溶氧浓度对谷氨酸发酵关键酶的影响

溶氧浓度对谷氨酸发酵关键酶的影响

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郜　培1　陆静波1　段作营1　毛忠贵1　史仲平1,2

1(江南大学生物工程学院,无锡,214036)　2(江南大学工业生物技术教育部重点实验室,无锡,214036)

摘　要　谷氨酸发酵中,不同溶氧条件对产物谷氨酸和主要副产物乳酸的生成积累影响很大。文中研究了不同溶氧条件下和几种非正常条件下的谷氨酸发酵中主要关键酶(谷氨酸脱氢酶和乳酸脱氢酶)的变化规律,为谷氨酸发酵的进一步优化和控制提供了基础数据。

关键词　谷氨酸脱氢酶(GDH),乳酸脱氢酶(LDH),溶氧水平,谷氨酸发酵

　　谷氨酸发酵是氮素同化的过程,氮的同化是关键

步骤。实验证明,在谷氨酸生产菌中,谷氨酸脱氢酶(GDH)的活力很强,氮的同化主要是以谷氨酸脱氢酶催化的,它是谷氨酸合成中的关键酶。谷氨酸脱氢酶以NADPH作为辅酶催化α2酮戊二酸转变成谷氨酸,这个反应是可逆的[1,2]。

α2酮戊二酸+NH3+NADPHΖ谷氨酸+NADP

谷氨酸脱氢酶(Glutamatedehydrogenase,GDH)是1种依赖辅酶的脱氢酶,它分为NADH依赖型(EC11141112)、NAD(P)H依赖型(EC11141113)和NADPH依赖型(EC11141114),广泛存在于动物、植

于辅酶从复合物上的解脱速率,其催化动力学反应机

制为严格的顺序催化机制[6,7]。

文中研究了在不同溶氧条件下进行谷氨酸发酵过程中谷氨酸脱氢酶和乳酸脱氢酶的酶活变化,以确定溶氧水平对谷氨酸发酵中关键酶的影响。

1　材料和方法111　菌　种谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)S9114,本实验室保存菌株。112　培养基

种子培养基组成(g/L):C6H12O6・H2O25,K2HPO4115,MgSO4016,MnSO401005,FeSO401005,玉米浆25,尿素215(单独灭菌加入)。pH710

物和微生物中,在氮代谢中具有重要作用。近年来,对于谷氨酸发酵过程中谷氨酸脱氢酶酶活的影响因素已经做过一定的研究。宋香等做了CeCl3对谷氨酸棒杆菌S9114生长和谷氨酸脱氢酶的影响的研究[3];张克旭等做了不同温度、pH对谷氨酸脱氢酶的影响的研究[4];Zhuang等做了镧系金属离子对谷氨酸脱氢酶活性的影响机理的研究[5]。

乳酸脱氢酶(Lactatedehydrogeanase,LDH)广泛存在于动物组织和各种微生物细胞内,它催化糖酵解的最后一步反应,即丙酮酸向乳酸的转化。无论是在高等动物还是低等动物中,LDH均是借助辅酶烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+/NADH)的作用可逆地催化丙酮酸与乳酸的转化反应,其反应方程式如下[6]:

丙酮酸+NADH]乳酸+NAD+

在该反应中,LDH必须先与辅酶结合才能与底物结合催化反应进行,反应完成后,底物先从酶的活性位点释放下来后,辅酶才被释放,故称之为NADH/NAD+依赖型脱氢酶。LDH的催化速率取决

　第一作者:硕士研究生。

3江苏自然科学基金资助项目(No.BK2003021)　收稿日期:2005-06-13,改回日期:2005-08-05

～712。

发酵培养基组成(g/L):C6H12O6・H2O140,K2HPO4110,MgSO4016,MnSO401002,FeSO401002,硫胺素510×10-5,玉米浆15,尿素310(单独灭菌加入)。pH710～712。113　发酵和培养条件

种子培养条件:从活化斜面接2环于种子培养基中,在32℃、200r/min条件下培养8～10h,镜检细胞正常无杂菌。

发酵及其发酵罐控制条件:发酵在5L发酵罐(BIOTECH25BG,上海保兴生物设备公司产),32℃下进行,实际发酵液量控制在312～314L左右。根据需要通过自动调节搅拌转速将溶解氧浓度DO控制在10%～50%的水平,罐压保持在0107MPa。自动添加质量分数为25%的氨水将pH控制在711±011的水平,同时为谷氨酸合成提供氮源,保证整个发酵过程氮源过量和充足。根据需要间歇式地添加质量分数为50%的葡萄糖,控制发酵液中的葡萄糖浓度在15g/L以上。

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2005Vol.31No.10(Total214)生产与科研经验

114　离线参数测定

葡萄糖、谷氨酸和乳酸的浓度由SBA240B生物传感仪(山东省科学院生物研究所产)测定,菌体浓度(OD620)用分光光度计(UV22100,尤尼柯上海仪器有限公司)以灭菌后的初始发酵液为参比液,在620nm波长下测定。115　粗酶液的制备

菌悬液的制备:发酵过程中按一定时间间隔采集发酵液,1800r/min离心10min去除沉淀,再经8000r/min离心10min收集菌体。用pH715、50mmol/LTris2HCl缓冲液(内含DTT、EDTA等)于4℃洗涤菌体2次后振荡得菌悬液。菌悬液(约50mg菌体蛋白/mL)置冰浴,超声波破碎10min。处理液在4℃经10000r/min离心20min,上清液即为粗酶液。116　酶活测定方法

GDH酶活测定:3mL测定液内含α2酮戊二酸1313mmol/L,NH4Cl15mmol/L,NADPH1167mmol/L,以及适量酶液混合后37℃下进行反应,在UV22100上用石英杯在340nm测定反应开始后1min内的光吸收变化值。酶活单位定义:在37℃、pH715的反应条件下,每分钟生成1μmolNADP所

图1　不同溶氧条件下的谷氨酸浓度变化曲线

图2　不同溶氧条件下的乳酸浓度变化曲线我们推测这可能与不同溶氧条件下谷氨酸脱氢酶和乳酸脱氢酶的酶活大小有关,为此我们测量了不同溶氧条件下的谷氨酸脱氢酶的酶活以验证上述试验现象。212　不同溶氧条件对GDH和LDH的影响

需的酶量,以NADPHμmol/min表示。

LDH酶活测定:3mL测定液内含丙酮酸钠01757mol/L,NADH1167mmol/L,以及适量酶液混合后37℃下进行反应,在UV22100上用石英杯在340nm测定反应开始后1min内的光吸收变化值。

酶活单位定义:在37℃、pH715的反应条件下,每分钟生成1μmolNAD变化所需的酶量,以NADHμmol/min表示。

2　结果与讨论

211　不同溶氧条件对谷氨酸发酵的影响

图3　不同溶氧条件下谷氨酸脱氢酶酶活变化曲线

图1和图2所示的分别是在不同溶氧条件下的谷氨酸发酵的谷氨酸浓度和乳酸浓度的变化曲线图。从图1中可以看出,溶氧水平对谷氨酸发酵中谷氨酸的生成量有很大的影响。低溶氧(DO=10%)控制条件下,谷氨酸生成速度明显比高溶氧(DO=50%)条件下要高,并且最终谷氨酸浓度也比高溶氧条件下的高;从图2可以看出,低溶氧(DO=10%)控制条件下,主要代谢副产物乳酸的生成速度比高溶氧条件下要高出许多,乳酸积累量也很大,而高溶氧条件下则积累很少。

图3所示的是不同溶氧(DO=10%和DO=50%)条件下谷氨酸脱氢酶的酶活曲线图。从图3可以看出,高溶氧条件下,产酸中后期GDH的酶活下降很快,这可能是由于在高溶氧条件下,剧烈的通气和搅拌加剧了菌体的死亡速度和发酵活性的衰减。

图4所示的是不同溶氧(DO=10%和DO=50%)条件下乳酸脱氢酶的酶活曲线图。从图4可以看出,高溶氧条件下,LDH酶活明显比低溶氧条件下的LDH酶活要低,有报道认为,一定的厌氧环境对于乳酸脱氢酶的酶活有利[8]。213　非正常发酵条件对GDH和LDH的影响

为了验证溶氧对于GDH和LDH的影响是否可

2005年第31卷第10期(总第214期)　73

食品与发酵工业FOODANDFERMENTATIONINDUSTRIES

用氨水代替NaOH调pH。

图4　不同溶氧条件下乳酸脱氢酶酶活变化曲线

逆,设计了2批非正常发酵进行验证。

第1个非正常发酵的控制策略:首先将DO控制在30%,当发酵进入产酸期后的第12h,人工调低搅拌转速使DO脱离自动控制状态。DO迅速降低到0%的极端缺氧水平。由于氧气的极度匮乏,谷氨酸生产根本无法进行。当发酵进行到18h后,重新启动DO的自动控制并将其控制水平恢复到30%。图5所示的是此次发酵的过程参数。从图中可以看出,在极端缺氧的6h里谷氨酸浓度几乎没有增加,而乳酸大量积累;当溶氧水平恢复到30%之后,谷氨酸不能再恢复增长,说明菌体已经没有产谷氨酸的活力了。

A-人工调低搅拌转速使DO降低至0%B-启动DO自动控制恢复DO水平至30%

图6　发酵中期极端缺氧条件下GDH和LDH

酶活变化曲线

图7所示的是在氮饥饿条件下进行发酵的过程参数。从图中可以看出,在氮源消耗殆尽的时候谷氨酸的浓度不再增加,这是因为谷氨酸的合成需要铵根离子的参与,当重新用氨水流加以后,谷氨酸的浓度开始有所恢复,但最终停留在50g/L的较低水平。

A-切断氮源供给,用NaOH替代氨水调节pH

B-恢复氮源供给,用氨水调节pH

图7　氮饥饿条件下谷氨酸发酵过程参数曲线图

A-人工调低搅拌转速使DO降低至0%B-启动DO自动控制恢复DO水平至30%

图5　发酵中期极端缺氧条件下谷氨酸和

乳酸浓度变化曲线图

图6所示的是此次发酵的GDH和LDH酶活曲线图。从图中可以看出,GDH酶活在缺氧之后迅速下降,而且溶氧恢复到30%水平的时候其酶活也不能得到恢复,而LDH酶活在极端低溶氧情况下则表现出较高的活力。

第2个非正常发酵的控制策略是,将DO控制在30%,当发酵进入产酸期后的第10h,将流加氨水改

A-切断氮源供给,用NaOH替代氨水调节pH

B-恢复氮源供给,用氨水调节pH

图8　氮饥饿条件下GDH和LDH酶活变化曲线

为流加10mol/L的NaOH,氨水在发酵过程中既作为氮源又作为调节pH的碱性物质,当换成NaOH后相当于中断了氮源供给。当发酵进行到第13h,发酵液中氮源已消耗殆尽,维持这种情况6h后,重新使　74

2005Vol.31No.10(Total214)图8所示的是在氮饥饿条件下进行发酵的GDH和LDH酶活的曲线图。从图中可以看出GDH在切断氮源的这段时间内并没有失去活力,酶活虽然有所下降但是当恢复氮源供应以后酶活有一定的恢复,谷氨酸合成的终止是由于底物匮乏造成的,而LDH的

生产与科研经验

酶活并没有太大的变化。2　于信令1味精工业手册[M]1北京:中国轻工业出版社,

1995

3　宋　香,王燕,段作营,等1氯化亚铈对谷氨酸棒杆菌

S9114生长和几种脱氢酶活性的影响[J],食品工业科技12004,25(3):51～52

4　张克旭,刘永生1天津短杆菌T6213谷氨酸脱氢酶的研究

[J]1微生物学报,1991,31(4):281～286

5　Qian2KunZhuang,Huai2ChengDai,etal,Electrochemical

studiesoftheeffectoflanthanideionsontheactivityofgluta2matedehydrogenase[J]1Bioelectrochemistry,2000,52:37～41

6　GarvieIE.Bacteriallactatedehydrogenase[J]1Microbiol

Rev,1980,44:106～139

7　汪建军,王立艳,杨海麟,等1L2乳酸脱氢酶生产菌的选育及产酶条件[J]1无锡轻工大学学报,2004,23(2):36～398　AngelikaLongacre,JacquelineMReimers,JamesEGannon,

etal1FluxanalysisofglucosemetabolisminRhizopusoryzaeforthepurposeofincreasinglactateyields[J]1FungalGenet2icsandBiology,1997,21:30～393　结　论

通过上述对谷氨酸发酵过程中溶氧水平对谷氨

酸脱氢酶和乳酸脱氢酶酶活的影响的研究,可以看出极端缺氧的条件对谷氨酸脱氢酶造成的影响是不可逆的;低溶氧对保持谷氨酸脱氢酶的酶活有利,但是这也造成乳酸脱氢酶活力的提高,使得代谢副产物乳酸大量积累,所以应该把溶氧控制在适当的水平,在保持谷氨酸脱氢酶较高活力的同时尽可能的降低乳酸脱氢酶的酶活。寻找这个最佳溶氧策略将是下一步要进行的工作。

参

考

文

献

1　黄程芳,赵宗健,程玉华1谷氨酸生产菌AS11299谷氨酸脱氢酶的研究[J]1吉林大学自然科学学报,1984,(4):

103～106

EffectsofDissolvedOxygenontheKeyEnzymesinGlutamateFermentationGaoPei1　LuJingbo1　DuanZuoying1　MaoZhonggui1　ShiZhongping1,2

1(SchoolofBiotechnology,SouthernYangtzeUniversity,Wuxi,214036China)

2(KeyLaboratoryofIndustrialBiotechnology,MinistryofEducation,SouthernYangtzeUniversity,Wuxi,214036,China)

ABSTRACT　Theexperimentaldatainglutamatefermentationshowedthat,dissolvedoxygenlevellargelyaffectthesynthesisofglutamateandothermajorby2product(lactate)1Thispapermainlydiscussesthechangingpatternsofglutamatedehydrogenaseandlactatedehydrogenaseactivitiesunderdifferentdissolvedoxygenlevels1Thisstudyprovidesessentialdataforon2linecontrollingandoptimizationofglutamatefermentationprocesses1

Keywords　glutamatedehydrogenase(GDH),lactatedehydrogenase(LDH),dissolvedoxygenlevel,glutamatefermentation

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