艾蒿黄酮的提取分离纯化、结构鉴定及其抗氧化性研究

艾蒿黄酮的提取分离纯化、结构鉴定及其抗氧化性研究

姓名：吴娜申请学位级别：硕士专业：食品科学指导教师：孙智达

20080601

艾篙黄酬的提取分离乡ｂ化、结构临定及Ｊｅ抗氧化性研究摘要艾蒿是一种在我国广泛分布的菊科植物，是一种集食品营养价值及药用价值为一身的天然中草药，含有多种具有生理活性的化学成分，其中的黄酮具有很强的抗氧化性。黄酮是多酚类物质，具有高度羟基化的结构，能够起到抗氧化、清除自由基、抑菌等作用，有很好的开发利用价值。（１）本研究首先测定艾蒿叶和茎中蛋白质、总糖、总酸、总多酚、总黄酮等主要化学成分的含量，结果表明武汉狮子山所产艾蒿黄酮含量较高，所以确定为实验材料。（２）对艾蒿黄酮（ＦｌａｖｏｎｏｉｄｓｆｒｏｍＡｒｔｅｍｉｓｉａａｒｇｙｉ，简称ＦＡ）的提取工艺进行了初步探讨，通过单因素实验，在中心组合实验基础上，运用响应面分析法得出了提取ＦＡ的最佳工艺组合：时间１４９ｍｉｎ，乙醇浓度５６％，温度７２℃，料液比１：２０，提取２次。在此最佳工艺组合下ＦＡ的平均提取率可达９１．２％。采用ＡＢ．８大孔树脂纯化艾蒿黄酮的最佳条件：（树脂柱柱长度４８ｃｍ；柱内直径５．２ｃｍ；初始上样液黄酮含量为３７．５６ｍｇ／ｍＬ）上样量为１６ｍＬ，淋洗剂为ｐＨ４的蒸馏水，沈脱剂为ｐＨ４的５０％乙醇，洗脱剂用量为５倍柱体积，树脂可以重复使用３次，产品真空干燥后黄酮纯度达６９．３７％。乙酸乙酯相（ＦＡ２）纯度达７８．２８％，得率为２．６４％；ＦＡ２经过葡聚糖凝胶纯化后（ＦＡＳ），黄酮含量达到９９．１６％，得率为１．８９％。（３）采用ＵＶ、ＩＲ、ＨＰＬＣ、ＨＰＬＣ．ＥＳＩ／ＭＳ等现代分离检测技术对艾蒿黄酮葡聚糖凝胶纯化物的鉴定进行了深入研究。结果表明，艾蒿中含有以芹菜素、槲皮素、香叶木素为苷元的黄酮。（４）通过体外、体内实验研究了艾蒿黄酮的抗氧化活性。①体外抗氧化研究表明，ＦＡ２及ＦＡＳ可有效清除超氧阴离子、羟基自由基、过氧化氢，抑制ＤＮＡ氧化损伤。同时还比较了艾蒿黄酮和Ｖｃ的抗氧化作用，结果表明：艾蒿黄酮抗氧化效应远远高于Ｖｃ。在所测试的四个体系中，二者清除超氧阴离子的能力分别为Ｖｃ的１．５倍和２．７倍；ＦＡＳ清除羟基自由基的能力为Ｖｃ的１．３倍，ＦＡ２清除羟基自由基的能力略低于Ｖｃ；清除过氧化氢的能力分别为Ｖｃ的１．８倍和４．５倍，抑制ＤＮＡ氧化损伤的能力分别为Ｖｃ的１．３倍和１．６华中农业人学２００８届颂ｌ：学位论义倍。②用硫代巴比妥酸（ＴＢＡ）法测定艾蒿黄酮对小鼠红细胞溶血、小鼠肝组织匀浆及肝线粒体脂质过氧化产物ＭＤＡ生成的影响，结果表明艾蒿黄酮在Ｏ．５—１０．０ｍｇ／ｍＬ浓度范围内可提高体外小鼠血清抗活性氧能力，能抑制小鼠红细胞溶血，抑制小鼠肝组织匀浆及肝线粒体ＭＤＡ的生成和肝线粒体肿胀，说明艾蒿黄酮具有体外对小鼠细胞器、细胞的抗氧化作用。③艾蒿黄酮的体内抗氧化实验表明，艾蒿黄酮对降低小鼠肝脏ＭＤＡ含量有显著的作用；能提高小鼠血清ＳＯＤ活性；说明艾蒿黄酮具有一定的体内抗氧化作用。关键词艾蒿；黄酮；分离；鉴定；抗氧化艾－普竹酬的提取分离纯化、结构裕定及）Ｌ抗钒化忡研究ＡｂｓｔｒａｃｔＡｒｔｅｍｉｓｉａａｒｇｙｉｉｓｉＳａａｋｉｎｄｏｆＣｏｍｐｏｓｉｔｅｆａｍｉｌｙｐｌａｎｔｗｉｄｅｌｙｓｐｒｅａｄｉｎＣｈｉｎａ，ａｎｄｋｉｎｄｏｆｈｅｒｂａｌｍｅｄｉｃｉｎｅｗｈｉｃｈｃｏｍｂｉｎｅｓｆｏｏｄｎｕｔｒｉｔｉｖｅｖａｌｕｅａｒｇｙｉｃｏｎｔａｉｎｓｍａｎｙｆｌａｖｏｎｏｉｄｓｋｉｎｄｓｏｆｃｈｅｍｉｃａｌａｎｄｍｅｄｉｃａｌｖａｌｕｅｔｏｇｅｔｈｅｒ．Ａｒｔｅｍｉｓｉａｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｗｉｔｈｖｅｒｙｓｔｒｏｎｇａｃｔｉｖａｔｉｏｎ，ｔｈｅａｍｏｎｇａｔｈｅｍｕｓｕａｌｌｙｈａｓａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔａｎａｂｉｌｉｔｙ．Ｔｈｅｆｌａｖｏｎｏｉｄｓｗｈｉｃｈｈａｓｈｉｇｈｌｙｈｙｄｒｏｘｙｌｓｔｒｕｃｔｕｒｅ．ＩｔＣａｎａｃｔａｓａｓａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ，ｒｅｒｒｌｏｖｅｓｆｌｅｅｒａｄｉｃａｌｓ，ａｎｄｒｅｄｕｃｅｓｒｉｓｋｏｆｃｈｒｏｎｉｃｄｉｓｅａｓｅｓｓｕｃｈｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒｄｉｓｅａｓｅａｎｄｃａｎｃｅｒ．（１）ＭｙｓｔｕｄｉｅｓｆｉｒｓｔｌｙｆｏｃｕｓｅｄｏｎｍｅａｓｕｒｉｎｇｔｈｅｍａｉｎｎｕｔｒｉｔｉｏｎｃｏｎｔｅｎｔｓｉｎｔｈｅａＡｒｔｅｍｉｓｉａａｒｇｙｉＬｅａｖｅｓ．ＴｈｅｓｔｕｄｙｒｅｓｕｌｔｓｉｌｌｕｓｔｒａｔｅｄｔｈａｔｃｅｒｔａｉｎｔｙｐｅｏｆｈａｓａＡｒｔｅｍｉｓｉａａｒｇｙｉ，ｗｈｉｃｈｇｒｏｗｓｉｎＷｕｈａｎｏｆＨｕｂｅｉＰｒｏｖｉｎｃｅｉｎｏｕｒｃｏｕｎｔｒｙｈｉｇｈｒａｔｅｏｆｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ．Ｔｈｅｒｅｆｏｒｅｍａｔｅｒｉａｌ．ｔｈｉｓｔｙｐｅｏｆＡｒｔｅｍｉｓｉａａｒｇｙｉｉｓｃｈｏｓｅｎａｓｍｙｒｅｓｅａｒｃｈｉｎｇ（２）ＴｈｅｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｔｅｃｈｎｉｃｓｏｆｆｌａｖｏｎｏｉｄｓｏｆＡｒｔｅｍｉｓｉａａｒｇｙｉ（ＦＡ）Ｗａｓｓｔｕｄｉｅｄ．Ｔｈｅｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｏｆｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓｗｅｒｅｏｐｔｉｍｉｚｅｄｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｏｆｗｅｒｅｂｙｏｒｔｈｏｒｈｏｍｂｉｃａｎａｌｙｓｉｓ．Ｔｈｅｏｐｔｉｍａｌｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｒａｔｅｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓａｓｆｏｌｌｏｗｓ：ｔｈｅｔｉｍｅ１４９ｍｉｎ，ｔｈｅｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｅｔｈａｎｏｌ５６％，ｔｈｅｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｔｈａｎｉｓ７２。Ｃ，ｔｈｅｏｆｓｏｌｕｔｉｏｎ／ｍａｔｅｒｉａｌｒａｔｅ２０：１．ｔｈｅｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｙｉｅｌｄＷａｓｍｏｒｅＡＢ一８ｔｙｐｅｍａｃｒｏｐｏｒｏｕｓｒｅｓｉｎ９１．２％．ｔｈｅｂｅｓｔｆｏｒｓｅｐａｒａｔｉｎｇａｎｄｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｎｇＡｒｔｅｍｉｓｉａａｒｇｙｉｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ；ｔｈｅｏｐｔｉｍｕｎｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓｉｓ：ｔｈｅｌｏａｄｅｄａｍｏｕｎｔｏｆＡｒｔｅｍｉｓｉａａｒｇｙｉｅｘｔｒａｃｔｉｓ１６ｍＬ，ｗａｓｈｗｉｔｈａｇｅｎｔｉｓｗａｔｅｒ（ｐＨ５．０），ｔｈｅｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎＡＢ一８ｔｙｐｅｒｅｓｉｎｏｆｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ３ｔｉｍｅｓ５０％（ｐＨ５．０）ｅｔｈａｎ０１．ＴｈｅＣａｎｂｅｕｓｅｄｆｏｒｒｅｐｅａｔｅｄｌｙ．Ｔｈｅｃｏｎｔｅｎｔｏｆｆｌａｖｏｎｏｉｄｓｉｎｔｈｅ５０％ｅｔｈａｎｏｌｅｌｕａｎｔｉｓ６９．３７％ａｆｔｅｒｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｗｉｔｈＡＢ－８ｔｙｐｅｒｅｓｉｎ．ＴｈｅｐｕｒｉｔｙｏｆＥｔｈｙｌＡｃｅｔａｔｅｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｏｆＦＡＷａｓ７８．２８％；ｔｈｅｙｉｅｌｄｓｏｆｐｒｏｃｙａｎｉｄｉｎｓｗａｓ２．６４％．ＴｈｅｐｕｒｉｔｙｏｆｙｉｅｌｄｓｏｆｐｒｏｃｙａｎｉｄｉｎｓＷａｓ１．８９％．ｓｅｐｈａｄｅｘｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｏｆＦＡＷａｓ９９．１６％；ｔｈｅ（３）ＴｈｅｐｕｒｉｔｙｏｆｓｅｐｈａｄｅｘｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｏｆＦＡｗｅｒｅｆｕｒｔｈｅｒｓｔｕｄｉｅｄｂｙｓｕｃｈｍｅａｎｓ华中农业人学２００８届颂ｌｊ学位论文ａＳＵＶａｎｄＩＲａｎｄＨＰＬＣａｎｄＨＰＬＣ—ＥＳＩ／ＭＳ．Ｓｔｕｄｙｒｅｓｕｌｔｓｉｎｄｉｃａｔｅｔｈａｔａｐｉｇｅｎｉｎ．ａｒｅｑｕｅｒｃｅｔｉｎａｎｄｃｈｒｙｓｏｅｒｉｏｌｔｈｅｍａｉｎｃｏｎｔｅｎｔｓｉｎｔｈｅｆｌａｖｏｎｏｉｄｓｏｆＡｒｔｅｍｉｓｉａａｒｇｙｉ（４）Ｔｈｅａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔｅｆｆｅｃｔｓ，ａｂｉｌｉｔｉｅｓｄｉｆｆｅｒｅｎｔｅｘｔｒａｃｔｓｉｎｖｉｔｒｏｏｆｓｃａｖｅｎｇｉｎｇａｎｄａｎｔｉｂａｃｔｅｒｉａａｃｔｉｖｉｔｙｏｆａｎｄｉｎｖｉｖｏｗｅｒｅｓｔｕｄｉｅｄ．①ＴｈｅｓｔｒｏｎｇａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔｓｔｕｄｙｒｅｓｕｌｔｓｅｘｐｏｓｅｓｔｈａｔｓｅｐｈａｄｅｘｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｏｆＦＡｉｓｖｅｒｙａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ，ＴｈｅｓｔｕｄｙｓｈｏｗｅｄｔｈａｔＦＡ２ａｎｄＦＡＳｃｏｕｌｄｅｆｆｅｃｔｉｖｅｌｙｓｃａｖｅｎｇｅｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅａｎｉｏｎ，ｈｙｄｒｏｘｙｌｒａｄｉｃａｌ，ｈｙｄｒｏｇｅｎｐｅｒｏｘｉｄｅａｎｄｉｎｈｉｂｉｔＤＮＡｏｘｉｄａｔｉｖｅｄａｍａｇｅ．ＣｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈＦｌａｖｏｎｏｉｄｓｏｆＡｒｔｅｍｉｓｉａａｒｇｙｉａｎｄｖｃ，ｗｅｃｏｕｌｄｓｅｅｔｈａｔｔｈｅｙｈａｄｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔａｃｔｉｖｉｔｙｈｉｇｈｅｒｔｈａｎｓｃａｖｅｎｇｉｎｇｒａｔｅｏｎｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅＶｃ．ＴｈｅｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅａｎｉｏｎｏｆｏｆＦＡ２ａｎｄＦＡＳＷａｓ１．５ｔｉｍｅｓｒａｔｅｏｎａｎｄ２．７ｔｉｍｅｓｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙｓｔｒｏｎｇｅｒＦＡＳＷａｓｔｈａｎｔｈａｔＶｃ；Ｔｈｅｓｃａｖｅｎｇｉｎｇｈｙｄｒｏｘｙｌｒａｄｉｃａｌｏｆｏｎ１．３ｔｉｍｅｓｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙｓｔｒｏｎｇｅｒｔｈａｎｔｈａｔｏｆＶｃ；ＴｈｅｓｃａｖｅｎｇｉｎｇｒａｔｅｈｙｄｒｏｇｅｎｐｅｒｏｘｉｄｅｏｆＦＡ２ａｎｄＦＡＳｗａｓ１．８ｔｉｍｅｓｏｎａｎｄ４．５ｔｉｍｅｓｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙｓｔｒｏｎｇｅｒｔｈａｎｔｈａｔｏｆＶｃ；ＴｈｅｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇｒａｔｅＤＮＡｏｘｉｄａｔｉｖｅｄａｍａｇｅｏｆＦＡ２ａｎｄＦＡＳｗａｓ１．３ｔｉｍｅｓａｎｄ１．６ｔｉｍｅｓｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙｓｔｒｏｎｇｅｒｏｆｔｈａｎｔｈａｔｏｆＶｃ．②ＴｈｅｃｏｎｔｅｎｔＭＤＡｉｎｌｉｖｅｒｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａａｎｄｍｉｃｒｏｓｏｍｅＷａｓｍｅａｓｕｒｅｄｄｅｔｅｃｔｅｄｂｙｂｙｔｈｅＴＢＡａｓｓａｙ；ｈｅｍｏｌｙｓｉｓｏｆＲＢＣａｎｄｔｈｅｓｗｅｌｌｉｎｇｏｆｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｗｅｒｅｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｒｉｃｍｅｔｈｏｄｓ．Ｒｅｓｕｌｔｓ：ＦＡ（０．５—１ｌｅｖｅｌｏｆｓｗｅｌｌｉｎｇ０．０ｍｇ／ｍＬ）ｅｖｉｄｅｎｔｌｙｒｅｄｕｃｅｄｉｎｈｉｂｉｔｔｈｅｅｒｙｔｈｒｏｃａｔａｌｙｓｉｓＭＤＡｉｎｍｉｃｅｌｉｖｅｒａｎｄｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ，ａｎｄｅｘｔｅｎｔａｎｄｔｈｅｏｆｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｏｆｌｉｖｅｒ．ＩｔｓｕｇｇｅｓｔｓｔｈａｔＦＡｍａｙｂｅｅｆｆｅｃｔｉｖｅｌｙｐｒｏｔｅｃｔｍｉｃｅｕｓｅｄ嬲ａｌｌａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔａｎｄｍｉｇｈｔｃｅｌｌ，ｃｅｌｌｆｒｏｍｔｈｅｃａｎｉｎｊｕｒｙｏｆｏｘｉｄａｔｉｏｎ．ｅｎｈａｎｃｅｔｈｅａｃｔｉｖｉｔｙ③Ｔｈｅｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｏｆｍｉｃｅｐｒｏｖｅｄｔｈａｔｔｈｅｆｌａｖｏｎｏｉｄｓｏｆｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅｄｉｓｍｕｔａｓｅ（ＳＯＤ）ｉｎｒｅｄａｂｌｏｏｄｃｅｌｌａｎｄｒｅｄｕｃｅｔｈｅＭＤＡｌｅｖｅｌｉｎｌｉｖｅｒｈｏｍｏｇｅｎａｔｅａｎｄｈａｄＫｅｙｇｏｏｄａｎｔｉ—ｏｘｉｄａｔｉｏｎｆｕｎｃｔｉｏｎ．ｗｏｒｄｓ：ＡｒｔｅｍｉｓｉａａｒｇｙｈＦｌａｖｏｎｏｉｄｓ；Ｓｅｐｅｒａｔｉｏｎ；Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ；ＡｎｔｉｏｘｉｄａｎｔａｃｔｉｖｉｔｙＩＶ华中农业大学学位论文独创性声明及使用授权书学位论文是否保密奄如需保密，解密时间年月日独创性声明本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得华中农业大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料，指导教师对此进行了审定。与我一同７－作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中做了明确的说明，并表示了谢意。研究生签名：羡乜卵时间：加口ｇ年占月Ｊ多日学位论文使用授权书本人完全了解“华中农业大学关于保存、使用学位论文的规定”，即学生必须按照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本；学校有权保存提交论文的印刷版和电子版，并提供目录检索和阅览服务，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存，汇编学位论文。本人同意华中农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。注：保密学位论文在解密后适用于本授权书。学位论文作者签名：象《吁导师签名：；Ｊ锄ａ互一签名日期：ｂ晤年‘月Ｉ弓Ｅｌ签名Ｅｌ期：≯，扩年６月ｔ３Ｅｌ注：请将本表直接装订在学位论文的扉页和日录之间艾高茭酮的提取分离鱼ｂ化、结构搽定及』Ｌ抗氧化件研究第一章艾蒿的研究概况１艾蒿的研究概述艾蒿（ＡｒｔｅｍｉｓｉａａｒｇｙｉＬｅｖｔ．ｅｔＶａｎｔ．）为菊科（Ｃｏｍｐｏｓｉｔａｅ）艾属（Ａｒｔｅｍｉｓｉａ）多年生草本植物，又有艾叶、家艾之称。广布于北半球的温带地区，欧、亚、北美，少数分布于非洲、南亚及中美洲等热带地区，我国（不包括分出的绢蒿属Ｓｅｒｉｐｈｉｄｉｕｍ）有１７０种以上，在我国分布甚广，除极干旱与高寒地区，全国均有生长（顾静文等，１９９８）。艾蒿在我国的应用至少有３０００多年的历史，艾叶药用历史悠久，最早记载于《中医别录》（李慧，２００２）。两千多年前孟子即说过：“七年之病，求三年之艾。’’我国端午节民间有挂带艾叶、饮艾酒及食用艾饼的习俗。尤其是端午节前后的艾叶，青嫩味鲜，具有开胃健脾，进食欲的功效。艾叶不仅是人们喜食的一种天然野生蔬菜，还是一味良药。１．１艾蒿的化学成分艾蒿的药用部位是叶和茎，经研究艾蒿的化学成分主要有挥发油、黄酮、桉叶烷、三萜类及微量化学元素等（周峰等，２０００）。每１００９嫩茎叶含胡萝卜素５．１４ｒａｇ、维生素Ｂ２１．０７ｍｇ、维生素Ｃ５２ｍｇ。其风干叶含蛋白质２５．８５％，脂肪２．５９％，矿物质１０．１３％及维生素等成分（陈茂花，２００２）。（１）黄酮类化合物ＴａｎＲｅｎｘｉａｎｇ等人从艾蒿种鉴定出黄酮类成分主要有５，７．二羟基．６，３，４．三甲氧基黄酮、５．羟基一６，７，３，４．四甲氧基黄酮、槲皮素和艾蒿素（ＴａｎＲｅｎｘｉａｎｇｅｔａｌ，１９９２）。Ｎａｋａｓｕｇｉ等人从艾蒿中提取并鉴定了４种黄酮，分别是异泽兰黄素、金合欢素、芹黄素和香叶木素（Ｎａｋａｓｕｇｉｅｔａｌ，２０００）。（２）挥发油艾蒿全草的挥发油含量为０．２０％＇－－－０．３３％（全国中草药汇编，１９７６）。１９８５年朱亮锋等首次报道了艾蒿的挥发油化学成分，以１，８．桉叶素为主体化合物的挥发油近４０种成分，主要为Ｑ．侧柏烯、蒎烯、莰烯、香桧烯、１．辛烯．３一醇、对．聚伞花素、１，８．桉叶素、Ｙ松油烯、樟脑、龙脑等（朱亮锋等，１９８５）。（３）桉叶烷类化合物艾蒿的桉叶烷类成分有柳杉二醇、魁蒿内酯、１．氧－４１３．乙酰氧基桉叶－２、１１（１３）．二烯一１２，８１３内酯、１．氧－４Ｑ．乙酰氧基桉叶．２，１ｌ·仁中农业人学２００８届颂Ｉｊ学位论义（１３）２二烯一１２，８Ｂ－内酯（ＴａｎＲｅｎｘｉａｎｇｅｔａ１．，１９９２）。（４）三萜类化合物艾蒿的三萜类成分有Ｑ．及Ｂ．香树脂醇、无羁萜、Ｑ．及Ｂ．香树脂醇的乙酸酯、羽扇烯酮、粘霉烯酮、羊齿烯酮、２４．亚甲基环木菠萝烷酮、西米杜鹃醇和３Ｂ．甲氧基．９Ｂ，１９一环羊毛箔．２３（Ｅ）烯．２５，２６．二醇等（ＴａｎＲｅｎｘｉａｎｇｅｔａ１．，１９９２）。（５）微量化学元素用原子吸收光谱测定发现艾蒿中含有多种微量元素，如锶（Ｓｒ），铬（Ｃｒ），钴（Ｃｏ），镍州ｉ），锰（Ｍｎ），铜（Ｃｕ），锌（Ｚｎ），铁（Ｆｅ），钠ｆＮａ），钟（Ｋ），钙（Ｃａ），镁（Ｍ曲等（洪宗国，２００３）。（６）其它化学成分艾蒿的其它化学成分主要有Ｂ．谷甾醇、豆甾醇、棕榈酸乙酯、油酸乙酯、亚油酸乙酯和反式的苯亚甲基丁二酸等（Ａｉｎａ１９８４）。Ｌａｏｅｔａ１．．１．２艾蒿的药理作用中医认为，艾灸可以“透诸经而治百病”，有通经活络、行气活血、祛除寒湿、回阳救逆、防病保健等功效（全国中草药汇编，１９７６）。１．２．１抗菌作用大量的药理研究表明艾叶水浸剂，艾叶烟熏和艾叶油有抗细菌、抗真菌作用。张维西较早研究了艾叶的体外抑菌实验，结果表明艾叶水煎液在体外对炭疽杆菌、ａ和Ｂ．溶血球菌、白喉杆菌、肺炎双球菌、金黄色葡萄球菌等１０种革兰氏阳性嗜气菌皆有抗菌作用（张维西，１９４９；叶春枚等，１９８８；李坡等，１９６５）。１．２．２抗病毒作用上海第二医院附属第三医院气管炎研究组等观察了艾叶烟熏对实验用腺病毒３型、鼻病毒浙九．２株、疱疹病毒浙九．９株，副流感１型病毒仙台株和流感病毒Ａ３沪防７２—１０株等５种呼吸道病毒的抑制作用，结果表明艾叶对这５种病毒都有一定的抑制作用。（上海第二医学院附属第三人民医院气管炎研究组，１９７５）。１．２．３止血作用张学兰等人研究了炮制对艾叶主要成分及止血作用的影响，结果表明：艾叶加热炮制后挥发性成分含量明显降低。炒炭或烘制后对小鼠的凝血及出血时间有２艾蔷她酮的提取分高纯化、结构搭定及！ｅ抗氰化件研究显著影响，具有明显的止血作用。主要用于虚寒性出血，其中以１８０。Ｃ烘１０ｍｉｎ和２００℃烘１０ｍｉｎ所得样品水煎液止血作用最明显，与生品组比较有着显著性差异（张学兰，１９９２）。１．２．４平喘镇咳作用大量的药理实验证明，艾叶的挥发油口服或喷雾给药均有较好的平喘、镇咳作用，其中尤以平喘作用最为显著。（江苏新医学院，１９８６）。１．２．５对心血管系统作用有研究表明１：５０浓度艾叶油１．２滴能明显抑制小鼠心脏的收缩力，对心率影响不大，但可引起房室传导阻滞现象，如加大浓度可使心搏停止。对离体兔心，艾叶油ｌｍＬ（１：１５０）可抑制心脏收缩力，心率及冠脉流量也明显减少，对兔主动脉在紧张度提高的情况下呈松驰作用，且能对抗异丙肾上腺素的强心作用（湖北省卫生局，１９８２）。１．２．６抗过敏作用有研究表明艾叶油中成分２．萜品烯醇、葛缕醇能抑制大鼠被动皮肤过敏反应和５．羟色胺引起的皮肤血管渗透性增强，抑制大鼠肺组织释放ＳＲＳ．Ａ和ＳＲＳ．Ａ的引起大鼠回肠收缩（骆和生，１９９１）。２黄酮类化合物研究概况黄酮类（ｆｌａｖｏｉｄｓ）的名称来源是由于该类化合物大都显黄色，并且其４．位都具有羰基之故（肖崇厚，１９９７）。黄酮类化合物是植物代谢过程中产生的一类重要天然有机化合物，３０年来一直是国内外研究开发的热点（张鞍灵等，２０００）。黄酮类化合物广泛存在于双子叶植物及裸子植物中，是～类重要的天然有机化合物。黄酮类化合物的存在形式既有与糖结合成苷的，也有游离体。黄酮类化合物生理活性多种多样，引起了国内外的广泛重视，研究进展很快。目前已分离出的黄酮类化合物总数超过５０００个，广泛应用于医药领域（刘森，２００４；ＨｏｗａｒｄＭａｒｋｅｔａ１．．２０００）。华中农业人学２００８届硕Ｉｊ学位论文２．１黄酮类化合物的结构和分类黄酮类化合物一般是具有二个苯环（Ａ．环Ｂ．环）通过中央三碳链（Ｃ．链）相互连接而成的Ｃ６．Ｃ３．Ｃ６基本碳骨架的一系列化合物。依据三碳链的氧化程度和是否成环以及Ｂ．环的连接位置（２．或３．位）可将主要的天然黄酮类化合物分类（刘森，２００４）。主要有黄酮、黄酮醇、黄烷酮、黄烷醇、黄烷双醇、二氢黄酮醇、花青素和异黄酮等。其中以黄烷醇、黄酮醇和花青素三大类分布最为广泛，含量最为丰富。黄酮类化合物主要是指以２．苯基色原酮为母核的化合物，其基本结构为：嗒间蹲ｐ噶ｂ黄酮类（Ｆｌａｖｏｎｅｓ）节咖妒双黄酮类（Ｆｌａｖｏｎｏｎｅｓ）双氢黄酮（Ｆｌａｖａｎｏｎｅｓ）双氢黄酮醉类（Ｆｌａｖａｎｏｎ０１）异黄酮类（Ｉｓｏｆｌａｖｏｎｅ）异双氢黄酮．（Ｉｓｏｆｌａｖａｎｏｎｅｓ）天然的黄酮类物质多是其基本结构的衍生物，而且多以糖苷形式存在，除常见的糖苷外，还有Ｃ．苷，如葛根黄素等，其糖链中常见的糖有Ｄ一葡萄糖、Ｌ．鼠李糖、Ｄ一半乳糖、Ｄ．葡萄糖醛酸、芸香糖、龙胆二糖、龙胆三糖等。由于糖的种类不同，连接位置不同，苷元不同，可形成各种各样的黄酮苷。在植物体中，黄酮类化合物因其所在组织不同，其存在状念也不尽相同。２．２黄酮类化合物的生理活性黄酮类化合物不仅种类繁多，而且结构复杂，多数具有显著生理药理活性。２．２．１抗自由基及抗氧化作用自由基与人的病理（心脏病、糖尿病、肿瘤、动脉粥样硬化、类风湿等）、生理（衰老）有密切关系。生物体内常见的自由基有超氧自由基、羟基自由基、烷氧自由基。自由基性质活泼，有极强的氧化能力，对人体能造成极大危害，在４艾菡竹舀日的提取分离刍Ｕ化、结构搽定及］Ｃ抗瓴化件研究体内自由基和脂质过氧化作用下能使大分子成分发生氧化变性、交联和断裂，导致细胞结构改变，从而引起癌症、衰老及心血管等退变性疾病（ＲｉｃｅＥｖａｎｓＣ，１９９８）黄酮类化合物有很好的清除自由基和抗氧化能力，对防止疾病以及人的健康有积极的意义（ＭａｒｉａＰＧｅｔａ１．，２００２）。黄酮化合物具有很好的清除自由基和抗氧化能力，能阻止自由基在体内的产生。其作用机理包括与Ｏ：一反应阻止自由基引发连锁反应；与金属离子螯合阻断自由基的生成，与脂质过氧化基Ｒ００·反应阻断脂质过氧化过程（杨青，２００４）。２．２．２对心血管系统的作用黄酮类化合物对心血管疾病的预防和治疗主要是基于对低密度脂蛋白ＬＤＬ氧化的防止作用（谢作权等，２００７）。具有扩张血管，防止低密度脂蛋白氧化作用，并对主动脉内皮细胞腺苷脱氨酶有抑制作用，可用于防止由高血压引起的头痛、头晕、耳呜等症状；具有变时性调节心肌收缩的作用，改善心肌舒张功能、对抗垂体后叶素引起心肌缺血、缩小因结扎冠状动脉而引起的心肌梗塞、提高机体在常压与低压下的耐缺氧能力、对抗各种因子造成的心律失常，可用于治疗心律失常、心绞痛、心肌梗塞等症（唐传核等，２００２）。２．２．３抗肿瘤、抗癌作用黄酮类化合物有较强的抗病毒、抗肿瘤作用。其作用可通过三种途径：抗自由基、直接抑制癌细胞生长和对抗致癌促癌因子（ＢｉｎｇＴｉａｎｅｔａ１．，２００７）。致癌因子使体内产生自由基，并以自由基的形式富集于脂质细胞膜的周围，引起脂质过氧化，破坏细胞的而致癌，黄酮类化合物是自由基碎灭剂和抗氧化剂，能有效阻止脂质过氧化引起的细胞破坏，起到抗癌、防癌的作用。许多黄酮类化合物具有抑制肿瘤细胞糖酵解、生长、线粒体琥珀酸氧化酶活性和磷脂酞肌醇激酶活性的功能，起到抗癌、防癌的作用。２．２．４抗衰老作用细胞老化是机体老化的基础，生物膜在细胞老化过程中起着重要的作用，若红细胞膜受到损伤，必然会引起膜抗氧化能力降低，自由基清除能力减退，体内ＳＯＤ活力降低，免疫功能下降，氧化产物丙二醛（ＭＤＡ）含量增加，进而导致５华中农业人学２００８届坝Ｉｊ学位论义衰老。黄酮类化合物可提高ＳＯＤ活性，减少体内ＭＤＡ含量，延缓衰老进程，提高生命力及生存等能力能增强神经细胞活力，减少乳酸脱氢酶（ＬＤＨ）释放，减轻细胞核形念的改变和的断裂，对神经细胞凋亡有抑制作用。甘草总黄酮可以增强脾虚衰老小鼠活性，减少体内含量，延缓衰老进程，提高生命力及生存等能力（叶怀义等，２００４）。２．２．５抑菌、抗病毒作用黄酮类化合物具有抑菌、抗病毒作用，如银含叶黄酮、槲皮素、桑色素、山奈酚等均有抑菌和抗病毒作用。（许丽旋，２００６）２．２．６其它作用黄酮类化合物还具有止咳、祛痰、镇痛、提高记忆力、抑制血小板聚集、抗骨质舒松、抗心律失常、抗过敏及抗缺氧等多种药理及保健作用。２．３黄酮类化合物的应用２．３．１天然抗氧化剂黄酮类化合物作为合成抗氧剂（如ＢＨＴ，ＢＨＡ等）的代用品具有高效、低毒、价廉、易得的优点，同益受到重视。中草药和茶叶是获取黄酮类抗氧剂的潜在资源。茶多酚中主成分为儿茶素类衍生物，约占其总量的６０％一８０％。其抗氧化能力优于ＢＨＴ或Ｑ一生育酚，是ＢＨＡ的２．４倍。像毒叶素、佛提素、圣草酚、橙皮苷、橙皮素、栋精、芸香苷等，在食品中都有较强的抗氧化保鲜作用。黄酮类化合物均具有不同程度的抗氧化作用，可以代替合成的抗氧化剂。国外近年非常重视黄酮类化合物作为食品添加剂的开发研制，己丌发出添加有黄酮类化合物的可乐型饮料、口香糖、面包、啤酒等，这类食品口感好，易保存不用另加保鲜剂，并具有一定抑菌、杀菌等明显功效。２．３．２食用色素一些合成色素都有不同程度的毒性，其应用受到一定限制，因而，从自然界寻找合成色素的代用品一天然食用色素的研究倍受各国重视。黄酮类化合物多呈黄色，同时又具有很宽的溶解特性，既有水溶性的黄酮类化合物，又有脂溶性的６艾简扶舀日的提取分离乡Ｕ化、结构裕定及１ｅ抗瓶化性研究黄酮类化合物，所以完全可以据食品加上的需要而选择合适的黄酮类化合物作为着色剂。已获准使用的主要有花青素和查尔酮类。含花青甙的食用色素有：杜鹃花科越桔红色素，锦葵科玫瑰茄红色素，葡萄科葡萄皮色素，忍冬科蓝锭果红色素，蔷薇科火棘红色素，唇形科紫苏色素；查尔酮甙为主的有来自菊科的红花黄色素，菊花黄色素等。２．３．３甜味剂戴启广等（２００４）研究二氢查尔酮衍生物艾蒿甙二氢查尔酮和新橙皮甙二氢查尔酮甜度分别是蔗糖的１００倍和１５００倍，且这两种甜味剂回味均无苦味，可广泛应用于各种食品中。２．３．４天然风味增强剂有些黄酮类化合物具有增强食品风味的作用，如艾蒿苷虽具有苦味，但用在饮料以及高级糖果中却具有增强风味的作用。如柑橘汁中的橘皮苷是其特征的黄酮化合物，用其可以鉴别外观和风味类似的橘汁的伪劣产品。２．３．５保健食品黄酮类化合物具有保健功能，且己丌发出多种保健食品，如利用富含黄酮类化合物的养麦，就生产出苦荞营养粉、糖尿病食疗粉、苦荞茶等十几种保健产品。从法国桦树皮和葡萄籽中提取的总黄酮制成食用保健品“碧萝藏”已被美国ＦＤＡ认可，内用称之为“类维生素”或抗自由基营养素，外用称之为“皮肤维生素”（龚盛昭，２００２）。大豆异黄酮还可以有效地抑制结肠癌、肺癌和胃癌等的发生（黄文哲等，２００３；黄和胜等，２０００）。２．４黄酮类化合物的提取方法２．４．１水提取法水提法仅限于提取黄酮苷类物质，所以对黄酮苷类物质含量较高的原料，可以采取热水提取法。此工艺成本低，安全，适合工业化大生产。但由于水的极性大，易把蛋白质、糖类等溶于水的成分浸提出来，给进一步分离带来许多麻烦。但是因为消耗溶剂的成本比其他方法低，设备简单，仍为一种可取的提取方法。７ｆ仁中农业人学２００８届硕Ｉ：学位论文２．４．２有机溶剂提取法这是目前国内外使用最广泛的方法，很容易实现工业化生产。常用的有机溶剂有甲醇、乙醇、乙酸乙酯、乙醚、丙酮等。由于甲醇、丙酮等毒性较大，因此有机溶剂提取法中最常采用乙醇作为萃取剂。本法主要用于提取脂溶性基团占优势的黄酮类化合物，对设备要求简单，产品得率高，但成本较高，杂质含量也较高。在提取过程中，乙醇的浓度对黄酮类化合物的提取有较大影响，高体积浓度的醇如（９０％～９５％）适于提取甙元，体积浓度６０％左右的醇适于提取甙类（高金燕等，２００４）。２．４．３超声波辅助提取法这是目前比较新的方法，将提取原料浸泡在提取溶剂中，置于超声水浴锅中。它的原理是，超声的空化作用对细胞膜的破坏有助于黄酮类化合物的释放与溶出，超声波使提取液不断震荡，有助于溶质扩散，同时超声波的热效应使水温基本在５７℃，对原料有水浴作用。因此，超声波法大大缩短了提取时间，提高了有效成分的提出率，原料的利用率（李胜华等，２００８）。２．４．４微波法辅助提取法目ｆ；ｉ『应用越来越广泛。将原料与提取溶剂混匀，置于微波专用杯中，微波法在提取过程中具有反应高效性和强选择性等特点，而且操作简便，副产物少，产率高及产物易提纯等优点。本法多用在药材的浸出上，它的原理是利用磁控管所产生的每秒２４．５亿次超高频率的快速震动，使药材内分子间相互碰撞、挤压，这样有利于药材有效成分的浸出。浸出过程中药材细粉不凝聚，不糊化，克服了热水法易凝聚易糊化的不足（范志刚等，２０００；权美平，２００８）。２．４．５超临界萃取法超临界ＣＯ：萃取技术是９０年代国际最新的高科技项目，它是以液态Ｃ０：为溶剂进行提取的，是一种不同与传统黄酮类物质提取的新上艺，它的提取率与提取温度、提取压力、Ｃ０：消耗量等因素有关。它既有与气体相当的高渗透能力和低的粘度，又具有与液体相近的密度和对物质优良的溶解能力。该技术的主要特点是提取率高、产品不含有害物质、无污染。由于黄酮类化合物在超临界流体Ｃ０２艾．苗黄舀日的提取分离纯化、结构举定及）ｅ抗氧化件研究中的溶解度极低，需要在高压力下爿‘能被溶解。因此对于在超临界流体中溶解度很小的溶质，需要在超临界流体系统中加入少量的央带剂来改变超临界流体系统的相行为，以达到大大增大其溶解度的目的（高荫瑜等，２００２）。２．５黄酮类化合物的分离纯化方法在黄酮类化合物提取后，其中杂质仍然很多。需通过用各种纯化方法将其纯化从而得到高纯度的产品。黄酮类化合物的分离纯方法很多，有柱层析、薄层层析、铅盐沉淀、硼酸络合、ｐＨ梯度萃取、溶剂萃取以及近年柬应用的高效液相色谱（ＨＰＬＣ）、液滴逆流层析（ＤＣＣＣ），气相层析、微乳薄层色谱、胶束动电毛细管电泳（ＭＥＫＣ）法等（姚新生，２００６；刘成梅等，２００３；谭仁祥，２００２；安银岭，１９９６；施顺清，２００２）。现将较常用的分离方法综述如下。黄酮甙类的分离方法主要有各种柱层析法、ＨＰＬＣ法、离心薄层层析法、制备性薄层层析法和纸层析法等。２．５．１柱层析法聚酞胺柱色谱法：对分离黄酮类化合物来说，聚酞胺是较为理想的吸附剂。聚酸胺是通过分子中的酞胺基与黄酮类化合物分子上的羟基形成氢键缔合而产生吸附作用，吸附强度主要取决于黄酮类化合物分子中羟基的数目与位置及溶剂与黄酮类化合物或与聚酞胺之间形成氢键缔合能力的大小。但是聚酞胺柱色谱法往往存在流速较慢及一些低分子杂质混入，树脂有时会有酸胺基单体脱落，而酞胺单体是有毒的，因此在某些天然产物分离纯化中就不能采用（肖崇厚，１９９７）。硅胶吸附柱色谱法：遵循“相似者易于吸附”的原理，对极性物质有较强的亲和能力。此法应用范围较广，主要适用于分离异黄酮、二氢黄酮、二氢黄酮醇及高度甲基化的黄酮及黄酮醇类。少数情况下，在加水去活化后也用于分离极性较大的化合物，如多羟基黄酮醇及其苷类等。凝胶柱色谱法：对于黄酮类化合物的分离，主要用两种型号的凝胶Ｓｅｐｈａｄｅ—Ｇ和Ｓｅｐｈａｄｅｘ—ＬＨ２０型（姚新生，２００６）。用凝胶分离黄酮类化合物的机理是：分离游离黄酮时，主要靠吸附作用。凝胶对黄酮类化合物的吸附程度取决于游离羟基的数目。但分离黄酮苷时，则分子筛的性质起主导作用。在沈脱时，黄酮苷类大体上是按分子量由大到小的顺序流出柱体。李教社等人用此法从蜜蒙９·仁中农业人学２００８屙颂Ｉ：学位论义花中分离得到３个黄酮甙类化合物（李教社等，１９９６）。２．５．２制备型ＨＰＬＣ分离法应用ＨＰＬＣ法分离黄酮甙类化合物的报道较多（余丽娟等，２００３；陈玉武等，１９９７）。邬安珍（１９９３）等人对１８种黄酮及黄酮甙类化合物在Ｃ。、Ｃ胁和ＣＮ３种固定相上的梯度沈脱、ＲＰ－ＨＰＬＣ法分离做了研究，结果表明，Ｃ．。柱基本可以对植物黄酮甙元和配基实现分离，但它对极性大的甙部分沈脱出峰慢，总洗脱时间增长和分离效果不太理想，而Ｃ。填料极性介于Ｃｍ和ＣＮ二者之间，因而对黄酮甙类的分离比较理想，峰形和分离度也最好。２．５．３大孔吸附树脂分离法大孔吸附树脂一般为白色球形颗粒状，通常将大孔吸附树脂分为极性与非极性两类。因其理化性质稳定，不溶于酸、碱及有机溶剂中，所以在天然化合物的分离与富集工作中被广泛应用。对有机物选择性好，不受无机盐等离子及低分子化合物的影响。大孔树脂广泛应用于天然产物的分离、纯化的研究，近年来对黄酮分离的应用研究更加广泛（胡军等，２００２）。向大雄等研究大孔吸附树脂分离纯化葛根总黄酮的工艺，为葛根总黄酮的工业化生产提供试验依据（向大雄等，２００３）。２．６黄酮类化合物的分析方法２．６．１比色法利用黄酮与铝络合，形成稳定的络合物，根据其所产生的特征吸收光谱而进行测定。但是该分析方法具有一定的局限性，只有当黄酮母核上３位或５位上的．Ｈ被．ＯＨ取代时，或在Ｂ环上有任何相邻的双羟基，才会产生络合作用而与金属离子形成络合物（Ｓａｎｅｒｆｉｅｌｄｅｔａ１．，２００１）。常用比色法有紫外分光光度法、荧光光度法。揭金阶（２００６）以槲皮素为标准品，采用荧光光度法对罗布麻叶提取物中主要成分黄酮类化合物的含量进行测定。此法操作简便，灵敏度高，重现性好。徐燕（１９９７）等人以黄芩苷为对照品，采用紫外分光光度法测定黄芩总黄酮含量，测定波长为２７８ｎｍ，参照波长为２４２ｎｍ。１０艾。苗赞酮的提取分离乡ｂ化、结构攉定及ＪＣ抗瓴化性研究２．６．２平面色谱法平面色谱法是色谱的一种。包括在纸上进行的纸色谱法和在薄层板上进行的薄层色谱法。由于纸色谱法的选择性和重现性较差，多用于定性分析（Ｃｕｙｃｋｅｎｓｅｔａ１．，２００１）。杨志学等（２００６）用纸色谱法定性对马蹄莲根、茎、叶三个部位的成分进行分析研究，得知马蹄莲的主要有效成分为生物碱、黄酮。马柏林等（２００１）以十二烷基硫酸钠（（ＳＤＳ）／正丁醇／正庚烷／水微乳液作为展丌剂，以ＡＬＣＬｓ乙醇溶液为显色剂，在波长３６５ｎｍ紫外灯下检视杜仲所含黄酮。２．６．３ＨＰＬＣ法高效液相色谱（ＨｉｇｈｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅＬｉｑｕｉｄＣｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ．ＨＰＬＣ）法具有分离效率高、分析速度快、检测灵敏度高的特点；并且适应于高沸点、大分子、强极性和热稳定性差的化合物的分离分析。高效液相色谱法是测定黄酮类化合物的有效方法，可以直接分析黄酮苷的含量，也可以通过水解后分析黄酮苷元含量，再通过转化系数求得黄酮总含量（彭友元等，２００３；陈在新等，２００３）。高效液相色谱法已广泛用于天然产物的分析，成为中草药、食品化学成分或功能因子的纯度鉴定，含量测定和质量监控的常用手段。２．６．４色谱．质谱连用法色谱．质谱联用方法分离效率高、分辨能力强、灵敏度高、分析速度快、定量的同时还可以对每种成分的结构进行解释。目自订与质谱联用的主要有ＧＣ、ＨＰＬＣ等（Ｗａｒｉｄｅｌｅｔａ１．，２００１）。张淑芬（２００２）等人利用液相色谱．大气压化学电离化质谱（ＬＣ．ＡＰＣＩ．ＭＳ）联用技术定性分析了３种柑桔果皮中多甲氧基黄酮的主要成分，并结合紫外吸收光谱进一步验证。３本课题研究的目的及意义从艾蒿中分离出纯度高的黄酮类化合物，并通过动物试验鉴定，分离出具有的生物活性黄酮类化合物，不但在医药和食品行业有广阔的应用自订景，而且也可为我国丰富的艾蒿资源的开发和利用提供一条新途径。艾蒿是一种纯天然、绿色、野生的可食用中草药。因其潜在的营养价值、药用价值和商用价值，所以具有广阔的国内外市场。进一步丌发艾蒿保健品，其附华中农业人学２００８届顾Ｉｊ学位论文加值更高，因而具有广阔的开发利用前景。国内外一些具有远见卓识的科研人员，早己看中艾蒿的美好日ｉ『景，进行深入研究和丌发并己获得可喜的成果。进一步丌发利用艾蒿资源，一方面改进现有加工产品的生产工艺，使之更加科学化、高效化和产业化，创造出更大的经济效益：另一方面进一步做好艾蒿的深加工研究工作，丌发出符合人们需要的功能食品、保健食品、营养滋补品和药品等系列产品，使特种资源变成经济优势，其自｛『景将更加广阔。１２艾蒿黄酮的提取分离乡Ｕ化、结构搭定及ｊＩ抗钒化件研究第二章艾蒿化学成分的分析有关艾蒿化学成分的研究，国内外曾有大量的报道（王新芳等，２００６：ＳｅｏＪｅｏｎｇＭｉｎｅｔａ１．，２００３）。以前的研究多集中注意其挥发油、维生素、三萜类等成分，对艾蒿中黄酮的研究报道较少。本研究首先测定分析了湖北武汉狮子山所产艾蒿地上部分的挥发油、蛋白质、总糖、总酸、总多酚、总黄酮等主要营养成分的含量，旨在确定该品种的艾蒿是否可以作为本课题研究的实验材料。１材料与方法１．１材料、试剂与仪器１．１．１材料艾蒿：ＡｒｔｅｍｉｓｉａａｒｇｙｉＬ６ｖ１．ｅｔＶａｎｔ，产于湖北武汉狮子山。１．１．２主要试剂石油醚分析纯天津化学试剂有限公司硫酸铜分析纯上海科昌精细化学品公司浓硫酸分析纯信阳市化学试剂厂氢氧化钠分析纯天津市风船化学试剂科技有限公司硼酸分析纯武汉市中南化学试剂厂甲基红分析纯沈阳市试剂三厂溴甲酚绿分析纯上海试剂三厂盐酸分析纯信阳市化学试剂厂乙醇分析纯上海振兴化工一厂甲醇分析纯上海振兴化工一厂丙酮分析纯天津化学试剂有限公司碳酸钠分析纯重庆北碚化学试剂厂钨酸钠分析纯天津化学试剂四厂铝酸钠分析纯上海胶体化工厂溴水分析纯成都市科龙化工试剂厂华中农业人学２００８届硕Ｉｊ学位论义硫酸锂磷酸无水硫酸钠芦丁１．１．３主要仪器分析天平电子天平１０１．２型干燥箱分析纯分析纯分析纯标品重庆福斯达化工有限公司上海光铧科技有限公司沈阳市试剂三厂中国药品生物制品检定所ＳａｒｔｏｒｉｕｓＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓＬｔｄ．，Ｇｅｒｍａｎｙ北京赛多利斯天平有限公司上海市实验仪器总厂上海分析仪器总厂Ｂｅｃｋｍａｎ．ＧｅｒｍａｎｙＭａｄｅｉｎ紫外光栅分光光度计７５２型①７０ｐＨＭｅｔｅｒＨｅｉｄｏｌｐｈ旋转蒸发器ＸＬ．１型箱式高温炉电热套挥发油提取器Ｇｅｒｍａｎｙ河南省鹤壁市热工仪表厂上海予华仪器有限公司上海岚虹玻璃仪器有限公司１．２实验方法１．２．１新鲜艾蒿（取生长于地上部分）中水分含量的测定准确称耿每份样品２．５００９，采用１０５。Ｃ干燥恒重法测定（食品分析，１．２．２新鲜艾蒿中灰分含量的测定准确称取每份样品２．５００９，采用５２５℃干燥恒重法测定（食品分析，２００２）。１．２．３新鲜艾蒿中蛋白质含量的测定准确称取每份样品２．０００９，采用微量凯氏定氮法测定（食品分析，２００２）。１．２．４新鲜艾蒿中总酸含量的测定准确称取每份样品１０．０００９，采用酸碱滴定法测定（食品分析，２００２）。１．２．５新鲜艾蒿中总糖含量的测定准确称取每份样品５．０００９，采用比色法测定（食品分析，２００２）。１４２００２）。艾蔷趟酮的提耿分离纯化、结构雅定及ｊＣ抗钒化件研究１．２．６干燥艾蒿中总黄酮含量的测定（刘志勤等，２００４）１．２．６．１标准曲线的制备精确称取芦丁标准品Ｏ．０２０９，用９５％乙醇超声溶解，并定容于１００ｍＬ容量瓶中。准确吸取标准品溶液０．０、１．０、２．０、３．０、４．０、５．０、６．０ｍＬ，分别置于２５ｍＬ比色管中，加３０％乙醇至６ｍＬ，加入ｌｍＬ５％的ＮａＮ０２，摇匀后静置６ｍｉｎ，再加入ｌｍＬｌＯ％的ＡＬ（Ｎ０３）３，摇匀后静置６ｍｉｎ，再加入１０ｍＬ４％的ＮａＯＨ，加水至２５ｍＬ摇匀后静置１５ｍｉｎ，以第一支试管溶液为空白，用１ｃｍ比色皿，在５１０ｎｍ下分别测定不同浓度的芦丁的吸光度。即得标准曲线吸光度Ｙ和浓度Ｘ的关系式：Ｙ＝０．４４６Ｘ－－０．０１０５，Ｒ＝０．９９９９。１．２．６．２样品的测定取ｌｍＬ提取后的试液按１．２．６．１的方法测定样品的吸光度Ｙ，由标准曲线计算总黄酮浓度。１．２．７干燥艾蒿中总多酚含量的测定采用Ｆｏｌｉｎｆｅｎ—Ｃｉｏｃａｌｔｅａｕ法测定干燥艾叶中总多酚的含量（Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ１９６５）。１．２．７．１配制试剂配制Ｆｏｌｉｎｆｅｎ．Ｃｉｏｃａｌｔｅａｕ试剂和２０％饱和碳酸钠溶液。１．２．７．２标准曲线制作用ｌＯｍＬ乙醇溶解０．５００９没食子酸，定容至ｌＯＯｍＬ，分别移取Ｏ、１．０、２．０、３．０、５．０、１０．ＯｍＬ到ｌＯＯｍＬ容量瓶中，用水定容。这些溶液可以分别表示为Ｏ、５０、１００、１５０、２５０、５００ｍｇ／Ｌ（没食子酸）。从上述不同浓度的标准溶液中分别移取１．０ｍＬ加入到１００ｍＬ容量瓶中，再分别加入６０ｍＬ去离子水，混合；加入５ｍＬＦｏｌｉｎｆｅｎ．Ｃｉｏｃａｌｔｅａｕ试剂，混合；在０．５．８ｍｉｎ内，加入１５ｍＬ２０％碳酸钠溶液，混合，定容。将上述标准溶液在２０℃下放置２ｈ后，在７６５ｎｍ波长下测定吸光值。测定的标准曲线回归方程为：ｙ＝０．００１１ｘ＋０．０１６８．Ｒ２＝Ｏ．９９９５ＶＬｅｔａ１．，ｖ：７６５ｎｍ处所测Ａｂｓ；ｘ：所测样品溶液的总多酚浓度（ｒｎｇ／Ｌ）。华中农业人学２００８届坝Ｉｊ学位论文１．２．７．３样品中总酚含量的测定取０．２ｍＬ样品溶液，加入１２ｍＬ水、ｌｍＬＦＣ试剂，静置８ｍｉｎ，加入３ｍＬ２０％碳酸钠溶液，加水定容至２０ｍＬ，摇荡，静置２ｈ，在７６５ｎｍ处比色。按照上述标准曲线测定方法，测定其吸光值，并计算样品中总酚含量。总酚含量＝ＣｘＶｘｎ／（Ｗｘ１０００）ｘ１００％Ｃ：总多酚浓度，ｍｇ／Ｌ；Ｖ：溶液体积，ｍＬ；ｎ：稀释倍数；Ｗ：取样量，ｍｇ。１．２．８干燥艾蒿中挥发油含量的测定取５０９的艾蒿粉末，加入２００ｍＬ水浸泡ｌＯｂ，连接挥发油提取器，采用常规共水蒸馏法回流提取５ｈ，收集挥发油，置冰箱中冷藏。最终提取挥发油的收油率约为０．５７％。挥发油为黄褐色透明油状物，具有浓郁香味。２结果与分析表２－１艾蒿中主要化学成分含量测定结果Ｔａｂｌｅｔ２－１Ａｎａｌｙｓｉｓｏｆｍａｉｎｎｕｔｒｉｔｉｏｎｅｌｅｍｅｎｔｓａｎｄｆｌａｖｏｎｏｉｄｐｅｒｃｅｎｔ３结论湖北武汉狮子山所产艾蒿黄酮含量较高，有较高的研究价值，所以确定为实验材料。１６艾筒黄召日的提取分离乡Ｕ化、结构豁定及）ｅ抗瓴化件研究第三章艾蒿黄酮的提取、分离、纯化艾蒿为临床常用中药，对高血压、冠心病及高血脂症等具有防治作用，黄酮类成分为其主要活性部位。本论文对艾蒿总黄酮的提取工艺、分离纯化进行了研究，以期为艾蒿总黄酮深度丌发奠定一定的基础。１材料与方法１．１材料１．１．１实验材料艾蒿：产于湖北武汉狮子山。自然风干，制成粉术密闭低温保存备用。大孔树脂：ＡＤＳ．１７型，天津市海光化工有限公司；Ｄ．１０１、ＡＢ．８大孔树脂均为南开大学化工厂产品；芦丁对照品，纯度＞９９％，中国药品生物制品检定所）；ＳｅｐｈａｄｅｘＬＨ．２０，Ｓｉｇｍａ。１．１．２化学试剂盐酸乙醇正丁醇ＮａＯＨ分析纯分析纯分析纯分析纯分析纯分析纯标品分析纯分析纯信阳市化学试剂厂上海振兴化工一厂天津市化学试剂二厂天津市风船化学试剂科技有限公司上海恒利精细化工有限公司沈阳试剂一厂中国药品生物制品检定所上海虹光化工厂天津化学试剂有限公司乙酸乙酯亚硝酸钠芦丁硝酸铝石油醚１．１．３主要仪器１０１．２型干燥箱分析天平电子天平上海市实验仪器总厂ＳａｒｔｏｒｉｕｓＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓＬｔｄ．，Ｇｅｒｍａｎｙ北京赛多利斯天平有限公司１７。仁中农业人学２００８届硕ｌ：学位论文８１８型Ｐｈ计７５２型紫外光栅分光光度计ｍ７０ｐＨＭｅｔｅｒＯＲＯＩＮＯＲｅｓｅａｒｃｈ，Ｉｎｃ上海分析仪器总厂Ｂｅｃｋｍａｎ，ＧｅｒｍａｎｙＭａｄｅｉｎＨｅｉｄｏｌｐｈ旋转蒸发器恒温水浴锅Ｇｅｒｍａｎｙ浙江检测仪表厂１．２试验方法１．２．１测定方法艾蒿黄酮（ＦｌａｖｏｎｏｉｄｓｏｆＡｒｔｅｍｉｓｉａａｒｇｙｉ，简称ＦＡ）含量的测定：采用硝酸铝－亚硝酸钠．氢氧化钠比色法分析（刘志勤等，２００４）。１．２．２艾蒿黄酮的单因素试验１．２．２．１乙醇浓度对提取的影响准确称取干燥艾蒿粉术样品１．０００９，料液比为１：１５，在７０＂Ｃ条件下提取一次，提取时间为１８０分钟，乙醇浓度分别为５０％、６０％、７０％、８０％、９０％。过滤，滤液用相应浓度的乙醇定容至１００ｍＬ，吸取１．０ｍＬ，此溶液即为样品溶液。１．２．２．２料液比对提取的影响准确称取干燥艾蒿粉术样品１．０００９，用６０％的乙醇，在７０℃条件下提取一次，提取时间为１８０分钟，料液比分别为１：１０、１：１５、１：２０、１：２５、１：３０、１：３５，。过滤，滤液用６０％的乙醇定容至１００ｍＬ，吸取１．０ｍＬ，此溶液即为样品溶液。１．２．２．３时间对提取的影响准确称取干燥艾蒿粉末样品１．０００９，用６０％的乙醇，料液比为１：１５，在７０℃条件下提取一次，提取时间分别为６０、１２０、１８０、２４０、３００分钟。过滤，滤液用６０％的乙醇定容至ｌＯＯｍＬ，吸取１．０ｍＬ，此溶液即为样品溶液。１．２．２．４温度对提取的影响准确称取干燥艾蒿粉末样品１．０００９，用６０％的乙醇，料液比为１：１５，提取时间为１８０分钟。提取温度分别为４０、５０、６０、７０、８０℃。过滤，滤液用６０％的乙醇定容至１００ｍＬ，吸取１．０ｍＬ，此溶液即为样品溶液。艾．苗黄酬的提取分离纯化、结构貉定发ｊｅ抗钣化件：｜｛Ｊｆ究１．２．２．５提取次数对提取的影响准确称取干燥艾蒿粉术样品１．０００９，用６０％的乙醇，在８０＂Ｃ条件下提取，每次提取时间为９０分钟。提取次数分别为１、２、３、４、５次。过滤，滤液用６０％的乙醇定容至１００ｍＬ，吸取１．０ｍＬ，此溶液即为样品溶液。１．２．３艾蒿黄酮的正交试验在单因素实验的基础上，选出影响艾蒿黄酮提取率的３个主要因素（提取温度、时间及乙醇浓度）设计正交实验，进行优化组合，考察指标为：艾蒿黄酮提取液的吸光值。表３－１正交试验的因素和水平水平Ｘ１时ｆ司（ｍｉｎ）Ｘ２乙醇浓度（％）Ｘ３温度（℃）１．２．４艾蒿黄酮柱层析分离１．２．４．１艾蒿提取液的制备称取艾蒿干粉３００９，以５７％的乙醇，料液比为１：２０，在７３℃回流浸提３ｈ，抽滤得艾蒿提取液，回收溶剂，浓缩之后的提取液黄酮含量为３７．５６ｍｇ／ｍＬ。１．２．４．２树脂的预处理（张素华等，２００６）将大孔树脂于９５％乙醇中浸泡８ｈ，然后用蒸馏水洗至无乙醇；再用５％ＨＣｌ溶液浸泡３ｈ，用蒸馏水洗至流出水ｐＨ值为中性；然后用５％ＮａＯＨ溶液浸泡３ｈ，用蒸馏水沈至流出水ｐＨ值为中性。每次上样沈脱完毕后，先用２％ＨＣｌ沈至无色及用蒸馏水洗至ｐＨ值为中性；再用２％ＮａＯＨ洗至无色，最后用蒸馏水洗至ｐＨ值为中性。１．２．４．３大孔树脂的筛选（李春美等，２００６）将浓度为３７．５６ｍｇ／ｍＬ的艾蒿提取浓缩液分别通过已预处理好的Ｄ一１０１、ＡＤＳ．１７、ＡＢ．８树脂柱，柱体积为２２ｍＬ，柱长度１２ｃｍ，柱内直径１．３ｃｍ（按树脂体积算）进行动态吸附。用Ｉ％ＦｅＣｌ３检查流出液，待反应呈阳性（检测显色）时，表明有黄酮流出，树脂吸附达到饱和，停止上样，记录上柱量。吸附１小时后，树脂柱先用水沈至无色并用苯酚浓硫酸法检测至无糖，再用９５％乙醇沈脱至沈脱液１９华中农业人学２００８届颂ｌ：学位论文无色为止。将乙醇沈脱液回收、沈脱物冷冻干燥称重、测定总黄酮含量、计算总黄酮回收率。总黄酮吸附量、吸附率、解吸率、总黄酮回收率分别按下列公式计算：总黄酮吸附量Ａ＝（Ｂｏ—Ｂ１）／Ｖ吸附率ＱＩ＝（Ｂｏ－Ｂｉ）／Ｂｏｘｌ００％解吸率Ｑ２＝Ｂ２／（Ｂｏ－ＢＩ）×１００％总黄酮回收率Ｒ＝Ｂ２／Ｂｏｘｌ００％（１）（２）（３）（４）沈下来的黄酮量，ｍｇ；卜湿柱体积，ｍＬｇ１．２．４．４上柱量的确定式中彳——总黄酮吸附量，ｍｇ／ｍＬ；Ｂｏ——上柱总黄酮量，ｍｇ；ＢＩ——被水Ｑｌ——吸附率，％：Ｑ２——解吸率，％；Ｂ２——乙醇沈脱液中黄酮总量，ｍｇ；灭——总黄酮回收率，％。分别取３、４、５、６ｍＬ艾蒿粗提浓缩液，上柱，柱体积为２２ｍＬ，柱长度１２ｃｍ，柱内直径１．３ｃｍ（按树脂体积算）。吸附１４，时后，先用大量蒸馏水淋沈，直到洗脱液无色并用苯酚浓硫酸法检测不出糖为止，然后用９５％的乙醇洗脱至ＦｅＣｌ３检测呈阴性（不显色），收集沈脱液，测洗脱液黄酮含量和回收率。１．２．４．５淋洗条件的确定取４ｍＬ艾蒿粗提浓缩液，．上柱吸附１小时后，分别用ｐＨ为２、３、４、５、６．３（未调节ｐＨ）的蒸馏水淋洗，直到用苯酚浓硫酸检测无糖反应为止，再用９５％的酒精洗脱，直到用１％ＦｅＣｌ３检测不显色为止，收集沈脱液，测沈脱液总黄酮含量和回收率。１．２．４．６洗脱剂乙醇浓度的确定取４ｍＬ艾蒿粗提浓缩液，上柱后用ｐＨ５的蒸馏水淋洗，直到用苯酚浓硫酸检测无糖反应为止，然后分别用３０％、５０％、７０％、９５％的乙醇沈脱，直到用Ｉ％ＦｅＣｌ３检测不显色为止。收集沈脱液，将乙醇沈脱液回收乙醇，分别浓缩，真空冷冻干燥、称重、测定冻干物的黄酮纯度、计算总黄酮回收率。１．２．４．７洗脱液ｐＨ值对ＡＢ．８大孔树脂纯化艾蒿黄酮的影响取４ｍＬ艾蒿粗提浓缩液，上柱后用ｐＨ５的蒸馏水淋洗，直到用苯酚浓硫酸检测无糖反应为止，然后用ｐＨ值分别为２、３、４、５、６．３（未调节）的５０％的乙醇洗脱，直到用Ｉ％ＦｅＣｌ３检测不显色为止。收集洗脱液，将乙醇沈脱液回收乙醇，分２０艾蔷冀酬的提取分离纯化、结构峪定及１ｅ抗钒化件研究别浓缩，真空冷冻干燥、称重、测定冻干物的黄酮纯度、计算总黄酮回收率。１．２．４．８动态洗脱曲线的考察按照上叙确定的吸附沈脱条件，取艾蒿粗提浓缩液上柱、吸附、沈脱（柱体积为２２ｍＬ），每１５ｍＬ收集一管，共收集７管，测每管中沈脱液黄酮量，据此绘制洗脱曲线。１．２．４．９大孑Ｌ树脂重复使用次数的考察按上述确定的吸附、沈脱条件，取艾蒿提取液进行上柱、吸附和洗脱，在同一根树脂柱上重复操作４次，分别计算４次总黄酮吸附率，考察树脂重复使用的效果。总黄酮吸附率按式（５）计算：Ｑ３＝ｉｆ／Ｄ）×１００（５）式中Ｑ３——总黄酮吸附率，％；Ｄ一上样总黄酮量，ｒａｇ；卜－被吸附在树脂柱上的黄酮量，ｍｇ。１．２．５ＡＢ．８大孔树脂制备艾蒿黄酮按照上述１．２．４条件采用相应４倍数的树脂柱，柱长度４８ｃｍ，柱内直径５．２ｃｍ，将艾蒿提取浓缩液经过ＡＢ．８大孔树脂纯化。１．２．６艾蒿黄酮分离纯化１．２．６．１艾蒿黄酮的液相萃取纯化艾蒿黄酮的乙醇提取物称为ＦＡ０。经过大孔树脂纯化的艾蒿黄酮称为ＦＡｌ，取一定量ＦＡｌ溶于少量水，再分别用乙酸乙酯、石油醚、正丁醇萃取分离，乙酸乙酯、石油醚、正丁醇与水的体积比为３：１，反复萃取３次，合并萃取液，将各相真空浓缩、冷冻干燥后即得乙酸乙酯相（ＦＡ２）、乙酸乙酯水相（ＦＡ３）、石油醚相（ＦＡ４）、石油醚水相（ＦＡ５）、正丁醇相（ＦＡ６）、正丁醇水相（ＦＡ７）。１．２．６．２艾蒿黄酮的葡聚糖凝胶纯化用２．３倍柱体积的４０％甲醇预平衡ＳｅｐｈａｄｅｘＬＨ．２０色谱柱（４０ｃｍｘ１．５ｃｍ），称取乙酸乙酉匕＊Ｈ（ＦＡ２）１０ｒａｇ，溶于ｌｍＬ４０％甲醇溶液，上样，用４０％甲醇沈脱，流速ｌｍＬ／ｍｉｎ，多次制备，真空浓缩、冷冻干燥后所得黄酮为ＦＡＳ。２ｌ华中农业人学２００８届顾Ｉ：学位论义２结果与分析２．１单因素试验结果与分析在其它条件一样的条件下，研究了提取温度、提取时间、料液比、提取次数、及提取液浓度对艾蒿黄酮提取效果的影响。２．１．１乙醇浓度对提取效果的影响图３．１乙醇浓度对提取效果的影响Ｆｉｇ．３－１Ｅｆｆｅｃｔｏｆｅｔｈａｎｏｌｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｎｅｘｔｒａｔｉｏｎｒａｔｉｏ由图３．１可以看出，乙醇浓度在５０％到６０％范围内，随着浓度增大，提取率也随之增大，但是６０％以后，提取率又逐渐下降，这是因为黄酮糖苷是由两部分组成，甙元成分不易溶于水，而糖又易溶于水，因此就提取黄酮类化合物，乙醇与水达到最佳比例时，提取率最高，所以选取６０％左右作正交试验。２．１．２温度对提取效果的影响口．４１型米ｏ．３，毯Ｏ．３７４Ｄ∞６０７Ｄ＿Ｄ温度℃图３－２温度对提取效果的影响Ｆｉｇ．３－２Ｅｆｆｅｃｔｏｆｅｘｔｒａｔｉｏｎｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｏｎｅｘｔｒａｔｉｏｎｒａｔｉｏ艾篱战酮的提取分离争Ｕ化、结构裕定及１ｅ抗瓴化忡研究结果如图３．２。随温度的升高，总黄酮提取率呈增加趋势。但是，温度过高时，易造成溶剂的损失，浸提效果反而下降。鉴于总黄酮的热稳定性及溶剂的损失问题，对总黄酮来说，选择提取温度范围为７０。Ｃ左右。２．１．３料液比对提取效果的影响Ｄ．４Ｏ．３５蜊米０．３蓉Ｏ．２５１：１０１：１５１２０１２５１：３０料液比图３－３料液比对提取效果的影响Ｆｉｇ．３－３Ｅｆｆｅｃｔｏｆｒａｔｉｏｓｏｆｓｏｌｉｄｔｏｌｉｑｕｉｄｏｎｅｘｔｒａｔｉｏｎｒａｔｉｏ结果如图３．３。随着溶剂量的增加，总黄酮的提取率逐渐升高，Ｎ２５倍量时基本上达到最高，且与１：２０的总黄酮提取率基本上持平。一般来说，料液比达到一定程度，提取率不会增加很多。但是料液比增加，给后处理工序增加困难，在保证提取效果的同时，应尽量减少溶剂用量和降低蒸发浓缩负荷，因此料液比以１：２０为宜。２．１．４提取时间对提取效果的影响图３－４提取时间对提取效果的影响Ｆｉｇ．３－４Ｅｆｆｅｃｔｏｆｅｘｔｒａｔｉｏｎｔｉｍｅｏｎｅｘｔｒａｔｉｏｎｒａｔｉｏｆ仁中农业人学２００８届坝ｆ：学位论义结果如图３．４。黄酮类化合物的提取率在２ｈ内基本上达到最高，３ｈ以后趋于平缓。时间再延长不利于生产周期，会增加生产成本和消耗，所以选取２～３ｈ作正交试验。２．１．５提取次数对提取效果的影响Ｏ．舶０．相趔米Ｄ．ｄ毯０．５６Ｄ．霓次数图３．５提取次数对提取效果的影响Ｆｉｇ．３—５Ｅｆｆｅｃｔｏｆｔｈｅｎｕｍｂｅｒｏｆｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｏｎｅｘｔｒａｔｉｏｎｒａｔｉｏ从图３－５可以看出，提取次数越多，Ａｂｓ越大，得率越大，但当提取３到４次后，吸光值增加不大，可能是随着提取次数的增加艾蒿中黄酮类物质己基本溶出。考虑到成本，以提取２次为最佳点。２．２中心组合实验结果２．２．１回归方程及方差分析根据Ｂｏｘ．Ｂｅｒｄｍｋｅｎ的中心组合实验设计原理，设计了三因素三水平的响应面分析实验（费荣昌，２００１）。参考单因素实验结果，以时间、乙醇浓度、温度作主要因素。为避丌二次提取时残渣转移的损失所带来的影响，每个组合仍以提取一次的Ａｂｓ计算。中心组合实验方案及结果如图表３．２、３．３所示。以Ａｂｓ为响应值（Ｙ），通过ＳＡＳ软件的ＲＳＲＥＧ程序对实验资料进行响应面分析，经过二次回归拟合后求得响应函数，即回归方程为：Ｙ＝０．４３６０００－０．００１８７５Ｘｉ一０．０１５６２５Ｘ２＋０．００７２５０Ｘ３－０．０２５１２５Ｘｉｚ．０．００６２５０Ｘ２Ｘ１．０．０２３６２５Ｘ２２．０．００７０００Ｘ３Ｘｌ一０．０１５０００Ｘ３Ｘ２．０．０３１３７５Ｘ３２２４艾－酱竹酮的提取分】】ｊ！ｉ鱼Ｌ化、结构搭定及Ｊｅ抗钒化忡研究表３．２正交试验的因素和水平Ｔａｂｌｅ１Ｆａｃｔｏｒｓａｎｄｌｅｖｅｌｏｆｔｈｅｏｒｔｈｏｇｎａｌｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ水平Ｘｌ时间（ｒａｉｎ）Ｘ２乙醇浓度（％）Ｘ３温度（℃）表３－３正交试验设计及试验结果Ｔａｂｌｅ２ｌａｙｏｕｔｏｆｔｈｅｏｒｔｈｏｇｎａｌｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓａｎｄｓｔｕｄｙｒｅｓｕｌｔｓ试验序号Ａ２●２３４５６７８２２２１１３３１１３３２Ｂ１ｌ３３２２２２１３１３２２２冈素Ｃ１３ｌ３１３ｌ３２２２２２２２吸光值０．３６７０．４１８Ｏ．３７４０．３６５０．３７６０．３９８０．３７５０．３６９０．３９７０．３７００．４１７０．３６５０．４３２０．４３９０．４３７９加Ｕ屹＂Ｍ１５２２表３－４回归方程的方差分析结果Ｔａｂｌｅ３－４Ｖａｒｉａｎｃｅａｎａｌｙｓｉｓｒｅｓｕｌｔｓｏｆｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎｅｑｕａｔｉｏｎ方筹米源一次项二次项交互项Ｘｌ平方和０．００２４０２０．００６９８３０．００１２５２０．００２７１１０．００５０７００．００５１５ｌ０．０１０６３７０．０００４７４０．００００２６０．０１１１３７白由度３３平均平方和０．０００８００７０．００２３２７７０．００４１７３３０．０００６７８００．００１２６８０Ｏ．００１２８８００．００１８１８９０．０００１５８００．００００１３０Ｆ８．０１２３．２９４．１８６．７８１２．６８１２．８８１１．８３１２．１５显＃性Ｐ３４４４９ＮＳ●Ｘ２Ｘ３●●●●同归火拟项误差总和注：３２１４ＮＳ·表示Ｐ＜５％水平显著，··表示Ｐ＜１％水平显著，ＮＳ表示不显著由表３－４可以看出，回归方程的一次项在Ｏ．０５水平上显著，二次项在Ｏ．Ｏｌ水平上显著。交互项的Ｆ值不显著，说明因素问的交互作用不大。总回归方程在‘＃中收ｎ＾学２００８Ｒ倒Ｊ学位呛立Ｏ０１水平上显著，说明上述回归方程描述各国素与响应值之间的关系时．其因变量与全体自变量之『ＢＪ的线性关系是显著的，即这种方法是可靠的。失拟项Ｆ值不显著，说明方程对实验拟台较好。温度和乙醇浓度对黄酮提取率的影响在Ｏ水平上显著，提取时阳Ｊ对黄酮提取率的影响在００５水平上显著。２２０１２响应面分析“‰ｚｌｏｍＩ柏刚Ⅻｏ∞ｘ２ａｓ图３．６（Ａ）时间、乙醇浓度对提取的影响响应面图Ｆｉｇ．７Ｒｅｓｐｏｎｓｅｓｕｒｆａｃｅｐｌｏｔｏｆｔｈｅｅｆｆｅｃｔｓｏｆｅｘｔｒａｃｔｉｏｎａｎｄｅｔｈａｎｏｉｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ８ｆｕｎｃｔｉｏｎｏｆｔｉｍｅ。～～：‘～ｉ～：｝图３－６（Ｂ）时间、乙醇浓度对提取的影响等高线圈Ｆｉｇ．３－８Ｃｏｎｔｏｕｒｍａｐｏｆｔｈｅｅｆｆｅｃｔｓｏｆｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｅｔｈａ［１０ｌｃｏｎｃｅｒｔｔｒａｔｉＯａｓａｆｕｎｃｔｉｏｎｏｆｔｉｍｅａｎｄ量＊竹削的攫取；，月｝Ｌ化、结构端２＆』【抗饥化忡ｗ宄ｙ０４知７０４ｌ２ｌ０耍射。”‰ｌ舶ｘｌ８０００订３３Ｉ柏ｌ∞∞０。酣６７ｘ３圉３．７（Ａ）时问、温度对提取的影响响应面图Ｆｉｇ．３－７（Ａ）Ｒｅｓｐｏｎｓｅｓｕｒｆａｃｅｐｌｏｔｏｆｔｈｅｅｆｆｅｃｔｓｏｆｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｆｕｎｃｔｉｏｎｏｆｔｉｍｅａｎｄｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅａｓａ。～：。＿…１÷一。■图３－７（Ｂ）时间、温度对提取的影响等高线图Ｆ蟾３—７（Ｂ）Ｃｏｎｔｏｕｒｍａｐｏｆｔｈｅｅｆｆｅｃｔｓｏｆｅｘｔｒａｃｔｉｏｎａｓａｆｕｎｃｔｉｏｎｏｆｔｉｍｅａｎｄｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ。∞翼Ⅻ船Ｏ冀７０ｊ∞∞加舒盯站图３－８（Ａ）温度、乙醇浓度对提取的影响响应面图Ｆｉｇ．３－８（Ａ）Ｒｅｓｐｏｎｓｅｓｕｒｆａｃｅｐｌｏｔｏｆｔｈｅｅｆｆｅｃｔｓｏｆｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅａｎｄｅｔｈａｎｏｌ２７３５ａｆｕｎｃｔｉｏｎｏｆ·仁中农业人学２００８届硕Ｉｊ学位论义…～呻∞：一’ｅ｝ｅ：一。Ｏ、：∞一０：芷一●５，‘一‘０●ｅＣ＇图３．８（Ｂ）温度、乙醇浓度对提取的影响等高线图Ｆｉｇ．３－８（Ｂ）Ｃｏｎｔｏｕｒｍａｐｏｆｔｈｅｅｆｆｅｃｔｓｏｆｅｘｔｒａｃｔｉｏｎａｓａｆｕｎｃｔｉｏｎｏｆｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅａｎｄｅｔｈａｎｏｌｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ在中心组合实验的基础上，经曲面拟合，由回归方程可以计算出提取的最佳工艺条件为：时间１４９．４７ｍｉｎ，乙醇浓度５６．０４％，温度７２．１２℃。艾蒿黄酮提取率理论值可达８９％。为了检验拟合结果的可靠性，采用上述最佳条件进行验证实验，将最佳提取条件修正为时间１４９ｍｉｎ，乙醇浓度５６％，温度７２℃，料液比ｌ：２０，提取２次。重复３次取平均值，艾蒿黄酮提取率为９１．２％，证明最佳提取条件的可靠性。２．３艾蒿黄酮的纯化２．３．１大子Ｌ树脂的筛选表３．５Ｔａｂｌｅ３－５３种大孔树脂对艾蒿黄酮的吸附分离性能比较ＣｏｍｐａｒｉｓｏｎｏｆａｄｓｏｒｂｉｎｇａｎｄｓｅｐａｒａｔｉｎｇｃａｐａｂｉｌｉｔｙｏｆｓｉｘｔｙｐｅｓｏｆｍａｃｒｏｐｏｒｏｕｓｒｅｓｉｎｏｎＡｒｔｅｍｉｓｉａａｒｇｙｉｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ大孔树脂的吸附性能对黄酮的纯化影响很大，树脂的极性和空间结构（主要艾－篙竹酮的提取分离纯化、结构搭定及１ｅ抗瓴化忡研究指孔径、比表面积及孔容等）是影响吸附性能的重要因素。在所选择的３种大孔树脂中，Ｄ．１０１非极性，ＡＢ．８为弱极性，ＡＤＳ．１７为极性（冯涛等，２００２）。由表３－５可知，ＡＢ．８型大孔树脂分离纯化艾蒿总黄酮效果较好，总黄酮吸附量最高，回收率、吸附率最大，因为黄酮具有多酚结构和糖苷键，显弱极性，因而有利于弱极性树脂的吸附。２．３．２上柱量的确定表３．６不同上柱量对ＡＢ．８大孔树脂分离纯化艾蒿黄酮的影响Ｔａｂｌｅ３－６ＥｆｆｅｃｔｏｆｄｉｆｆｅｒｅｎｔｌｏａｄｅｄａｍｏｕｎｔｏｎｔｈｅｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＡｒｔｅｍｉｓｉａａｒｇｙｉｆｌａｖｏｎｏｉｄｓｂｙｕｓｉｎｇＡＢ一８ｔｙｐｅｒｅｓｉｎ由表３．６可知，柱体积为２２ｍＬ，４ｍＬ时上样达到饱和；上柱量为３ｍＬ时，黄酮回收率最高；但是上柱量４ｍＬ时，洗脱液中黄酮含量最大，回收率只匕Ｌ３ｍＬ略低。考虑到纯化效率，粗提液上样体积以４ｍＬ为宜（郑功源等，２００３）。２．３．３淋洗条件的确定图３．９淋洗液ｐＨ值对艾蒿黄酮纯化效果的影响Ｆｉｇ．３—９ＩｎｆｌｕｅｎｃｅｏｆｐＨｖａｌｕｅｓｏｆｗａｔｅｒｏｎｔｈｅｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＡｒｔｅｍｉｓｉａａｒｇｙｉｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ由图３—９可知水的ｐＨ值对纯化有影响，当ｐＨ值５时总黄酮回收率最高，以ｐＨ值５的水洗效果最好。华中农业人学２００８届硕ｌ：学位论文２．３．４洗脱剂乙醇浓度的确定表３．７乙醇浓度对ＡＢ．８大孔树脂纯化艾蒿黄酮的影响Ｔａｂｌｅ３－７ＥｆｆｅｃｔｏｆｅｔｈａｎｏｌｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｎｔｈｅｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＡｒｔｅｍｉｓｉａａｒｇｙｉｆｌａｖｏｎｏｉｄｓｂｙｕｓｉｎｇＡＢ－８ｔｙｐｅｒｅｓｉｎ由表３．７可知乙醇浓度９５％时，回收率最高，但是乙醇浓度太高，将大部分杂质也沈出来了。乙醇浓度５０％时，冻干物的纯度最高。３０％的乙醇沈脱时，树脂颜色泛黄褐色，流出的黄酮液颜色液很浅，大部分黄酮没有洗下来，其它浓度的乙醇沈脱时均能见到明显的颜色变化。因此洗脱剂乙醇浓度５０％为宜。２．３．５洗脱液ｐＨ值对ＡＢ．８大孑Ｌ树脂纯化艾蒿黄酮的影响表３－８洗脱液ｐＨ值对ＡＢ－８大孔树脂纯化艾蒿黄酮的影响Ｔａｂｌｅ３－８ＥｆｆｅｃｔｏｆｐＨｖａｌｕｅｓｏｆｅｌｕｅｎｔｏｎｔｈｅｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＡｒｔｅｍｉｓｉａａｒｇｙｉｆｉａｖｏｎｏｉｄｓｂｙｕｓｉｎｇＡＢ－８ｔｙｐｅｒｅｓｉｎ由表３－８可以看出ｐＨ４时，黄酮纯度和回收率略高于其它。因此，５０％的乙醇沈脱液最佳ｐＨ值为４（ＢｏｑｉａｎｇＦｕ２．３．６动态洗脱曲线的考察卯如４０３０２０ｅｔａｌ，２００５）。１０００ｌ２３４５６７８体积／１５ｍ１．，图３．１０Ｆｉｇ．３－１０ＥｌｕｅｎｔＡＢ．８大孔树脂洗脱曲线ｏｆＡＢ－８ｔｙｐｅｍａｃｒｏｐｏｒｏｕｓｒｅｓｉｎｃｕｒｖｅ艾筒黄酬的提取分离纯化、结构黪定及ＪＬ抗氧化性研究动态沈脱效果见图３－１０。从沈脱曲线可以看出？４倍柱体积５０％的乙醇就基本可将吸附在树脂上总黄酮沈脱下来，并且曲线出峰快。沈脱液用旋转蒸发器回收乙醇后，冷冻干燥，产品纯度达到６９％。因此，用５倍柱体积５０％乙醇沈脱效果很好（ＹｕｊｉｅＦｕｅｔａ１．，２００７）。２．３．７大子Ｌ树脂重复使用次数的考察表３－９大孔树脂使用次数考察Ｔａｂｌｅ３－９Ｕｓｉｎｇｔｉｍｅｓｏｆｍａｃｒｏｐｏｒｏｕｓｒｅｓｉｎ使川次数吸附率％８３．５７８２．６１８０．９４５３．１２由表３．９可见，树脂重复使用３次后，总黄酮吸附率下降，故ＡＢ．８大孔树脂只宜重复使用３次。２．３．８大孔树脂制备艾蒿黄酮按照上述２．３条件采用相应４倍数的树脂柱，柱长度４８ｃｍ，柱内直径５．２ｃｍ，将１６ｍＬ＇浓度为３７．５６ｍｇ／ｍＬｌ钓ｌ艾蒿提取浓缩液按照上述纯化条件经过ＡＢ一８大孔树脂纯化，产品真空干燥后纯度达６９％。２．４黄酮分离纯化结果与分析表３．１０艾蒿黄酮纯化产物结果分析Ｔａｂｌｅ３—１０ＲｅｓｕｌｔｓａｎｄａｎａｌｙｓｉｓｏｆｒｅｆｉｎｅｄｐｒｏｄｕｃｔｓｏｆＦＡ由表３．１０分析可知，石油醚和Ｊ下丁醇萃取效果不是很好，乙酸乙酯萃取分离ＦＡ的效果十分明显，ＦＡ２黄酮含量达到７８．２８％。ＦＡ２经过葡聚糖凝胶纯化后（ＦＡＳ），黄酮含量达到９９．１６％。牛中农业人学２００８届顾Ｉｊ学位论义３结论１）研究表明，通过以上单因素实验，在中心组合实验基础上，通过响应面分析法得出了提取ＦＡ的最佳工艺组合：时间１４９ｍｉｎ，乙醇浓度５６％，温度７２℃，料液比１：２０，提取２次。在此最佳工艺组合下ＦＡ的平均提取率可达９１．２％。２）ＡＢ．８大孔树脂纯化艾蒿黄酮的最佳条件：（树脂柱长度４８ｃｒｎ：柱内直径５．２ｃｍ；初始上样液黄酮含量为３７．５６ｍｇ／ｍＬ）上样量为１６ｍＬ，淋洗剂为ｐＨ４的蒸馏水，洗脱剂为ｐＨ４的５０％乙醇，洗脱剂用量为５倍柱体积，树脂可以重复使用３次，产品真空干燥后ＦＡｌ纯度达６９．３７％。３）乙酸乙酯相（ＦＡ２）纯度达７８．２８％，得率为２．６４％；ＦＡ２经过葡聚糖凝胶纯化后（ＦＡ８），黄酮含量达到９９．１６％，得率为１．８９％。３２艾蔷赞酮的提取分离纯化、结构峪定及』Ｌ抗瓴化惮研究第四章艾蒿黄酮的结构鉴定本文旨在采用ＵＶ、ＩＲ、ＨＰＬＣ、ＨＰＬＣ．ＥＳＩ／ＭＳ等现代分离检测技术，研究艾蒿黄酮的聚合度，基本组成单元，链的连接方式等结构信息，进而对其进行结果鉴定。１材料与方法１．１材料、试剂与仪器．１．１．１材料材料：艾蒿黄酮（ＦＡ）即第三章所得到的艾蒿黄酮的葡聚糖凝胶纯化物ＦＡＳ。１．１．２主要试剂甲醇、乙酸为色谱纯，其余试剂为国产分析纯，水为去离子水。１．１．３主要仪器ＵＶ－１７００紫外扫描仪ＳＨＩＭＡＤＺＵ‘４７０ＦＴ－ＩＲ同本岛津公司ＴｈｅｒｍｏＮＩＣＯＬＥＴＮＥＸＵＳＶａｒｉａｎＣｏ．，ＵＳＡＡｇｉｌｅｎｔＣｏ．，ＵＳＡＶａｒｉａｎ２３０型高效液相色谱（ＰＤＡ检测器）Ａｇｉｌｅｎｔ１１００系列液质联用仪（ＤＥｌ４９１５０８５ＤＡＤ检测器）１．２实验方法１．２．１艾蒿黄酮的紫外可见光谱分析取一定量的艾蒿黄酮ＦＡＳ样品，用甲醇溶解，浓度为０．０１ｍｇ／ｍＬ，在紫外光谱仪上扫描，扫描波长．（２００ｎｍ．５００ｎｍ）。１．２．２艾蒿黄酮的红外光谱分析艾蒿黄酮与溴化钾按２：１００的比例混合，研磨压片，采用傅立叶变换红外光３３华中农业人学２００８屙硕｛：学位论义谱仪分析。红外光谱条件如下：扫描频率：３２ｔｉｍｅｓ／ｓ，扫描范围：４０００．４００ｃｍ一。１．２．３艾蒿黄酮的ＨＰＬＣ分析采用Ｖａｒｉａｎ２３０型高效液相色谱仪（ＰＤＡ检测器），ＤｉａｍｏｎｓｉｌＣ１８（４．６ｍｉｎｘｌ５０ｍｍｘ５ｕｍ）色谱柱，检测波长３６０ｒｉｍ，柱温２５．０＂Ｃ，进样量１０１．ｔＬ，流速１．０ｍＬ／ｍｉｎ，流动相：Ａ为１％乙酸／水；Ｂ为甲醇。沈脱梯度：０－５ｍｉｎ，２０％．３７％Ｂ：５－２５ｍｉｎ，３７％一５０％Ｂ；２５－３５ｒａｉｎ，５０％一６０％Ｂ；３５—４５ｍｉｎ，６０％．９０％Ｂ：４５．５０ｍｉｎ，９０％Ｂ；５０．５５ｍｉｎ，９０％．２０％Ｂ；５５．６０ｍｉｎ，２０％Ｂ。对ＦＡＳ进行分析，以溶剂Ｂ溶解样品进样（ＭａＹＬｅｔａ１．，２００１１．２．４艾蒿黄酮的ＨＰＬＣ．ＥＳＩ／ＭＳ分析采用Ａｇｌｉｅｎｔ１１００ＳｅｒｉｅｓＬＣ／ＭＳＤＴｒａｐ液质联用色谱仪，配有二元梯度泵，ＺｏｒｂａｘＤＡＤ检测器，柱温箱和自动进样器。ＳＢ．Ｃ１８色谱柱（１５０ｘ２．１ｍｍ，５１ＬＬｍ），流速：０．２ｍＬ／ｍｉｎ，进样量４．０ｕＬ，检测波长３６０ｎｍ。流动相：（Ａ）１％乙酸／水（Ｂ）甲醇（Ｈｕｇｈｅｓｅｔａ１．２００１）。洗脱梯度：０．５ｍｉｎ，２０％．３７％Ｂ；５－２５ｍｉｎ，３７％．５０％Ｂ；２５－３５ｍｉｎ，５０％一６０％Ｂ；３５．４５ｍｉｎ，６０％－９０％Ｂ：４５－５０ｍｉｎ，９０％Ｂ；５０－５５ｍｉｎ，９０％一２０％Ｂ：５５．６０ｍｉｎ，２０％Ｂ。ＥＳＩ方式离子化，采用负离子模式，雾化压力为２０ｐｓｉ，干燥气体的流速为７．００ｍＬ／ｍｉｎ，温度为３２５℃，毛细管电压为４Ｋｖ；扫描范围：１００—１０００ｍ／ｚ（ＪｉａｎＨａｒｔｅｔａ１．，２００７；Ｃｕｙｃｋｅｎｓｅｔａ１．，２００２）。艾筒黄酮的提取分离纯化、结构搭定及Ｊｅ抗氧化忡研究２结果与分析２．１艾蒿黄酮的紫外可见光谱及图谱分析１Ｏ．８０．６Ｏ．４Ｏ．２０２００２５０３００３５０４００４５０５００波长／ｎｍ图４．１艾蒿黄酮（ＦＡＳ）Ｕｖ光谱图Ｆｉｇ．４—１ＵＶｓｐｅｃｔｒｏｇｒａｍｏｆＦＡＳ由图４．１可知，黄酮的紫外光谱中有两个主要的吸收峰组成，其中之一出现在２５０～２８０ｎｍ（峰带ＩＩ），另一个在３４０～３９０ｎｍ（峰带Ｉ）。一般来说，峰带ＩＩ是由Ａ一环苯酰系统引起，而峰带Ｉ是由Ｂ一环肉桂酰系统引起。２．２艾蒿黄酮的红外光谱及图谱分析Ｍ二嚣｜一…………～一…～ｉ～Ｆ…～ｒ＿～ｒ，～，，一，－ｒ…，，ｒ一。，～…Ⅳ。一…，＋一，～，，ｒ＾…¨姗ｌ呻０Ｉｆｅｔ，ｍ＇ａｓｔ／忆ｒｓ（ｔａｔ－１）图４．２艾蒿黄酮ＦＡＳ红外光谱Ｆｉｇ．４·２ＩＲｓｐｅｃｔｒｏｇｒａｍｏｆｓｅｐｈａｄｅｘＬＨ－２０ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｓｏｆＦＡ从特征峰分布的区域来分析，可以断定１７００－－１２００ＣｌＴＩ．１区域的吸收以黄酮３５华中农业人学２００８届顾ｌｊ学位论文类化合物的特征吸收峰为主。黄酮类化合物的特征吸收峰一般出现在１６９７，１６０４，１５２２，１４４６和１２８１ｃｍ．１。１２８１．１３ｅｒｎ。１和１１７４．３４ｃｍ一１吸收峰为Ｃ环中的Ｃ．０一Ｃ伸缩振动；１６０４．３３ｃｍ～，１５２２．０７ｅｒｎ一，１４４６．５１ｃｍ‘１和１３７０．４１ｅｒｎＪ是苯环的骨架振动特征吸收；３４１９．６５ｃｍ。峰为黄酮分子中羟基的伸缩振动。２．３艾蒿黄酮的ＨＰＬＣ，ＨＰＬＣ．ＥＳＩ／ＭＳ分析４０３０≥毫２０１００２０２５Ｍｉｎｕｔｅｓ图４．３ＳｅｐｈａｄｅｘＬＨ－２０纯化物高效液相色谱图Ｆｉｇ．４－３ＨＰＬＣｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍｏｆｓｅｐｈａｄｅｘＬＨ·２０ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｓｏｆＦＡ图４＿４ＦＡＳ总离子流图Ｆｉｇ．４－４ＢＰＣ士ＡＩＩＭＳｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍｏｆｒｅｆ＇ｍｅｄｐｒｏｄｕｃｔｓｏｆＦＡ艾．管黄酬的提取分离纯化、结构搭定及Ｊｅ抗能化十牛研究图４．５１２．６６９ｍｉｎ时对应的一二级质谱图（２号峰）Ｆｉｇ．４－５ＭＳｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍｏｆ１２．６６９ｍｉｎＰｅａｋ图４．６１３．０５０ｍｉｎ时对应的一级质谱图（３号峰）Ｆｉｇ．４－６ＭＳｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍｏｆ１３．０５０ｍｉｎＰｅａｋ由图４．５可知，２号峰紫外光谱在３３０ｎｍ和２４５ｎｍ处有强吸收峰，结果该化合物的苷元可能为５，７，４７一三羟基黄酮；在其负离子一级质谱中出现５６３．２的准分子离子峰，可知其分子量为５６４。结合紫外光谱分析结果以上，初步判断化合物可能含糖基的黄酮苷。在ｍ／ｚ５６３的二级质谱扫描图中，ｍ／ｚ５０３为［Ｍ．Ｈ－ＣＨＯＨ·ＣＨＯ］。，ｍ／ｚ４７３为［Ｍ—Ｈ－ＣＨＯＨ－ＣＨＯ·ＣＨ－ＯＨ］‘；ｍ／ｚ３８３为［５０３－Ｈ－ＣＨＯＨ．ＣＨＯＨ－－－ＣＨＯ．ＣＨ．ＯＨ］。，ｍ／ｚ３５３为［３８３．ＣＨ．ＯＨ］。（见图４－６），表明该化合物的苷元分别以碳苷键与两个糖连接，而且一个为五碳糖，一个为六碳糖；进一步推测其结构为５，７，４７．三羟基黄酮．３．Ｃ．阿拉伯糖，６．Ｃ．葡萄糖苷；即芹菜素－３－Ｃ邛可拉伯糖，６一Ｃ－葡萄糖苷。其推断的结构式：华中农业人学２００８届坝Ｉ：学位论文图４．７２号峰结构式Ｆｉｇ４－７Ｔｈｅｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓｏｆｃｏｍｐｏｕｎｄ２２号峰其可能的裂解方式如下：由幽４－６可知，３号峰一级质谱图中出现的准分子离子峰ｍ／ｚ５６３．２可推断其分子量为５６４：ｍ／ｚ４３１．３为［Ｍ．Ｈ．１３２］。丢失一分子木糖；离子峰为４３１．３可推测出可能是芹菜素．葡萄糖苷，所以３号峰可能是芹菜素一３一Ｃ一木糖，６－Ｃ一葡萄糖。艾蒿贵酬的提取分离乡Ｕ化、结构搭定及ＪＣ抗能化件研究阳＾图４．８１５．１８９时对应的一二级质谱图（４号峰）Ｆｉｇ．４－８ＭＳｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍｏｆ１５．１８９ｍｉｎＰｅａｋ由图４．８可知，４号峰一级质谱图中出现的准分子离子峰ｒｎ／ｚ４７５．１可推断其分子量为４７６；其二级质谱图中ｍ／ｚ２９８．９可推断出含有香叶木素，４７５—２９８．９＝１７６表明丢失一分子己糖，推出该物质为香叶木素．己糖苷。图４－９１５．１８９时对应的一级质谱图（５号峰）Ｆｉｇ．４－９ＭＳｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍｏｆ１５．８２２ｍｉｎＰｅａｋ由图４－９可知，５号峰一级质谱图中出现的准分子离子峰ｍ／ｚ４４７．１可推断其分子量为４４８，可能为槲皮素．鼠李糖苷。没有二级质谱，无法进一步推测。３结论通过对艾蒿黄酮进行的ＵＶ、瓜光谱分析，推断了ＦＡ的基本骨架结构。通３９华中农业人学２００８届硕Ｉ：学位论义过对艾蒿黄酮进行的ＨＰＬＣ、ＨＰＬＣ．ＥＳＩ／ＭＳ色谱分析，得出艾蒿中含有多种黄酮，ＨＰＬＣ．ＭＳ进一步证实了艾蒿中含有以芹菜素、槲皮素、香叶木素为苷元的黄酮，与报道的相符。艾篙黄酬的提取分离多ｂ化、结构搭定及ｌＣ抗瓴化十牛研究第五章艾蒿黄酮的抗氧化活性研究近年来，随着对传统合成抗氧化剂ＢＨＴ，ＢＨＡ，ＴＢＨＱ等毒性问题的提出，天然抗氧化剂越来越受到食品饲料等行业的青睐，特别是植物源抗氧化剂因其具有来源广泛、提取率高、抗氧化性强、与机体亲和力强和安全性高等优点，使天然抗氧化剂的研究逐渐成为热点（ＲｅｎｅＴｏｒｒｅｓｅｔａ１．，２００６）。其中最有研究价值的就是广泛存在于植物体的黄酮类化合物（黄酮醇、异黄酮、黄酮、黄烷酮）以及黄酮类化合物的前体物（酚酸和儿茶酸等）（朱宇旌等，２００６）。黄酮类化合物具有抗癌、抗病毒、抗菌、抗过敏、抗血管脆性和血小板聚集及抗糖尿病并发症等多种生理活性与药理作用，而这些生理活性是以黄酮类化合物的抗氧化活性为基础的（赵雪梅等，２００３）。黄酮类化合物具有很强的抗氧化活性，如清除超氧阴离子、羟基自由基和过氧自由基等，同时能显著提高超氧化物歧化酶（ＳＯＤ）和谷肤甘肽过氧化物酶（ＧＳＨ．ＰＸ）均等抗氧化酶的活性，对Ｈ２０２有明显的抑制效应（杨转琴等，２００６）。黄酮类化合物可以两种机理起抗氧化作用：（１）黄烷醇可与金属生成螯合物。螯合作用发生在３．羟基．４．酮基上，当Ａ环上有５位羟基时，螯合作用则发生在５．羟基．４．酮基上。Ｂ环上的邻醌结构也有螯合金属的性能。（２）黄酮醇的作用机理是作为自由基的接受体而阻碍自由基连锁反应从而起到抗氧化作用。（ＢａｓｈｉｒＭ．Ｒｅｚｋｅｔａ１．，２００２；Ｍａｋａｒｓｈｉｎ，２０００）。１材料与方法１．１材料、试剂与仪器１．１．１材料艾蒿黄酮：即第三章所得到的两种不同类型的ＦＡ提取物（乙酸乙酯萃取物ＦＡ２、ＳｅｐｈａｄｅｘＬＨ．２０纯化物ＦＡＳ）。昆明种小鼠，雄性，清洁级，体重２０＿＿＿２９。购自湖北省疾控中心。１．１．２主要试剂碘化钾三氯甲烷分析纯分析纯４１上海化学试剂有限公司上海化学试剂有限公司华中农业人学２００８届硕ｆｊ学位论文可溶性淀粉分析纯硫代硫酸钠分析纯ＢＨＴ食品级抗坏血酸分析纯柠檬酸分析纯酒石酸分析纯小牛胸腺ＤＮＡ生化试剂鲁米诺含量９７％邻苯三酚分析纯邻菲哕啉分析纯硫酸铜分析纯碳酸氢钠分析纯ＭＤＡ测定试剂盒生化试剂ＳＯＤ测定试剂盒生化试剂牛血清白蛋白生化试剂亚油酸生化试剂硫酸亚铁。ＡＲ三氯乙酸（ＴＣＡ）ＡＲ铁氰化钾ＡＲ１．１．３主要仪器ＷＧ２００３型台式干燥箱ＢＰＣＬ型超微弱化学发光测量仪分析天平电子天平电热恒温水浴锅Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ分析天平恒温培养箱低温高速离心机北京亚太龙兴化工有限公司河南焦作市化工三厂上海源琨精细化工有限公司中国医药（集团）上海化学试剂公司广东西陇化工厂上海试剂一厂美［］ｓｉｇｍａ公司美匡ｌｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ集团公司中国医药（集团）上海化学试剂公司上海华东师范大学化工厂中国上海精细化学品公司上海虹光化工厂南京建成生物工程研究所南京建成生物工程研究所北京双旋微生物培养基制品厂北京石景山化工厂沔阳化学试剂二厂上海自ｉ『进化学试剂厂沈阳市试剂一厂重庆实验设备厂一分厂中国科学院生物物理所ＳａｒｔｏｒｉｕｓＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓＬｔｄ．，Ｇｅｒｍａｎｙ北京赛多利斯天平有限公司上海天平仪器厂ＭａｄｅｉｎＧｅｒｍａｎｙ武汉市武昌实验仪器厂Ｈｉｔａｃｈｉ．Ｊａｐａｎ４２艾筒竹酮的提取分离乡Ｕ化、结构搭定及』Ｅ抗锻化件研究１．２实验方法１．２．１艾蒿黄酮对自由基的清除作用采用ＢＰＣＬ型超微弱化学发光测量仪（中国科学院生物物理所）进行测定，测试条件：Ｈｉ．Ｖ８００；Ｋｖ一１；记录的波长范围：１８０．８００ｎｍ；温度：３０℃。１．２．１．１艾蒿黄酮对超氧阴离子的清除作用采用邻苯三酚一鲁米诺化学发光体系（Ｚｈａｏｅｔａ１．．２００３）。鲁米诺用０．０５ｍｏｌ／Ｌ的ＮａＯＨ溶液配成０．０５ｍｏｌ／Ｌ浓度的溶液，在避光处保存，临用前用双蒸水稀释成ｌｍｍｏｌ／Ｌ的溶液，邻苯三酚用ｌｍｍｏｌ／ＬＨＣｌ配成０．０１ｍｏｌ／Ｌ的溶液，４＂Ｃ冰箱中保存，用前用双蒸水稀释成１６倍得６．２５ｘ１０４ｍｏｌ／Ｌ溶液。０．０５ｍｏｌ／ＬｐＨ１０．２的Ｎａ２Ｃ０３．ＮａＨＣ０３缓冲液（含Ｏ．１ｍｍｏｌ／ＬＥＤＴＡ）用自仃现配，实验前与ｌｍｍｏｌ／Ｌ鲁米诺以２：１（Ｖ：ｖ）混合成鲁米诺和碳酸盐缓冲液混合物。测量时，向发光池中注入１０．ＯｕＬ不同浓度的样品（以样品缓冲液为对照），然后注入６．２５ｘ１０＂４ｍｏｌ／Ｌ邻苯三酚０．０５ｍＬ，最后加入鲁米诺和碳酸缓冲液混合物Ｏ．９４ｍＬ启动反应（３０℃），间隔２ｓ记数发光强度，测定３００ｓ的总发光积分强度，本底发光强度为未加邻苯三酚时的发光值。１．２．１．２艾蒿黄酮对羟基自由基的清除作用采用ＣｕＳ０４一Ｐｈｅｎ．Ｖｃ．Ｈ２０２化学发光体系（胡天喜，１９９７），向发光池中加入样品溶液（以样品缓冲液为对照）５０ＩｔＬ，１．０ｍｍｏｌ／ＬＣｕＳ０４溶液５０此，ｌｍｍｏｌ／Ｌ令１］菲哆啉溶液５０１ａＬ，和０．０５ｍｏｌ／Ｌ０１１］砂溶液７００９Ｌ（ｐＨ９．Ｏ），ｌｍｍｏｌ／Ｌ抗坏血酸溶液１００ｕＬ和０．１５％Ｈ２０２溶液５０Ｉ＿ｔＬ，立即启动化学发光系统，间隔３ｓ记数，记录４００ｓｌ为化学发光动力学曲线，本底不加双氧水。１．２．１．３艾蒿黄酮对双氧水的清除作用采用双氧水．鲁米诺化学发光体系（胡天喜等，１９９２），向发光池中加入样品溶液（以样品缓冲液为对照）５０９Ｌ，Ｏ．１５ｍｏｌ／ＬＨ２０２５０１ｘＬ和Ｏ．１ｍｍｏｌ／Ｌ鲁米诺．Ｏ．０５ｍｏｌ／ＬｐＨ９．４碳酸盐缓冲液混合液（体积比为１：１７）９００９Ｌ，启动发光系统，间隔３ｓ记数，记录１２０ｓＮ发光强度，本底不加双氧水。１．２．１．４艾蒿黄酮对ＤＮＡ损伤的保护作用采用ＣｕＳ０４．Ｐｈｅｎ．Ｖｃ—Ｈ２０２．ＤＮＡ化学发光体系（ＭａＷＪｅｔａ１．，１９９８），向发光４３华中农业人学２００８届顾ｌｊ学位论文池中加入样品溶液（以样品缓冲液为对，照）１００ＶＬ，ＤＮＡ／Ｃｕ２＋／Ｐｈｅｎ体系溶液（ＤＮＡ浓度为３ｐｇ／ｍＬ，ＣｕＳ０４浓度为７．５ｘ１０～ｍｏｌ／Ｌ，Ｐｈｅｎ５．２５ｘ１０‘４ｍｏｌ／Ｌ）８００｝ｔＬ，４．２ｘ１０‘３ｍｏｌ／ＬＶｃ１００１ｘＬ，３％Ｈ２０２２００ｐＬ，迅速启动发光装置，每隔３ｓ记录数据一次，记录５４０ｓＰｑ的动态发光过程，本底不加双氧水。１．２．１．５数据处理所有实验均重复三次取平均值，按照下式计算清除率：Ｓｃａｖｅｎｇｉｎｇａｃｔｉｖｉｔｙ（抑制率）＝（ＣＬｃｏｎｔｍｌ－ＣＬｓａｍ＃。）／（ＣＬｃ∞仃０１．ＣＬｏ）式中：ＣＬｃｏｎ仃。广空白对照组的相对发光强度；Ｃｂ一本底组相对发光强度；Ｃｋ肿Ｉ广样品组相对发光强度。以清除率为纵坐标，样品浓度为横坐标，绘出曲线并计算出清除率为５０％时的浓度ＩＣ５０，用来衡量样品对自由基的清除能力。ＩＣ５０值越小，表明样品清除自由基能力越强（Ｈｖａｔｔｕｍｅｔａ１．．２００３）。１．２．２艾蒿黄酮对小鼠体内、体外抗氧化的作用１．２．２．１艾蒿黄酮还原能力的测定参考Ｏｙａｉｚｕ的方法（１９８６）并略作改进。基本操作步骤为：ｌｍＬ的样品溶液＋０．２ｍＬ０．２ｍ０１．Ｌ—ＰＢＳ（ｐＨ６．６）＋Ｏ．５ｍＬ１％Ｋ３［Ｆｅ（ＣＮ）６］于试管中，混匀＿５０℃水浴中反应２０ｍｉｎ＿流水速冷，加入ｌｍＬ１０％三氯乙酸，混匀＿以３０００ｒ．ｍｉｎ一离心ｌＯｍｉｎ＿取１．５ｍＬ上清液，加０．２ｍＬＩ％ＦｅＣｌ３和３ｍＬ蒸馏水摇匀，放置５ｍｉｎ＿÷以蒸馏水调零，测定Ａ７００。Ａ７００越大，表示还原能力越强。除ＶＥ用４０％（ｖ／ｖ）７＂，醇溶解外，其他样品均用蒸馏水溶解。试验用蒸馏水作为无还原能力的样品对照，ＶＥ及Ｖｃ作为有还原能力的样品对照。１．２．２．２艾蒿黄酮对小鼠肝匀浆体外生成ＭＤＡ的影响参照文献方法（张尔贤等，１９９６；黄晓兰等，２００３）。取新鲜的小鼠肝组织以Ｏ＇Ｃ的生理盐水洗净血渍，以滤纸吸干水分后称重，按１：９取相应体积的Ｏ＇Ｃ生理盐水于冰浴中分步将肝组织剪碎、在玻璃组织匀浆器中匀浆制成匀浆液，以３５００ｒ．ｍｉｎＪ离心２０ｍｉｎ，上清液即为１０％肝组织匀浆液。样品对小鼠肝匀浆ＭＤＡ生成的影响：取０．２ｍＬ１０％肝匀浆液＋０．１ｍＬ样品溶液于试管中混匀一３７℃温育ｌｈ（对照以等体积生理盐水代替样品溶液）后，艾菡施酬的提取分离纯化、结构搽定及１Ｅ抗钒化性研究冰浴冷却一再按ＭＤＡ测定试剂盒方法操作，测定Ａ５３２并计算ＭＤＡ含量（ｎｍｏｌ／ｍｇ．ｐｒ）。以牛血清白蛋白为标准，采用考马斯亮蓝法（宁『Ｆ祥，１９９８）测定肝匀浆蛋白质（ｐｒ）含量。样品对诱导体系小鼠肝匀浆ＭＤＡ生成的影响：相应取另两组试管分别测定样品对ＦｅＳ０４与Ｈ２０２诱导小鼠肝匀浆产生ＭＤＡ的影响。一组试管加０．１ｍＬ的１ｍｍ０１．Ｌ～ＦｅＳ０４，一组加０．１ｍＬ的１ｍｍ０１．Ｌ．１Ｈ２０２一然后各管加０．１ｍＬ的１０％肝匀浆液及０．１ｍＬ的相应样品溶液混匀于３７。Ｃ温育ｌｈ（对照以等体积生理盐水代替样品溶液），其余步骤同自仃，测定Ａ５３２并计算ＭＤＡ含量。１．２．２．３艾蒿黄酮对Ｈ２０２诱导小鼠红细胞氧化溶血的影响参考文献（王光林等，２００２；ＪａｎＦＳｔｅｖｅｎｓ，２００２）方法。以小鼠眼眶取血，加入Ａｌｓｅｖｅｒ抗凝剂后，以３０００ｘｇ离心１０ｍｉｎ，分离得到红细胞，冷生理赫水洗涤红细胞三次，再以生理盐水制备成Ｏ．５％小鼠红细胞悬浮液，备用。样品组：取ｌｍＬ红细胞悬浮液，加入０．２ｍＬ样品溶液混匀一加Ｏ．１ｍＬ１００ｍｍ０１．Ｌ。Ｈ２０２溶液，混匀＿３７℃温育１ｈ后，以生理盐水稀释６倍，１０００ｘｇ离心１０ｒａｉｎ，取上清液，以生理盐水调零，于４１５ｎｍ处比色测定吸光度。正常对照组（ＣＫ）：以等体积生理盐水代替样品液和Ｈ２０２溶液，其余同样品组。Ｈ２０２诱导对照组（ＣＫ＋Ｈ２０２）：以等体积生理盐水代替样品溶液，其余同样品组。分别以吸光度计算溶血度和抑制率。１．２．２．４艾蒿黄酮对小鼠肝线粒体脂质过氧化的影响参照文献（游育红，２００３；邓成华，２００１；ＳｐｒｉｇｉｒｉｄｈａｒＫ２００１）方法。取新鲜的小鼠肝组织以冷的生理盐水洗净血渍吸干表面水分后，按１：９的比例加冰冷的ｐＨ７．４等渗ＰＢＳ（５ｍｍ０１．Ｌ～ＰＢＳ，ｐＨ７．４，含０．１５ｔ００１．Ｌ—ＮａＣｌ）剪碎后用玻璃匀浆器在冰浴中匀浆制成１０％肝组织匀浆液＿４℃下以１０００×ｇ离心１５ｒａｉｎ，收集上清液＿再以１００００ｘｇ离心１５ｒａｉｎ，收集沉淀并以等渗ＰＢＳ液洗涤沉淀２次＿再以等渗ＰＢＳ将沉淀分散制成肝线粒体悬液，用考马斯亮蓝法测定该悬浮４５华中农业人学２００８屙颂Ｉｊ学位论文液的蛋白质含量，调整成蛋白质含量为Ｏ．５ｍｇ．ｍＬ一的线粒体悬浮液，备用。小鼠肝线粒体肿胀度的测定：①样品体系：０．４ｍＬ样品溶液＋３．０ｍＬ线粒体悬浮液＋Ｏ．４ｍＬ０．５ｍｍ０１．Ｌ－１ＦｅＳ０４＋０．４ｍＬ０．５ｍｍ０１．Ｌ‘１Ｖｃ溶液，迅速混匀后，以ＰＢＳ溶液调零，测定０、１０、２０、３０ｍｉｎ时的Ａ５２０，用吸光度的降低幅度表示线粒体的肿胀度。②正常组：以等体积ＰＢＳ代替样品溶液、ＦｅＳ０４和Ｖｃ液，其它同样品体系。⑧对照组：以等体积ＰＢＳ代替样品溶液，其它同样品体系。小鼠肝线粒体脂质过氧化生成ＭＩ）Ａ的测定：样品体系，１．０ｍＬ线粒体悬浮液＋０．４ｍＬ样品溶液＋Ｏ．４ｍＬＯ．５ｍｍ０１．Ｌ～ＦｅＳ０４＋Ｏ．４ｍＬＯ．５ｍｍ０１．Ｌ－１Ｖｃ溶液；正常组以等体积ＰＢＳ代替样品及ＦｅＳ０４和Ｖｃ液；对照组以等体积ＰＢＳ代替样品溶液一各管混匀，于３７。Ｃ温育１ｈ＿对应各管，取Ｏ．１ｍＬ温育后的各管溶液＿按ＭＤＡ试剂盒方法测定Ａ５３２并计算ＭＤＡ含量。１．２．２．５艾蒿黄酮在小鼠体内的抗氧化作用参考韩宏星等的方法（２００３）。昆明种小鼠４０只，小鼠随机分成低、中、高、对照组，每组１０只。低、中、高组经口灌胃分别为３０、１００、３００（ｍｇ／ｋｇ．ｂｗ．ｄ），对照组灌胃等体积生理盐水。小鼠喂养按常规条件进行。连续给药１２ｄ后，ＩＩｌＩ取血分离小鼠血清，以生理盐水稀释２０倍后，参照１．２．３方法及超氧化物歧化酶（ＳＯＤ）的活力测定试剂盒说明书，测定血清ＳＯＤ的活力；处死小鼠，取新鲜小鼠肝组织按本章１．２．４方法制备成１０％肝匀浆液，再按ＭＤＡ测定试剂盒说明书测定Ａ５３２并计算ＭＤＡ含量。１．２．２．６统计学分析用２±ｓ表示测定结果，采用ＳＡＳ软件进行，检验。２结果与分析２．１艾蒿黄酮对自由基的清除作用２．１．１ＦＡ对超氧阴离子的清除作用本体系中邻苯三酚在碱性条件下自氧化产生超氧阴离子，以鲁米诺为发光剂，超氧阴离子激发鲁米诺，鲁米诺由激发念返回到基念时产生化学发光。抗氧艾菡茭酮的提取分离纯化、结构搭定及１ｅ抗瓴化件研究化剂的加入可清除超氧阴离子，从而抑制化学发光。０２００４００６００Ｃｏｎｃｃｎｔｒａｔａｏｎ（ｍ∥Ｌ）图５－１（Ａ）ＦＡ２、ＦＡＳ及Ｖｃ不同浓度时的清除０２。活性大小Ｆｉｇ５－１（Ａ）ＳｃａｖｅｎｇｉｎｇａｃｔｉｖｉｔｉｅｓｏｆＦＡ２ａｎｄＦＡＳ，Ｖｃａｔｖａｒｉｏｕｓｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ４００００备矗３２０００营岛篇２４０００毫１６０００皇』８０００Ｕ匣０口Ｂ口１２０１Ｅ玎２４０３口口Ｔｉｍｅｓ（ｓ）图５．１（Ｂ）不同浓度的ＦＡ２抑制超氧阴离子引发的化学发光动力学曲线Ｆｉｇ５－１（Ｂ）Ｔｈｅｋｉｎｅｔｉｃｃｕｒｖｅｓｏｆ０２－－ｉｎｄｕｃｅｄｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅａｎｄｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎｏｆＦＡ２０－０ｍｇ／Ｌ；１－２５ｍｇ／Ｌ，２—１００ｍｇ／Ｌ：３－２５０ｍｇ／Ｌ；４—５００ｍｇ／Ｌ图５—１（Ａ）结果表明，随着样品浓度的升高，清除率呈上升趋势。ＦＡ２的ＩＣ５０为１８１．１７ｒｎｇ／Ｌ，ＦＡＳ的ＩＣ５０为１０５．３４ｍｇ／Ｌ，远远小于Ｖｃ的ＩＣ５０２８０．１３ｍｇ／Ｌ。在实验观测２５—６００ｍｇ／Ｌ的浓度范围内，三种物质清除０２。的活性大小为ＦＡＳ＞ＦＡ２＞Ｖｃ。图５．１（Ｂ）中显示，曲线Ｏ是未加样品产生的发光曲线，在１４０ｓｅｃ时达最大值，随后逐渐下降；ＦＡ２的加入使发光曲线发生变化，发光值降低，且呈剂量．效应关系；ＦＡ２能有效清除超氧阴离子。２．１．２ＦＡ对羟基自由基的清除作用本体系中，Ｃｕ２＋被Ｖｃ还原成Ｃｕ＋，Ｃｕ＋与Ｈ２０２在Ｆｅｎｔｏｎ反应中产生·ＯＨ，·ＯＨ氧化Ｐｈｅｎ，使Ｐｈｅｎ激发，Ｐｈｅｎ退激时产生化学发光。抗氧化剂的加入可清除·ＯＨ，降低化学发光强度。４７华中农业人学２００８屙硕Ｉ：学位论文Ｓ｛寻∞叩鲁墓营们董印蚰扣００１００２００３００Ｃｏｎｃｅｎ仃ａｈ０１＇１（ｍ∥Ｌ）图５．２（Ａ）ＦＡ２、ＦＡＳ及Ｖｃ不同浓度时的清除·ＯＨ。活性大小Ｆｉｇ５－２（Ａ）ＳｃａｖｅｎｇｉｎｇａｃｔｉｖｉｔｉｅｓｏｆＦＡ２ａｎｄＦＡＳ，Ｖｃａｔｖａｒｉｏｕｓｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ∞０∞０茸∞∞甚一最呻０皇匠Ｏ口ｌＤＤ２００３００耳ＤＤＴｋｎｐ－ｓ（ｓ）图５．２（Ｂ）不同浓度的ＦＡＹ．清除·ＯＨ引发的化学发光动力学曲线Ｆｉｇ５－２（Ｂ）Ｔｈｅｋｉｎｅｔｉｃｃｕｒｖｅｓｏｆ·ＯＨ－ｉｎｄｕｃｅｄｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅａｎｄｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎｏｆＦＡ２０－０ｍｇ／Ｌ＝１－１ｍｇ几；２·２５ｍｇ／Ｌ；３－５０ｍｇ／Ｌ＝４—２５０ｍｇ／Ｌ从图５－２（Ａ）可知，艾蒿黄酮对·ＯＨ的清除率随着浓度的增加而增大，量效关系非常明显。ＦＡ２的ＩＣ５０为２５．１８ｍｇ／Ｌ，ＦＡＳ的ＩＣ５０为１５．３９ｍ∥Ｌ，Ｖｃ的ＩＣ５０２０．４１ｍｇ／Ｌ。在实验观测Ｏ一２５０ｍ∥Ｌ的浓度范围内，三种物质清除·ＯＨ的活性大小为ＦＡＳ＞ｖＣ＞ＦＡ２。图５－２（Ｂ）表明，随ＦＡ２的加入，发光强度明显降低，随浓度增加，样品对·ＯＨ清除作用增强且具有良好的量效关系。２．１．３Ｒ蚣对过氧化氢的清除作用本体系中，Ｈ２０２能在有０２和碱性条件下氧化鲁米诺产生化学发光。加入一定量的抗氧化剂，清除Ｈ２０２，可抑制化学发光。由图５－３（Ａ）知，清除率随样品浓度增大而增大，呈量效关系。ＦＡ２的ＩＣ５０为０．５３ｍｇ／Ｌ，ＦＡＳ的ＩＣｓｏ为０．２ｍｇ／Ｌ，Ｖｃ的ＩＣ５００．８９ｍｇ／Ｌ。在实验观测０－５ｍｇ／Ｌ的浓度范围内，三种物质清除Ｈ２０２的活性大小为ＦＡＳ＞ＦＡ２＞ｖｃ。图５．３（Ｂ）表明ＦＡＡ的加入，使发光峰值下降；艾．管黄酬的提取分离纯化、结构Ｉ筘定及１Ｌ抗讯化件研究随浓度的增大，发光更弱。一邑备葛品悬高们０２４６ｃｏｎｃｅｎ打缸叽（ｍｇ／Ｌ）图５．３（Ａ）ＦＡ２、ＦＡＳ及Ｖｃ不同浓度时的清除Ｈ２０２活性大小Ｆｉｇ５－３（Ａ）ＳｃａｖｅｎｇｉｎｇａｃｔｉｖｉｔｉｅｓｏｆＦＡ２ａｎｄＦＡＳ，Ｖｃａｔｖａｒｉｏｕｓｃｏｎｃｅｎｔｒａｔ！ｉｏｎｓ．鲁忘２１０００００苔盖１４０００００ｊＵ皇Ｔ０００００巾《∞Ｔｉｍｅｓｆｓ）图５．３（Ｂ）不同浓度的ＦＡ２清除Ｈ２０２引发的化学发光动力学曲线Ｆｉｇ５－３（Ｂ）ＴｈｅｋｉｎｅｔｉｃｃｕｒｖｅｓｏｆＨ２０ｒｉｌｌｄｕｃｅｄｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅａｎｄｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎｏｆＦＡ２０－０ｍｇ／Ｌ；１－０．０２ｍｇ／Ｌ＿；２－０．２ｍｇ／Ｌ；３－１ｍｇ／Ｌ；４－５ｍｇ／Ｌ２．１．４对ＤＮＡ损伤的保护作用ＣｕＳ０４．Ｐｈｅｎ．Ｖｃ．Ｈ２０２．ＤＮＡ化学发光体系，它能够生成·ＯＨ，伴随ＤＮＡ的氧化降解产生很强的化学发光，因此，将此体系应用于检测ＤＮＡ损伤，以考察抗氧化剂对ＤＮＡ损伤的保护作用（ＢｉｎｇＴｉａｎｅｔａ１．，２００７）。本实验测得该反应的动力学曲线出现前后两个峰，前峰代表Ｐｈｅｎ自身氧化发光，后峰代表ＤＮＡ损伤产物发光（裴凌鹏等，２００５）。由图５—４（Ａ）知，ＦＡ２的ＩＣ５０为１４．５６ｍｇ／Ｌ，Ｆ．ＡＳ的ＩＣ５０为１２．１８ｍｇ／Ｌ，Ｖｃ的ＩＣ５０１９．５５ｍｇ／Ｌ。在实验观测０—５０ｍｇ／Ｌ的浓度范围内，三种物质清除·ＯＨ保护ＤＮＡ的活性大小为ＦＡＳ＞ＦＡ２＞Ｖｃ。从图５－４（Ｂ）可见，ＦＡ２的加入，使前后两峰明显下降，且后峰有后移现象，浓度越大，后峰越低，说明ＦＡ２能有４９华中农业人学２００８届硕Ｉ：学位论文效地清除·ＯＨ，从而减缓ＤＮＡ损伤的动力学过程，保护ＤＮＡ免受损伤。Ｓ鲁莹善∽董０２０４０６０Ｃｏｎｃｅｎｌｒａｔｉｏｎ（ｍｇ／Ｌ）图５．４（Ａ）ＦＡ２、ＦＡＳ及Ｖｃ不同浓度时的清除活性大小Ｆｉｇ５－３（Ａ）ＳｃａｖｅｎｇｉｎｇａｃｔｉｖｉｔｉｅｓｏｆＦＡ２ａｎｄＦＡＳ，Ｖｃａｔｖａｒｉｏｕｓｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ１２０００窘１００００口Ｄ荟８０００＿鸷：孽６０００Ｊ∞皇４０００ｉ口星２００００Ｄｌ口Ｄ２００了口口４口口５Ｄ口Ｔｉｍｅｓ（ｓ）图５－４（Ｂ）不同浓度的ＦＡ２清除·ＯＨ（保护ＤＮＡ受损）引发的化学发光动力学曲线Ｆｉｇ５－４（Ｂ）Ｔｈｅｋｉｎｅｔｉｃｓｏｆ·ＯＨ—ｉｎｄｕｃｅｄＤＮＡｏｘｉｄａｔｉｖｅｄａｍａｇｅｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅａｎｄｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎｏｆＦＡ２０－０ｍｇ／Ｌ＝１－０．５ｍｇ／Ｌ；２－１０ｍｇ／Ｌ；３—２５ｍｇ／Ｌ＝４－５０ｍｇ／Ｌ如图５．５所示，艾蒿黄酮（ＦＡ２）随着浓度的增大，Ａ７００值也增大，还原能５０２．２艾蒿黄酮对小鼠体外抗氧化的作用２．２．１艾蒿黄酮还原能力的测定力在该浓度范围内有较好的量效关系。以２ｐｌ／ｍＬＶＥ和３０ｐｇ／ｍＬＶｃ体系的还原能力作参比，５．０ｍｇ／ｍＬ艾蒿黄酮还原能力强于前两者。结果表明，ＦＡ２存在还原能力，说明ＦＡ２具有表现抗氧化作用的可能性。艾－苗黄酮的提取分离纯化、结构雅定及】ｅ抗氧化件研究１．８１．６１．４昌１．２罢ｌ０．８０．６０．４０．２０１２３４５６Ｔ图５．５艾蒿黄酮（ＦＡ２）的还原能力Ｆｉ９５－５ＴｈｅｄｅｏｘｉｄｉｚａｔｉｏｎｏｆＦＡ２１．８２０；２．０．０５ｍｇ／ｍＬ；３．０．５ｍｇ／ｍＬ；４．２ｍｇ／ｍＬ；５．５ｍｇ／ｍＬ；６．３０ｕｇ／ｍＬＶｃ；７．２ｕＬ／ｍＬＶｚ２．２．２艾蒿黄酮对小鼠肝匀浆体外生成ＭＤＡ的影响亚铁离子Ｆｅ２＋和Ｈ２０２均是产生自由基的强诱导剂。表５－１说明，艾蒿黄酮在一定浓度范内对无诱导剂、有Ｆｅ外和Ｈ２０２诱导的３种体系下的小鼠肝匀浆ＭＤＡ生成均有抑制作用。与对照组相比较，Ｆ？Ｃ２在实验浓度范围内对自氧化、Ｆｅ２＋诱导和Ｈ２０２诱导３种体系中的小鼠肝匀浆ＭＤＡ的生成均有极显著的抑制效果，并呈剂量．效应关系。１０９／ＬＦＡ２对Ｈ２０２诱导的ＭＤＡ生成抑制率高达７３．０２％。说明ＦＡ２对小鼠肝组织自发性脂质过氧化和诱导脂质过氧化均有较强的抑制作用。表５－１艾蒿黄酮ＦＡ２对小鼠肝组织匀浆ＭＤＡ生成的影响（牙±ｓ，ｎ＝３）Ｔａｂｌｅ５－１Ｅｆ．ｆｅｃｔｏｆＦＡＡｏｎＭＤＡｆｏｒｍａｔｉｏｎｉｎｒａｔｆｉｖｅｒｉｎｄｕｃｅｄｂｙＦｅ２＋ａｎｄＨ２０２（ｎ－－１０，一Ｘｉｓ）ａ：Ｐ＜Ｏ．Ｏ１ＶＳ．ＣｏｎｔｒｏｌＧｒｏｕｐ：ｂ－Ｐ＜Ｏ．０５ＶＳ．ＣｏｎｔｒｏｌＧｒｏｕｐ５ｌ华中农业人学２００８届硕Ｉｊ学位论文２．２．３艾蒿黄酮对Ｈ２０２诱导小鼠红细胞氧化溶血的影响红细胞在体外因自身氧化或诱导氧化而发生溶血（王光林，２００３）。表５—２显示，４种浓度的ＦＡ２在抑制Ｈ２０２诱导的小鼠红细胞溶血时，０．０５—２．００９．Ｌ一浓度范围内表现为一定的量效关系，而１０．００９．Ｌ．‘浓度却表现了溶血抑制率下降的效应，可能是样品浓度过高，使反应体系渗透压超出了红细胞的生理渗透压所致，从而没有明显的剂量一效应关系。ＦＡ２可抑制氧化损伤，保护红细胞膜。表５．２艾蒿黄酮对Ｈ２０２诱导的体外小鼠红细胞溶血的影响Ｔａｂｌｅ５－２ＥｆｆｅｃｔｓｏｆＦＡ２ｏｎｈｅｍｏｌｙｓｉｓｏｆｍｉｃｅｒｅｄｂｌｏｏｄＣｅＢｉｎｄｕｃｅｄｂｙＨ２０２（ｘ±Ｓ．ｎ＝１０）ａ：Ｐ＜０．０１ＶＳ．ＣｏｎｗｏｌＧｒｏｕｐ２．２．４艾蒿黄酮对体夕ｂ／Ｊ＇鼠肝线粒体脂质过氧化的影响２．２．４．１艾蒿黄酮对体外小鼠肝线粒体ＭＤＡ生成的影响由表５．３可知，若加入ＦＡ２，ＭＤＡ生成量显著减少说明ＦＡ２可抑制Ｆｅ２＋和Ｖｃ诱导的氧化作用，此抑制作用有一定的量效关系。ＦＡ２对Ｆｅ２＋和Ｖｃ诱导的小鼠肝线粒体ＭＤＡ生成有较强的抑制作用，并呈明显的剂量．效应关系。与诱导对照体系相比，在５９／Ｌ时抑制率达到７５．０５％。Ｔａｂｌｅ表５－３ＦＡ２对体外小鼠肝线粒体ＭＤＡ生成的影响５．３ＥｆｆｅｃｔｏｆＦＡＡｏｎＭＤＡｆｏｒｍａｔｉｏｎｉｎｒａｔｆｉｖｅｒｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｉｎｄｕｃｅｄｂｙＦｅ２＋＋Ｖｃ（ｎ＝１０，一Ｘ±ｓ）ａ：Ｐ＜０．０１ＶＳ．ＣｏｎｇｏｌＧｒｏｕｐ５２艾．苗黄酬的提取分离纯化、结构搭定及ＪＣ抗氰化件研究２．２．４．２艾蒿黄酮对小鼠肝线粒体肿胀度的抑制作用——·—一Ｃｏｎｔｒｏｌ＋Ｄ．ｏｓｒ．／Ｌ一２叽０．４４０５９ｔＬ＿＿－一１０ｒ，ＩＬｏ一目０．３６盖０．２８Ｄ．２０１０ｔ（删２Ｄ３０图５－６艾蒿黄酮对小鼠肝线粒体肿胀度的抑制作用Ｆｉｇ．１ＥｆｆｅｃｔｏｆＦＡ２ｏｎｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｓｗｅｌｌｉｎｇｉｎｄｕｃｅｄｂｙＶｃ＋Ｆｅ２＋线粒体因脂质过氧化而使膜的通透性增加，引起膜内外物质交换，造成线粒体肿胀、损伤（路雪雅，１９９７）。线粒体肿胀导致其浊度下降，表现为Ａ５２０值下降。由图５．６可见，随着时间的延长各组在５２０ｎｍ吸光值下降，说明线粒体膜被氧化损伤而发生了肿胀，其中对照组下降幅度最大，加ＦＡ２组下降趋势减缓，表明ＦＡ２可抑制·ＯＨ所致氧化损伤程度，肿胀减轻，而且呈剂量依赖关系。２．３艾蒿黄酮对小鼠体内的抗氧化作用表５—４显示，经灌胃艾蒿黄酮１２ｄ后，小鼠肝匀浆的ＭＤＡ值与对照组比，有明显下降，差异达到极显著水平，表明ＦＡ２有减少小鼠体内肝组织脂质过氧化产物生成的作用。灌胃艾蒿黄酮后的小鼠血清ＳＯＤ平均值也高于对照，差异也显著。表５．４艾蒿黄酮对小鼠肝匀浆ＭＤＡ和血清ＳＯＤ的影响Ｔａｂｌｅ５－４ＥｆｆｅｃｔｓｏｆＦＡ２ｏｎＭＤＡｆｏｒｍａｔｉｏｎｉｎｒａｔｌｉｖｅｒｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａａｎｄＳＯＤｏｆｍｉｃｅｓｅｒｕｍ与对照组相比较，ａ：Ｐ＜０．０ｌ；ｂ：Ｐ＜Ｏ．０５·仁中农业人学２００８届顾ｌ：学位论义３结论细胞的正常代谢活动会产生活性氧自由基，Ｊ下常情况下机体各种抗氧化酶或抗氧化剂能维持活性氧代谢平衡。一旦这种平衡打破，造成体内自由基积累，这些积累的自由基极易和蛋白质、核酸、糖类和脂类物质发生氧化作用，导致细胞的结构和功能遭受破坏和损害，引起病变。人类的多种疾病如衰老、肿瘤、辐射损伤、炎症、心脑血管等都与自由基损伤有关（李楠，２００５）。生物类黄酮具有清除自由基和抗氧化的能力，其作用机理在于它阻止了自由基在体内产生的３个阶段：即与０２’反应阻止自由基引发；与金属离子螫合阻止ＯＨ。生成；与脂质过氧基（ＲＯＯ’）反应阻止脂质过氧化过程（张德权，２００３）。从实验结果可以看出，艾蒿黄酮ＦＡ２和ＦＡＳ是有效的抗氧化剂，在所测试的四个体系中，均显示出优异的抗氧化活性。二者清除超氧阴离子的能力分别为Ｖｃ的１．５倍和２．７倍；ＦＡＳ清除羟基自由基的能力为Ｖｃ的１．３倍，ＦＡ２清除羟基自由基的能力略低于Ｖｃ；清除过氧化氢的能力分别为Ｖｃ的１．８倍和４．５倍，抑制ＤＮＡ氧化损伤的能力分别为Ｖｃ的１．３倍和１．６倍。通过对艾蒿黄酮的还原能力的测定，从化学本质上证实了艾蒿黄酮具有一定的抗氧化能力。体外小鼠红细胞溶血、小鼠肝组织匀浆及肝线粒体脂质过氧化产物ＭＤＡ生成的影响，表明艾蒿黄酮在一定浓度范围内可提高体外小鼠血清抗活性氧能力，能抑制小鼠红细胞溶血，抑制小鼠肝组织匀浆及肝线粒体ＭＤＡ的生成和肝线粒体肿胀，剂量一效应关系较明显，说明艾蒿黄酮具有体外对小鼠细胞器和细胞的抗氧化作用。初步探讨了艾蒿黄酮的体内抗氧化效果。灌胃后小鼠体内肝匀浆ＭＤＡ含量和血清ＳＯＤ含量的分析表明，艾蒿黄酮对降低小鼠肝脏ＭＩ）Ａ含量有显著的作用：能提高小鼠血清ＳＯＤ活性；说明艾蒿黄酮具有一定的体内抗氧化作用。艾．苗黄酮的提取分离纯化、结构搭定及Ｊｅ抗钣化件研究第六章结论本文对艾蒿中黄酮的提取，分离、纯化，分析、鉴定及其抗氧化活性等进行了系列研究，结果如下：１通过单因素及旋转正交实验确定提取艾蒿黄酮（ＦＡ）的最佳工艺组合：时间１４９ｍｉｎ，乙醇浓度５６％，温度７２℃，料液比１：２０，提取２次。在此最佳工艺组合下ＦＡ的平均提取率可达９１．２％。２从３种大孔树脂中筛选出ＡＢ．８大孔树脂纯化艾蒿黄酮效果最佳。采用ＡＢ．８大孔树脂纯化艾蒿黄酮的最佳条件：（树脂柱柱长度４８ｅｍ；柱内直径５．２ｃｍ；初始上样液黄酮含量为３７．５６ｍｇ／ｍＬ）上样量为１６ｍＬ，淋洗剂为ｐＨ４的蒸馏水，洗脱剂为ｐＨ４的５０％７，醇，沈脱剂用量为５倍柱体积，树脂可以重复使用３次，产品真空干燥后黄酮纯度达６９．３７％。乙酸乙酯相（ＦＡ２）纯度达７８．２８％，得率为２．６４％；ＦＡ２经过葡聚糖凝胶纯化后（ＦＡＳ），黄酮含量达到９９．１６％，得率为１．８９％。３采用ＵＶ、ＩＲ、ＨＰＬＣ、ＨＰＬＣ．ＥＳＵＭＳ等现代分离检测技术对艾蒿黄酮葡聚糖凝胶纯化物的鉴定进行了深入研究。结果表明，艾蒿中含有以芹菜素、槲皮素、香叶木素为苷元的黄酮。４通过体外、体内实验研究了艾蒿黄酮的抗氧化活性。①化学发光法体外抗氧化研究表明，ＦＡ２及ＦＡＳ可有效清除超氧阴离子、羟基自由基、过氧化氢，抑制ＤＮＡ氧化损伤。同时还比较了艾蒿黄酮和Ｖｃ的抗氧化作用，结果表明：艾蒿黄酮抗氧化效应远远高于Ｖｃ的。在清除超氧阴离子体系中，ＦＡ２的ＩＣ５０为１８１．１７ｍｇ／Ｌ，ＦＡＳ的ＩＣ５０为１０５．３４ｍｇ／Ｌ，远远小于Ｖｃ的ＩＣ５０２８０．１３ｍｇ／Ｌ。在实验观测２５—６００ｍｇ／Ｌ的浓度范围内，三种物质清除０２－的活性大小为ＦＡＳ＞ＦＡ２＞Ｖｃ。在清除·ＯＨ体系中，ＦＡ２的ＩＣ５０为Ｏ．５３ｍｇ／Ｌ，ＦＡＳ的ＩＣｓｏ为Ｏ．２ｍｇ／Ｌ，Ｖｃ的ＩＣｓ００．８９ｍｇ／Ｌ。在实验观测０－５ｍｇ／Ｌ的浓度范围内，三种物质清除Ｈ２０２的活性大小为ＦＡＳ＞ＦＡ２＞Ｖｃ。在清除Ｈ２０２体系中，ＦＡ２的ＩＣｓｏ为０．５３ｍｇ／Ｌ，ＦＡＳ的ＩＣ５０为０．２ｍｇ／Ｌ，Ｖｃ的ＩＣｓ００．８９ｍｇ／Ｌ。在实验观测０－５ｍｇ／Ｌ的浓度范围内，三种物质清除Ｈ２０２的活性大小为ＦＡＳ＞ＦＡ２＞Ｖｃ。在清除·ＯＨ保护ＤＮＡ体系中ＦＡ２的ＩＣ５０为１４．５６ｍｇ／Ｌ，ＦＡＳ的ＩＣｓｏ为１２．１８ｍｇ／Ｌ，Ｖｃ的ＩＣｓｏｌ９．５５ｍｇ／Ｌ。在实验观测０－５０ｍｇ／Ｌ的浓度范围内，三种物质清除·ＯＨ保护ＤＮＡ的活性大小为ＦＡＳ＞ＦＡ２＞Ｖｃ。５５华中农业人学２００８届硕ｌ：学位论文②艾蒿黄酮对体外小鼠红细胞溶血、小鼠肝组织匀浆及肝线粒体脂质过氧化产物ＭＤＡ生成的影响；表明艾蒿黄酮在一定浓度范围内可提高体外小鼠血清抗活性氧能力，能抑制小鼠红细胞溶血，抑制小鼠肝组织匀浆及肝线粒体ＭＤＡ的生成和肝线粒体肿胀，说明艾蒿黄酮具有体外对小鼠细胞器、细胞的抗氧化作用。③艾蒿黄酮的体内抗氧化实验表明，艾蒿黄酮对降低小鼠肝脏ＭＤＡ含量有显著的作用；能提高小鼠血清ＳＯＤ活性；说明艾蒿黄酮具有一定的体内抗氧化作用。艾蒿黄酬的提取分离纯化、结构搭定及ＪＣ抗钣化件研究参考文献１．陈茂花．我国叶茎类食用野生植物资源简介．食品研究与丌发，２００２，２３（３）：１８２．陈在新，李俊凯，陈义全．分光光度法测定板栗黄酮含量．果树学报，２００３，２０（２）：１４９．１５１３．戴启广，陈国平，王幸宜．新型甜味剂一二氢查尔酮衍生物．精细化工中问体，２００４，３４（３）：７－９４．邓成华，杨祥良，王雁，等．硫酸酯化虎奶多糖的制备及其抗氧化作用研究．中国生化药物杂志，２００１，２２（１）：１－４５．范志刚，麦军立．微波技术对雪莲中黄酮浸出量影响的研究．中国民族医药杂志，２０００，２１（１）：４３—４４６．费荣昌．试验设计与数据处理．江南大学出版社，２００１：５９．６３．７．冯涛，曹东旭，高辉，吕晓玲．大孔吸附树脂对竹叶黄酮的吸附分离特性研究．广州食品工业科技，２００２，１９（１）：９—１１８．高荫瑜，游海，陈芩，何小立，陈才水．蜂胶黄酮类化合物超临界萃取工艺研究．食品科学，２００２，２３（８）：１５４—１５６９．龚盛昭．黄酮类化合物保健食品大有开发价值．广州食品工业科技，２００２，１（１）：６３．６４８１０．顾静文，刘立鼎，陈京达，汪佑民．艾蒿和野艾蒿精油的化学成分．江西科学，１９９８，１６（４）：２７３—２７６１１．韩宏星，曾慧慧，屠鹏飞．迷迭香总二萜酚的体内抗氧化作用．中草药，２００３，３４（２）：１４７—１４９１２．洪宗国．艾与蕲艾的生药学研究与开发．中医药学刊，２００３，２１（８）：１３５６１３．胡军，周跃华．大孔吸附树脂在中药成分精制纯化中的应用．中成药，２００２，２４（２）：１２７．１３０１４．胡天喜．自由基生命科学进展（第５集）．北京：原子能出版社，１９９７：６５．７１１５．湖北卫生局编．湖北中草药志（二）．武汉：湖北人民出版社，１９８２：３４５１６．黄文哲，赵小辰．异黄酮类化合物抗肿瘤细胞增蜻作用．现代中药研究与实践，２００３，１７（１）：５０．５ｌ５７华中农业人学２００８届硕Ｉ？学位论义１７．黄晓兰，阎俊，吴晓文．枸杞多糖对Ｈ２０２诱导的小鼠生殖细胞损伤的影响．食品科学，２００３，２４（１２）：１１６．１１８１８．揭金阶．罗布麻叶总黄酮类化合物的提取及含量测定．中国医院药学杂志，２００６，２６（１２）：１４９０．１４９１１９．李胜华，伍贤进，刘惠君．超声波提取翻白草中总黄酮优化工艺研究．食品科技，２００８，１：１６７－１７０２０．李春美，钟朝辉，窦宏亮，吴宝利，谢笔钧．大孔树脂分离纯化黄酮的研究．农业工程学报，２００６，２２（３）：１５３．１５７２１．李慧．艾叶的药理研究进展及丌发应用．基层中药杂志，２００２，１６（３）：５１—５３２２．李教社等．蜜蒙花黄酮类化合物的分离和鉴定．药学学报，１９９６，３１（１１）：８４９２３．李楠．黄酮类化合物的功能特性．食品研究与丌发，２００５，２６（６）：１３９．１４１２４．刘森．中草药成分提取分离与制剂加工新技术新工艺新标准实用手册．中国教育出版社，２００４，３１６２５．刘志勤，曹纬国．青海枸杞叶黄酮含量的测定．青海科技，２００４，（１）：４６．４７２６．路雪雅．儿茶精对抗坏血酸和硫酸亚铁诱导肝线粒体损伤的作用．生物物理学报，１９９７，１３（１）：３５２７．骆和生．中药方剂的药理与临床研究进展．广州：华南理工大学出版社，１９９１，１９７２８．宁Ｊ下祥．食品成分分析手册．北京：中国轻工出版社，１９９８，７８—７９２９．裴凌鹏，惠伯棣，张帅．葛根黄酮对ＤＮＡ氧化损伤的保护研究．食品科学，２００５，２６（４）：２３６．２３８３０．彭友元，丁祥欢，叶建农．沙棘黄酮口服液中芦丁和５．轻色胺的毛细管区带电泳电化学检测．分析测试学报．２００３，２２（１）：７６．７８３１．全国中草药汇编（上册）．北京：人民卫生出版社，１９７６：２７３２．权美平，岳阳，韩军岐．微波辅助提取生姜黄酮的工艺研究．陕西农业科学，２００８，１：３５．３８３３．上海第二医学院附属第三人民医院气管炎研究组．中华医学杂志，１９７５，５５（９）：６２４３４．唐传核，彭志英．．类黄酮的最新研究进展（ＩＩ）——生理功能．中国食品添加５８艾，苗黄酬的提取分离纯化、结构搭定及』Ｃ抗氧化件研究剂，２００２，１２（１）：５．１１３５．王光林，Ｆｆｌ兵，方宏筠．芦荟抗氧化物质活性及对红细胞的保护作用．营养学报，２００２，２４（４）：３８０－３８４３６．邬安珍．反相高效液相色谱分离黄酮类化合物的研究．分析测试学报，１９９３，１２（１）：５９３７．肖崇厚．中药化学．上海：上海科技出版社，１９９７，２６５３８．徐燕，邵家德．双波长分光光度法测定枳芩合剂中黄芩总黄酮的含量．中国药事，１９９７，１ｌ（４）：２５０—２５１３９．谢作权，张庆华．银含叶提取物对神经及心血管系统的调节机制．国外医学药学分册，２００７，ｌ：５６．５９４０．许丽旋，蔡建秀．２００６．竹笋壳黄酮提取液抑菌效应初步研究．学术园地．４（４）：２９－３１。４１．杨青．黄花菜中黄酮的提取及其对自由基清除作用的研究．［硕士学位论文］．武汉：中南大学，２００４４２．杨转琴，王磊，范娜．艾蒿黄酮化合物含量及抗氧活性的研究．食品科学，２００６２７（４）：１０２．１０５４３．姚新生．天然药物化学．北京：人民卫生出版社，２００６，１８４．１８７４４．叶怀义，龚赋岚等．２００４．甘草黄酮抗衰老作用的研究．哈尔滨商业大学学报．２０（１）：９３－９５４５．游育红，林志彬．灵芝多糖肽的抗氧化作用．药学学报，２００３，３８（２）：８５—８８４６．余丽娟，陈全斌．高效液相色谱法制备罗汉果甜甙标准品．色谱，２００３，２１（４）：３９７．３９９４７．张鞍灵，高锦明，王妹清．黄酮类化合物的分布及开发利用．西北林学院学报，２０００，１５（１）：６９．７４４８．张德权．生物类黄酮的研究及应用概况．食品与发酵工业，２００３，２５（６）：５２．５８４９．张尔贤，俞丽君，周意琳．Ｆｅ２＋诱发脂蛋白ＰＵＦＡ过氧化体系及对若干天然产物抗氧化作用的评价．生物化学与生物物理学报，１９９６，２８（２）：２１５—２１７５０．张素华，王Ｊ下云．大孔树脂纯化芦笋黄酮工艺的研究．食品科学，２００６，２７（２）：１８２．１８６５１．张淑芬，马炳伦，郑大威，等．柑桔果皮多甲氧基黄酮的ＬＣ．ＡＰＣＩ．ＭＳ定性华中农业人学２００８届顾ｌ：学位论义分析．分析测试学报，２００４，２３：１１０．１１２５２．张学兰．炮制对艾叶主要成分及止血作用的影响．中成药，１９９２，１５（２）：２２５３．赵雪梅．胡抽皮化学成分及其活性研究．［博士论文］．杭州：浙江大学，２００３，１０７．１０８５４．郑功源，杨安树，邓丹雯．大孔吸附树脂分离纯化藜蒿中黄酮类化合物．食品科技，２００３，（１）：１１—１３５５．周峰，秦路平，连佳芳，郑清明．艾叶的化学成分、生物活性和植物资源［Ｊ］．药学实践杂志，２０００，ｌ８（２）：９６—９８５６．朱亮锋，陆碧瑶，罗友娇．艾蒿和蕲艾精油化学成分的研究．云南植物研究，１９８５，７（４）：４４３·５７．朱宇旌，张勇，王纯刚．红三叶黄酮抗氧化性研究．食品科技，２００６（４）：７８．８１５８．ＡｉｎａＬａｏ，ＹａｓｕｏＦｕｊｉｍｏｔｏ，Ｊｉａｚｈｏｎｇｉｉａｎ．ＥｕｄｅｓｍａｎｏｌｉｄｅｓａｎｄｏｔｈｅｒｃｏｎｓｔｉｔｕｅｎｔｓｆｒｏｍＡｒｔｅｍｉｓｉａａｒｇｙｉｅｔＶａｎｔ．ＣｈｅｍＰｈａｒｅＢｕｌｌ，１９８４，３２（２）：７２３５９．ＢａｓｈｉｒＭＲｅｚｋ，Ｇｕｉｄｏ＆ＨａｅｎｅｎＭ，ＷｉｍＪＦ．Ｖａｎｄｅｒｖｉｊｇｈ．Ｔｈｅａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔａｃｔｉｖｉｔｙｏｆｐｈｌｏｒｅｔｉｎ：ｔｈｅｄｉｓｃｌｏｓｕｒｅｏｆａｎｅｗａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔｐｈａｒｍａｃｏｐｈｏｒｅｉｎｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ．ＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌａｎｄＢｉｏｐｈｙｓｉｃａｌＲｅｓｅａｒｃｈＣｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ，２００２，（２９５）：９．１３６０．ＢｉｎｇＴｉａｎ，ＺｈｅｎｊｉａｎＸｕ，ＺｏｎｇｔａｏＳｕｎ，ｅｔａ１．ＥｖａｌｕａｔｉｏｎｏｆｔｈｅａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔｅｆｆｅｃｔｓｏｆｃａｒｏｔｅｎｏｉｄｓｆｒｏｍＤｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓｒａｄｉｏｄｕｒａｎｓｔｈｒｏｕｇｈｔａｒｇｅｔｅｄｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ，ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ，ａｎｄＤＮＡｄａｍａｇｅａｎａｌｙｓｅｓ．ＢｉｏｃｈｉｍｉｃａｅｔＢｉｏｐｈｙｓｉｃａＡｃｔａ，２００７，１７７０（６）：９０２－９１１６１．ＢｏｑｉａｎｇＦｕ，ＪｉｅＬｉｕ，ＨｕａｎＬｉ，ＬｅｉＬｉ，ＦｒａｎｋＳ．Ｃ．Ｌｅｅ，ＸｉａｏｒｕＷａｎｇ．Ｔｈｅａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｏｆｍａｃｒｏｐｏｒｏｕｓｒｅｓｉｎｓｉｎｔｈｅｓｅｐａｒａｔｉｏｎｏｆｌｉｃｏｒｉｃｅｆｌａｖｏｎｏｉｄｓａｎｄｇｌｙｃｙｒｒｈｉｚｉｃａｃｉｄ．ＪｏｕｌＴｌａｌｏｆＣｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙＡ，２００５（１０８９）：１８－２４６２．ＣｕｙｃｋｅｎｓＦ’ＳｈａｈａｔＡ，ＰｉｅｔｅｒｓＬ，ＣｌａｅｙｓＭ．ＤｉｒｅｃｔＳｔｅｒｅｏｃｈｅｍｉｃａｌＡｓｓｉｇｎｍｅｎｔｏｆＨｅｘｏｓｅａｎｄＰｅｎｔｏｓｅＲｅｓｉｄｕｅｓｉｎＦｌａｖｏｎｏｉｄＯ—ｇｌｙｃｏｓｉｄｅｓｂｙＦａｓｔＡｔｏｍＢｏｍｂａｒｄｍｅｎｔａｎｄＥｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙＩｏｎｉｚａｔｉｏｎＭａｓｓＳｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ．Ｊ．ＭａｓｓＳｐｅｃｔｒｏｍ．２００２，３７，１２７２－１２７９６３．ＣｕｙｃｋｅｎｓＦ’ＲｏｚｅｎｂｕｒｇＲＨｏｆｆｍａｎｎＥ，ＣｌａｅｙｓＭ．ＳｔｒｕｃｔｕｒｅＣｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆＦｌａｖｏｎｏｉｄＯ··ｄｉｇｌｙｃｏｓｉｄｅｓｂｙＰｏｓｉｔｉｖｅａｎｄＮｅｇａｔｉｖｅＮａｎｏ－－ＥｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙＩｏｎｉｚａｔｉｏｎ艾．苗黄酮的提取分离纯化、结构峪定及ＪＥ抗饥化忡研究ＩｏｎＴｒ印ＭａｓｓＳｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ．Ｊ．ＭａｓｓＳｐｅｃｔｒｏｍ．２００１，３６，１２０３－１２１０．ＲＪ，ＣｒｏｌｅｙＴＲ，ＭｅｔｃａｌｆｅＣ６４．ＨｕｇｈｅｓＤ，ＭａｒｃｈＲＥ．ＡＴｅｎｄｅｍＭａｓｓＳｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｉｃＳｔｕｄｙｏｆＳｅｌｅｃｔｅｄＣｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃＦｌａｖｏｎｏｉｄｓ．１１１ｔ．Ｊ．ＭａｓｓＳｐｅｃｔｒｏｍ．２００１，２１０／２１１，３７１—３８５６５．ＨｖａｔｔｕｍＥ，ＥｋｅｂｅｒｇＤ．ＳｔｕｄｙｏｆｔｈｅＣｏｌｌｉｓｉｏｎ·ＩｎｄｕｃｅｄＲａｄｉｃａｌＣｌｅａｖａｇｅｏｆＦｌａｖｏｎｏｉｄＧｌｙｃｏｓｉｄｅｓＵｓｉｎｇＮｅｇａｔｉｖｅＥｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙＩｏｎｉｚａｔｉｏｎｄｒｕｐｏｌｅＭａｓｓＳｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ．Ｊ．ＭａｓｓＳｐｅｃｔｒｏｍ．２００３，３８，４３—４９．６６．ＪａｎＦＳ，ＣｒｉｓｔｏｂａｌＬＭｉｒａｎｄａ，ＫｉｒｓｔｅｎＲＷｂｌｔｈｅｒｓ，ＭｉｃｈａｅｌＴａｎｄｅｍＱｕａＳｃｈｉｍｅｒｌｉｋ，ＭａｘＬＤｅｉｎｚｅｒ，ＤｏｎａｌｄＲＢｕｈｌｅｒ．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄｉｎｖｉｔｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌａｃｔｉｖｉｔｅｓｏｆｈｏｐｐｒｏａｎｔｈｏｃｙａｎｉｄｉｎｓ：ｎｉｔｒｏｇｅｎｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎｏｆＮｎｏｓａｃｔｉｖｉｔｙａｎｄｓｃａｖｅｎｇｉｎｇｏｆｒｅａｃｔｉｖｅｓｐｅｃｉｅｓ．Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌａｎｄｆｏｏｄｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００２，５０：３４３５－３４４３６７．ＪｉａｎＨａｒｔ，ＭｉｎＹｅ，ＭａｎＸｕ，ＪｉａｎｇｈａｏＳｕｎ，ＢａｏｒｏｎｇＷａｎｇ，ＤｅａｎＧｕｏ．ＣｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆｆｌａｖｏｎｏｉｄｓｉｎｔｈｅｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌＣｈｉｎｅｓｅｈｅｒｂａｌｍｅｄｉｃｉｎｅ．Ｈｕａｎｇｑｉｎｂｙｌｉｑｕｉｄｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙｃｏｕｐｌｅｄｗｉｔｈｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙｉｏｎｉｚａｔｉｏｎｍａｓｓｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ．６８．Ｌ．Ｌ．Ｍａｋａｒｓｈｉｎ．ＥｆｆｅｃｔｏｆＤＰＰＨｒａｄｉｃａｌａｄｓｏｒｐｔｉｏｎｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓｏｆＨＴＳＣｂｉｓｍｕｔｈｏｎｔｈｅｓｕｐｅｒｃｏｎｄｕｃｔｉｎｇＬｅｔｔｅｒｓ，２０００，ｃｅｒａｍｉｃｓ．ＣｈｅｍｉｃａｌＰｈｙｓｉｃｓ（３２７）：１７６—１８０６９．ＭａＷＪ，ＣａｏＥＨ，ＱｉｎＪＥＰｈｅｎａｎｔｈｒｏｌｉｎｅ—Ｃｕｃｏｍｐｌｅｘ－ｍｅｄｉａｔｅｄｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅｏｆＤＮＡａｎｄｉｔｓｐｏｔｅｎｔｉａｌｕｓｅｉｎａｎｔｉｏｘｉｄａｔｉｏｎｅｖａｌｕａｔｉｏｎ．ＪＰｈｏｔｏｃｈｅｎｌＰｈｏｔｏｂｉｏｌＢ：Ｂｉｏｌｏｇｙ，１９９８，４４：６３—６８７０．ＭａＹＬ，ＣｕｙｃｋｅｎｓＦ，ＶａｎｄｅｎＨｅｕｖｅｌＨ．，ＣｌａｅｙｓＭ．ＭａｓｓＳｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｉｃＭｅｔｈｏｄｓｆｏｒｔｈｅＣｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎａｎｄＤｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｏｆＩｓｏｍｅｒｉｃ０－ｄｉｇｌｙｃｏｓｙｌＦｌａｖｏｎｏｉｄｓ．Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍ．Ａｎａｌ．２００１，１２，１５９－１６５７１．ＭａｆｉａＰＧＲｉｔａＤＰ，ＶａｌｅｒｉａＤＡ．ＥｖａｌｕａｔｉｏｎｏｆｅｘｔｒａｃｔｓａｌｌａｎｄｉｓｏｌａｔｅｄｆｒａｃｔｉｏｎｆｒｏｍｃａｐｐａｒｉｓｓｐｉｎｏｓａＬ．ｂｕｄｓａｓ５０：１１６８—１１７１ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔｓｏｕｒｃｅ．ＡｇｒｉｃＦｏｏｄＣｈｅｍ，２００２，７２．Ｎａｋａｓｕｇｉ，Ｔ，Ｎａｋａｓｈｉｍａ，Ｍ．，Ｋｏｍａｉ，Ｋ．ＡｎｔｉｍｕｔａｇｅｎｓＬｅｖｉ．ｅｔｉｎｇａｉｙｏｕ（ＡｒｔｅｍｉｓｉａａｒｇｙｉＶａｎｔ．）．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌｏｎａｎｄＦｏｏｄＣｈｅｍｉｓｔｒｙ．２０００，４８，３２５６－３２６６７３．ＯｙａｉｚｕＭ．Ｓｔｕｄｉｅｓｐｒｏｄｕｃｔｓｏｆｂｒｏｗｎｉｎｇｒｅａｃｔｉｏｎ：ａｎｔｉｏｘｉｄａｔｉｖｅａｃｔｉｖｉｔｉｅｓｏｆｐｒｏｄｕｃｔｓｏｆｂｒｏｗｎｉｎｇｒｅａｃｔｉｏｎ３０７ｐｒｅｐａｒｅｄｆｒｏｍｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｅ．ＪｐｎＪｎｕｔｒ，１９８６，４４：７４．ＲｅｎｅＴｏｒｔｅｓ，ＦｒａｎｃｅＦａｉｎｉ，ＢｒｅｎｄａＭｏｄａｋ，ｅｔ６１ａ１．Ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔａｃｔｉｖｉｔｙｏｆ华中农业人学２００８届硕ｌｊ学位论文ｃｏｕｍａｒｉｎｓａｎｄｆｌａｖｏｎｏｌｓｆｒｏｍｔｈｅｒｅｓｉｎｏｕｓｅｘｕｄａｔｅｏｆＨａｐｌｏｐａｐｐｕｓｍｕｌｔｉｆｋｏｌｉｕｓ．Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００６，（６７）：９８４—９８７７５．ＲｉｃｅＥｖａｎｓＣ，ＭｉｌｌｅｒＮＪ．Ｔｈｅｒｅｌａｔｉｖｅａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔａｃｔｉｖｉｔｉｅｓｏｆｐｌａｎｔｄｅｒｉｖｅｄｐｌｏｙｐｈｅｎｌｏｉｃｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ．ＦｒｅｅｒａｄｉｃａｌＲｅｓ．１９９８，２２：３７５－３８３．７６。ＳａｔｔｅｒｆｉｅｌｄｏｎｅｓＭ，ＢｌａｃｋＤＭ，ＢｒｏｄｂｅｌｔＪＳ．ＤｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｔｈｅＩｓｏｆｌａｖｏｎｅＡｇｉｙｃＧｅｎｉｓｔｅｉｎａｎｄＤａｉｄｚｅｉｎｉｎＵｒｉｎｅＵｓｉｎｇＳｏｌｉｄ·－ＰｈａｓｅＭｉｃｒｏｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ··Ｈｉｇｈ－－ＰｅｒｆｏｒｍａｎｃｅＬｉｑｕｉｄＣｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ－－ＥｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙＩｏｎｉｚａｔｉｏｎＭａｓｓＳｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ．Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ｂ２００１，７５９，３３＿４１．７７．ＳｉｎｇｌｅｔｏｎＶＬ，ＲｏｓｓｉＪＡ．Ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｙｏｆｔｏｔａｌｐｈｅｎｏｌｉｃｓｗｉｔｈｐｈｏｓｐｈｏｍｏｌｙｂｄｉｃｐｈｏｓｐｈｏｔｕｎｇｓｔｉｃａｃｉｄｒｅａｇｅｎｔ．ＡｍＪＥｎｏｌＶｉｔｉｃ，１９６５，１６：１４４—１５８７８．Ｓｐｒｉｇ【ｒｉｄｈａｒＫｒａｄｉｃａｌＮａｉｒＫＭ，ＳｕｂｒａｍａｎｉａｎＲ．Ｏｒａｌｒｅｐｌｅｔｉｏｎｏｆｉｒｏｎｉｎｄｕｃｅｓｆｒｅｅａｌｔｅｒａｔｉｏｎｉｎｔｈｅｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｔｒａｃｔｏｆｒａｔ．Ｍｏｌｃｅｌｌｂｉｏｃｈｅｍ，ｍｅｄｉａｔｅｄ２００１，２１９：９１－９８７９．ＴａｎＲｅｎｘｉａｎｇ，ＪｉａＺｈｏｎｇｉｉａｎ．ＥｕｄｅｓｍａｎｏｌｉｄｅｓａｎｄｏｔｈｅｒｃｏｎｓｔｉｔｕｅｎｔｓｆｒｏｍＡｒｔｅｍｉｓｉａａｒｇｙｉ．ＰｌａｎｔＭｅｄｉｃａ，１９９２，５８（４）：３７０８０．ＷａｒｉｄｅｌＰ，ＷｏｌｆｅｎｄｅｒＬ，ＮｄｊｏｋｏＫＥｖａｌｕａｔｉｏｎＩｏｎ－－ｔｒａｐｏｆＨｏｂｂｙＫＲ，ＭａｊｏｒＨＪ，ＨｏｓｔｅｔｔｍａｎｎＫ。ＳｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙＤｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎａｎｄｏｆＱｕａｄｒｕｐｏｌｅＴｉｍｅ－ｏｆ－ＦｌｉｇｈｔＴａｎｄｅｍｆｏｒＭａｓｓｔｈｅＭｕｌｔｉｐｌｅ··ＳｔａｇｅＭａｓｓＳｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙＣ·ｇｌｙｃｏｓｉｄｉｃＦｌａｖｏｎｏｉｄ８１．ＹｕｊｉｅＦｕ，ＹｕａｎｇａｎｇＩｓｏｍｅｒｓ．Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ａ２００１，９２６，２９＿４１．Ｌｉｕ，ＣｈｕｎｌｉａｎＺｕ，ＷｅｉＨｏｕ，ＬｉｙａｎＣｈｅｎ，ＳｈｕａｎｇｒｎｉｎｇＬｉ，ＸｉａｏｇｕａｎｇＳｈｉ，ＭｅｉｈｏｎｇＴｏｎｇ．Ｐｒｅｐａｒａｔｉｖｅｓｅｐａｒａｔｉｏｎｏｆｖｉｔｅｘｉｎａｎｄｉｓｏｖｉｔｅｘｉｎｆｒｏｍｐｉｇｅｏｎｐｅａｅｘｔｒａｃｔｓｗｉｔｈｍａｃｒｏｐｏｒｏｕｓｒｅｓｉｎｓ．ＣｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙＡ，２００７，（１１３９）：２０６—２１３８２．ＺｈａｏｆｒｅｅＫＹｕ彤ＷａｎｇＤ，ＬｉａｎｇＸ，ＨｕＴ．Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆｒａｄｉｃａｌｓｃａｖｅｎｇｉｎｇａｂｉｌｉｔｉｅｓｏｆ‘ｔｅａｐｉｇｍｅｎｔｓ’ａｎｄｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｗｉｔｈ‘ｔｅａｐｏｌｙｐｈｅｎｏｌｓ’．ＦｏｏｄＣｈｅｍ，２００３，８０：１１５—１１８６２艾高黄酬的提取分离纯化、结构搭定及ｌｅ抗瓴化十牛研究致谢本论文是在导师孙智达教授的悉心指导下完成的。导师丌阔的思路、渊博的学识，严谨的治学态度，忘我的工作作风，精益求精的科研风格，诲人不倦的精神，高尚的为人风范都给我留下了深刻印象，是我终生学习的楷模。在论文的完成过程中，孙老师倾注了无数心血，对论文的选题，提纲的确定，文章的基本思路等进行了细微的指导，提出宝贵意见。同时他坦荡仁厚的怀襟，平和的生活作ＪｘＬ时刻影响着我。他父亲般的关怀和鼓励，如和煦的春风温暖我的心。在此谨向导师致以最真挚的敬意和感谢！特别感谢谢笔钧老师、戚向阳老师、杨尔宁老师、黄艳春老师、孙文莉老师、刘晓宇老师等所给予的大力支持与帮助。衷心感谢师姐张瑞巧、王静、师兄朱学良在科研和学习上给予的指导。感谢师妹谢碧秀、程海燕、赵娜、肖娟、周玮靖、禹华娟、师弟何会、宋哲、岳晶念、刘合生、曹品豹、徐托明在实验过程中给予的全力协助。感谢郝强、王世永、刘传菊、吕静等同学的友情相助。感谢室友郝菊芳、李蕙蕙，感谢经管学院的孙林成、凌雪冰、邹文涛、吴佳莉、万开亮、陈哲育、王红斌等研究生阶段的朋友们，感谢他们在同常生活中对我的照顾，感谢他们走进我的生命，让我的研究生生活变得充实而又有意义。最后深深感谢我的父母、亲人，感谢他们无私的奉献、辛勤的付出、全力的支持。总之，感谢所有关心和支持我的人你们将是我一生的良师和益友。天姻ｐ吴娜２００８年４月２３同于武汉狮子山华中农业人学２００８届顾ｌ：学位论文附录攻读硕士期间撰写论文情况：１．吴娜，张瑞巧，孙智达．大孔树脂分离纯化艾蒿黄酮的研究，食品科技，２００８，（１）：１６０．１６３２．吴娜，张瑞巧，孙智达．艾蒿中黄酮类化合物的提取工艺研究，食品工业科技，２００８，２９（１）：２３０．２３２３．吴娜，张瑞巧，孙智达．艾蒿黄酮体外抗氧化及保护ＤＮＡ受损伤活性研究，食品科学，２００８，８艾蒿黄酮的提取分离纯化、结构鉴定及其抗氧化性研究

作者：

学位授予单位：

吴娜

华中农业大学

1.期刊论文 李红艳.唐世荣.郑洁敏 两种生长在铜矿渣上的菊科植物的铜含量 -农村生态环境2003,19(4)

对生长于云南鸡冠山铜矿渣上的艾蒿(Artemisia argyi)和湖北铜绿山铜矿渣上的滨蒿(Artemisia scoparia)进行调查和铜含量测定,结果表明,2种菊科植物具有比较高的生物量,均为铜矿区的优势植物,其根周围土壤的铜含量高.艾蒿根和叶的铜含量都较高,其根部铜含量为41～156 mg*kg-1,平均83±29 mg*kg-1;叶部铜含量为58～464 mg*kg-1,平均216±96 mg*kg-1.滨蒿根部铜含量较高,其变化范围为58～513 mg*kg-1,平均183±101 mg*kg-1,而茎叶部铜含量相对于根部较低,为42～259 mg*kg-1,平均97±52 mg*kg-1(含铜量均以干重计).研究还发现,2种植物对铜的耐受机制不同,艾蒿表现出较强的蓄积铜的潜力,而滨蒿表现出对铜污染土壤的植物固定潜能,因此2者均可作为植物修复铜污染土壤的先锋物种.

2.期刊论文 20种菊科植物不同器官的化感活性研究 -安徽农业科学2009,37(30)

[目的]测定20种菊科植物不同器官对受体植物生菜的化感活性.[方法]采用琼脂混粉法.[结果]在10 g/L的粉末添加浓度下,所有的供试植物器官粉末均对受体植物生菜幼苗的生长产生了不同程度的抑制作用,且对胚根生长的抑制明显高于对胚轴生长的抑制.其中,1年蓬和小刺儿菜的叶、花、根和茎,向日葵、抱茎苦荬莱、苍耳和醴肠的叶,艾蒿、苣荬莱、野塘蒿、泥胡菜、苦苣菜和万寿菊的花,细叶鸭葱的根、叶和花,艾蒿和苣英莱的茎,以及苦莱的叶、茎和花等器官粉末对生菜胚根的生长具有较高的抑制活性;1年蓬的叶和花,小飞蓬和泥胡莱的花,向日葵的叶,小刺儿菜的根以及艾蒿的茎和花等器官对胚轴的生长也具有较高的抑制活性.[结论]20种菊科植物部分器官具有高化感活性.

3.期刊论文 胡园园.杨霞.陈发扬.时伟.HU Yuan-yuan.YANG Xia.CHEN Fa-yang.SHI Wei 铜矿区几种菊科植物的重金属含量测定 -资源开发与市场2009,25(7)

对生长在铜陵铜官山矿区的5种菊科植物,小飞蓬、艾蒿、野艾蒿、苍耳、山苦荬进行了重金属含量测定,并测定了其根部土壤中的重金属含量.结果表明,苍耳的地下部分含铜量最大,为51.28-95.35 mg/kg;山苦荬的地下部分含铜量最小,为15.44-16.60 mg/kg;苍耳体内这4种重金属的含量均较高,具有较强的吸收和富集能力.小飞蓬、艾蒿和野艾蒿样品中的重金属含量没有苍耳高,但由于这几种植物对铜有较强的转运能力,且在矿区恶劣的自然条件下仍能大量生长,所以也可作为矿区生态修复的选择物种.

4.期刊论文 彭克俭.刘益贵.邓小鹏.沈振国.PENG Ke-jian.LIU Yi-gui.DENG Xiao-peng.SHEN Zhen-guo 湘西铅锌矿区的菊科植物及其对重金属的积累 -亚热带资源与环境学报2009,4(4)

对湖南湘西铅锌矿区的菊科植物进行了2次调查,采集了大量土壤和植物样品,分析了样品中Cd、Pb、Zn和Cu的含量.样方法调查结果表明,调查区内常见的菊科植物共有20种,万民岗、李梅、大田湾及三立分别有10种、17种、9种、5种,所有菊科植物Cd、Pb、Zn和Cu的平均含量分别为34.1、104.0、744.0和15.0 mg·kg-1,其中有4种如苍耳 (Xanthium sibiricum)、野艾蒿(Artemisia umbrosa)、鬼针草(Bidens bipinnata)和醴肠 (Eclipta

prostrata),Cd含量超过了100 mg·kg-1.多点单株采样分析的结果表明,三叶鬼针草、鬼针草和醴肠3种植物叶片Cd的平均含量分别为49.7、90.6和102.0mg·kg-1,平均富集系数分别为2.04、3.01和22.3,分别有78%、80%和100%的样品转移系数大于1,这些结果表明鬼针草和醴肠可能具有超富集Cd的潜力.

5.期刊论文 孟昭群 艾叶治病验方 -家庭医学2006(7)

艾叶又名艾蒿、蕲艾、灸草,为菊科植物艾的干燥叶.艾叶在夏季花未开时采摘,除去杂质及梗,筛去灰屑,晒干备用.

6.期刊论文 徐芙清.何伟.郑星.张维昊.蔡伟伟.唐倩.XU Fuqing.HE Wei.ZHENG Xing.ZHANG Weihao.CAI Weiwei.TANG Qian 野艾蒿及其有机提取物对铜绿微囊藻生长的抑制作用 -生态学报2010,30(3)

通过植物与藻共培养实验,比较3种常见陆生菊科植物野艾蒿(Artemisia lavandulaefolia)、小白酒草(Conyza canadensis)、杭白菊

(Chrysanthemum morifolium)的抑藻能力.结果表明野艾蒿和小白酒草能够适应水培,野艾蒿和杭白菊(后期为残体)抑藻能力较强,10d后对起始藻浓度为2× 10~6 cells/ml的铜绿微囊藻(Microcystic aeruginosct)生长的抑制率分别为93.3%和90.8%,对4×10~6 cells/ml铜绿微囊藻抑制率分别为89.3%和79.2%.利用3种极性不同的有机溶剂(乙醇、正己烷、乙酸乙酯)提取野艾蒿干粉中的抑藻活性物质并进行生物检测,结果显示挥干溶剂后3种提取物都有较强抑藻能力,其中乙酸乙酯提取物抑藻能力最强,用线性拟合得到0.83s/L提取物72h后抑藻率达100%.研究表明,陆生菊科植物具有抑藻效果,野艾蒿具有应用于水体富营养化的治理和开发新型抑藻剂的潜力.

7.期刊论文 林锦明.秦路平.赵卫权.陈瑶.郑汉臣 艾叶及其同属植物的差热分析鉴别及燃烧热比较 -第二军医大学学报2000,21(10)

艾叶为菊科植物艾Artemisia argyi Levl.et Vant.的干燥叶,具有散寒止痛、温经止血功能,常用于治疗小腹冷痛、经寒不调、宫冷不孕、崩漏经多和妊娠下血等症[1 ].虽然药典收载的艾叶只有一种,但由于种种原因,其同属植物五月艾、野艾蒿、北艾、魁蒿等在不同地区也作艾叶药用.虽然它们外观相似,但所含成分的种类、含量不尽相同 ,功效及用途也各有侧重,很有必要对它们加以鉴别.为此,我们探索应用差热分析法(DTA ),分别对它们进行热图谱扫描,获得了各具特征的热谱曲线,取得很好的鉴别效果,现介绍如下.

8.期刊论文 司升云.刘小明.周利琳.李双梅 蒌蒿菊天牛的识别与防治 -长江蔬菜2009(5)

蒌蒿别名芦蒿、藜蒿、水蒿、香艾蒿等,属菊科蒿属多年生草本植物,近几年在我国江苏、浙江、江西、湖北、安徽等地开始人工种植,已成为一种地方特色蔬菜,市场需求量日益增多.菊天牛Phytoecia rufiventris Gautie,别名菊小茼天牛、菊虎等,属鞘翅目天牛科,在我国大部分地区均有分布,主要为害菊科植物,是菊花、紫菀等菊科药用或观赏植物的主要害虫,也为害蒌蒿等蔬菜种类,可对蒌蒿的留种与生产造成严重为害.

9.期刊论文 杜森有 种鸡饲料中添加艾叶粉对蛋质量的影响 -饲料研究2008(2)

艾叶(别名艾蒿、灸草和狼尾蒿子)为菊科植物艾或同属植物野艾的叶子,于春夏季采摘,阴干或晒干,去掉绒毛,粉碎贮备.艾叶含挥发油和芳香油,并富含蛋白质、矿物质、多种必需氨基酸、胡萝卜素、泛酸、胆碱及VB、VB2和VC等.

10.学位论文 孔宁川 交让木等三种植物化学成分研究 2008

本文对采自江西庐山地区的虎皮楠科植物交让木、河南骡河地区的菊科植物艾蒿以及云南思茅地区的马鞭草科植物大叶紫珠的化学成分进行了系统的研究，利用各种柱层析和高效液相色谱等分离手段从上述植物中分离了68个化合物，并通过现代波谱技术、单晶X-衍射、有机合成等方法鉴定了这些化合物的结构。

从交让木果实中分离了31个生物碱，其中13个为新生物碱，通过研究发现几个分属于不同骨架类型的虎皮楠生物碱具有较好的抑制PAF诱导的血小板聚集活性；此外还从果实中分离出了一个结构新颖的小分子氧杂笼状化合物，并对该化合物左旋和右旋体进行了不对称全合成，通过比较合成体与天然体的旋光方向和比旋光度，确定了天然体氧杂笼状化合物的绝对构型。

从艾蒿中分离了28个化合物，化合物类型涉及多种骨架类型的倍半萜、黄酮、香豆素、三萜、咖啡酸衍生物等，其中包括两个没药烷型新倍半萜和一个愈创木烷型倍半萜衍生物的新化合物。从大叶紫珠中分离出了9个化合物，化合物类型涉及酚性化合物、甾体等。本文的最后对河豚毒素的研究概括进行了综述。

本文链接：http://d.g.wanfangdata.com.cn/Thesis_Y1394909.aspx

授权使用：浙江工业大学图书馆(zjgydxtsg)，授权号：b33ff3ab-baeb-40c9-a41a-9e8f01468f74

下载时间：2011年2月19日