.4 ┃ 2 3 0 ┃ 29 0 3 1 ┃ 13 ┃ 2 3 1 ┃ 36 0 3 2 ┃ 16 ┃ 2 3 2 ┃ 44 0 3 3 ┃ 19 ┃ 2 3 3 ┃ 53

━━━━━━━━━━╋━━━╋━━━━━━━━━╋━━━━

1 0 0 ┃ 3.6 ┃ 3 0 0 ┃ 23 1 0 1 ┃ 7.2 ┃ 3 0 1 ┃ 39 1 0 2 ┃ 11 ┃ 3 0 2 ┃ 64 1 0 3 ┃ 15 ┃ 3 0 3 ┃ 95 1 1 0 ┃ 7.3 ┃ 3 1 0 ┃ 43 1 1 1 ┃ 11 ┃ 3 1 1 ┃ 75 1 1 2 ┃ 15 ┃ 3 1 2 ┃ 120 1 1 3 ┃ 19 ┃ 3 1 3 ┃ 160 1 2 0 ┃ 11 ┃ 3 2 0 ┃ 93 1 2 1 ┃ 15 ┃ 3 2 1 ┃ 150 1 2 2 ┃ 20 ┃ 3 2 2 ┃ 210 1 2 3 ┃ 24 ┃ 3 2 3 ┃ 290 1 3 0 ┃ 16 ┃ 3 3 0 ┃ 240 1 3 1 ┃ 20 ┃ 3 3 1 ┃ 460 1 3 2 ┃ 24 ┃ 3 3 2 ┃ 1100 1 3 3 ┃ 29 ┃ 3 3 3 ┃＞1100 ━━━━━━━━┻━━━┻━━━━━━━━━┻━━━━

注: ①本表采用3个稀释度 [0.1g(mL)、0.01g(mL)和0.001g(mL)],每个稀释度接种3管。 ②表内所列检样量如改用1g(mL)、0.1g(mL)和0.01g(mL)时,表内数字应相应降低10

倍；如改用0.01g(mL)、0.001g(mL)和0.0001g(mL)时,则表内数字应相应增加10倍,其余类推。

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