水稻低丰度表达基因OsAMT1_3实时荧光定量PCR方法的建立及其应用

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水稻低丰度表达基因OsAMT1;3实时荧光定量PCR方法的建立及其应用

孙淑斌　李宝珍　胡　江　徐国华3

(南京农业大学资源与环境科学学院,江苏南京210095;

3

通讯联系人,E2mail:ghxu@njau.edu.cn)

EstablishmentandApplicationofaReal2TimeFluorescenceQuantitativePCRforDetectingTranscriptsofLowAbundanceGene,OsAMT1;3,inRice

SUNShu2bin,LIBao2zhen,HUJiang,XUGuo2hua

E2mail:ghxu@njau.edu.cn)

3

3(CollegeofResourcesandEnvironmentalScience,NanjingAgriculturalUniversity,Nanjing210095,China;Correspondingauthor,

Abstract:Oneoftheammoniumtransportergenesinrice,OsAMT1;3,normallyexpressedinlowabundance,whichisdif2

ficulttoquantifyitsexpressionbyusingtraditionalmethods,suchasNorthernblot,PCRtechnique.Atechniqueforreal2timequantificationofOsAMT1;3relativetoahousekeepinggeneforencodinganactininriceusingreal2timeSYBRGreenquanti2tativePCR(RQ2PCR)withspecificprimerswasestablished,whichshowed:theamplificationcurvehadflatbaseline,distinctexponentialarea,largeandstableslope;Thecoefficientofvariationofthetechniquewas0.47%;Therewasalinearrelation2shipbetweenthresholdcyclevalueatwhichsamplecrossesthresholdandthelogarithmicvalueoftemplateconcentration;TheexpressionofOsAMT1;3wasenhanced42foldbynitrogenstarvationincomparisontosupplyofammoniumassolesourceofnitrogen.

Keywords:real2timefluorescencequantitativePCR;amplificationcurve;standardcurve;ammoniumtransportergene;geneexpression;methodology

摘　要:采用实时荧光定量PCR技术,通过使用特异引物,对水稻中的低丰度表达基因OsAMT1;3进行了转录水平上的定量分析,成功建立了可检测低丰度表达基因的SYBRGreen实时荧光定量PCR技术平台。该方法具有很好的准确性和实用性。获得的荧光定量PCR扩增曲线,基线平整,指数区明显,斜率大且固定;线性范围广,17～36个循环都能测出;稳定性、重复性好,变异系数仅为0.47%;标准曲线表明,循环阈值与PCR体系中起始模板量的对数值之间有着良好的线性关系,可对基因表达进行相对定量;缺氮条件下OsAMT1;3与纯NH4+处理相比表达量增加4倍以上。

关键词:实时荧光定量PCR;扩增曲线;标准曲线;铵转运蛋白基因;基因表达;研究方法中图分类号:Q942336;Q943;Q945.12文献标识码:A文章编号:100127216(2006)0120008205

　　植物通过铵转运蛋白(ammoniumtransporter,

AMT)从土壤溶液中吸收NH4+;铵的吸收也主要是通过铵转运蛋白进行调节[1]。目前,编码铵转运蛋白基因已经在几种植物中得到了克隆与鉴定。其中,高等植物体内第一个铵转运蛋白是从拟南芥中分离得到的[1]。克隆到的各种植物NH4+转运蛋白都由多个基因组成,每个基因的吸收特征不同,调控机制也不同[2,3]。水稻中铵转运蛋白基因Os2AMT1;1、OsAMT1;2和OsAMT1;3(ammonium

transportergenes,OsAMT1)都属于AMT1家族,

ka等[5,6]又利用传统半定量reversetranscription2PCR对相同的RNA样品做了扩增,粗略地检测了

样品间的表达差异。

传统PCR可对特定核苷酸片段进行指数级扩增。在扩增反应结束之后,可以通过凝胶电泳的方法对扩增产物进行定性分析,也可以通过对光密度扫描来进行半定量分析。但是无论定性还是半定量分析,分析的都是PCR终产物,不能确保PCR产物信号与初始模板的拷贝数成比例。实时荧光定量

PCR(real2timefluorescencequantitativePCR)是在

都是高亲和铵吸收转运蛋白,都含有11个跨膜结构域。Yutaka等[5]对这3个铵转运蛋白成员的表达与功能做了较系统详细的研究,其Northernblot结果表明:OsAMT1;1mRNA在根和地上部分都可以明显检测到,OsAMT1;2仅在根中表达,且受NH4+处理强烈诱导,但是OsAMT1;3的转录没有检测到。为了研究OsAMT1;3的表达情况,Yuta2

[4]

传统PCR技术基础上发展起来的一种高度灵敏的核酸定量技术,它有效地解决了传统定量只能终点

收稿日期:2005205223;修改稿收到日期:2005209229。基金项目:国家自然科学基金资助项目(30471037);国家973计划资助项目(2005cb120903)。

第一作者简介:孙淑斌(1962-),女,博士,副教授。

孙淑斌等:水稻低丰度表达基因OsAMT1;3实时荧光定量PCR方法的建立及其应用9

检测的局限,测得未经PCR信号放大之前的起始模板量。其反应体系中,引入了一种荧光化学物质,随着PCR反应的进行,PCR反应产物不断累加,荧光信号强度也等比例增加。这样就可以根据指数扩增期的产物荧光强度来推算初始模板的量。与传统PCR方法相比,它具有定量准确可靠、灵敏度高、重复性好,而且操作简便、安全、快速等特点[7]。

实时荧光定量PCR从原理上有两大类荧光模式[8]。一是荧光杂交探针,二是双链DNA内插染料。前一种方法特异性好,除需要合成序列特异引物外,还需要合成高成本的荧光探针,成本较高;后一种方法经济,使用方便,只需合成序列特异引物,没有序列特异性,可以用于不同的模板。但正是由于荧光染料可以和任何的双链DNA结合,因此DNA引物二聚体或其他非特异扩增产物可以对结果产生干扰。我们通过摸索优化反应条件和荧光捕捉点、建立简单实用的标准曲线、用溶解曲线和凝胶电泳证实等手段,解决或弥补DNA结合染色的不足,成功建成了可检测DNA和mRNA的SYBRGreen实时荧光定量PCR技术平台。它已经成为我们实验室一种特异性、高敏感性的定量检测基因表达的有效方法。

Oligo(dT),加无RNase水补足10μL,70℃下加

热5min,室温放置5min后,依次加入RNasein2hibitor0.5μL,5×RTbuffer5μL,5mmol/LdNTPs2.5μL,M2MLVRT1μL,用无RNase水补足25μL,42℃下反应60min,70℃下加热10

min中止反应。1.3.3　定量PCR

根据水稻的OsAMT1;3(AK107204)和actin(NM_197297)的cDNA序列,按照标准荧光定量

PCR引物原则设计PCR引物:actin的正向引物为5′TTATGGTTGGGATGGGACA3′,反向引物

为5′AGCACGGCTTGAATAGCG3′,产物长度为292bp;OsAMT1;3的正向引物为5′GCGAACGCGACGGACTA3′,反向引物为5′GACCTGTGGGACCTGCTTG3′,产物长度为294

bp。各cDNA样品分别以OsAMT1;3和actin引物进行定量PCR反应。反应在96孔PCR板中进行。反应体系为20μL:iQSYBRPrimixExTaqTM(2×)10μL,5′和3′引物各0.5μL,cDNA模板2μL,无菌水7μL。配制混合物充分混匀后平均分配至96孔PCR板中。反应条件如下:95℃下30s,94℃下变性10s、54℃下退火25s、72℃下延伸30s,40次循环,72℃下延伸5min。设定在每个循环的变性期结束后,程序自动记录上一循环最后

10%时间的平均荧光值。荧光种类选择SYBRGreen490,程序将按照设定的激发和发射光谱选

1　材料与方法

1.1　材料

水稻武运粳7号发芽后移栽,全营养液培养10d,缺氮处理7d,分别进行铵态氮(NH4+)和继续缺氮处理,4d后取样。1.2　主要试剂和仪器

TrizolReagent、逆转录试剂盒、DNase均购自美国Invitrogen公司,PCR试剂购自南京生兴生物有限公司,引物由上海博亚生物技术有限公司合成,其他各种化学试剂均为进口或国产分析纯。采用BIO2RADiCycleriQ荧光定量PCR仪。1.3　实验方法

1.3.1　组织总RNA制备

择滤镜组。所有设定保存后运行程序,输入正确的

PCR体系的体积后开始运行。反应完成后,得到含所有标本的所有记录点曲线,默认分析模式称为

backgroundsubstrated,选择PCRbaselinesub2strated模式进行数据分析和修正。在调整baselinecycles和计算thresholdvalue(阈值)后,得出cyclethreshold(Ct值)。

1.3.4　标准曲线的制定与结果计算

取冻存根系组织100mg,匀浆后加入Trizol

Reagent1mL,加入0.2mL氯仿,离心后吸取上清,加入0.5mL异丙醇,离心沉淀后弃上清,用70%乙醇洗沉淀,DNaseⅠ酶解可能残余的基因组

DNA,RNA溶于DEPC水,用甲醛变性凝胶电泳

在样品扩增的同时,以实验中不同处理的

cDNA模板混合样进行系列稀释制作标准曲线[9]。本实验以NH4+和缺氮处理的混合cDNA模板进行10倍梯度稀释,以OsAMT1;3和actin特异引物进行扩增来获得标准曲线,纵坐标为临界循环值Ct,横坐标为稀释浓度的对数值。根据标准曲线所得的线性计算公式,将样品的Ct值代入公式,得到其相对浓度。同一模板中目的基因和持家基因的相对浓度的比值即可作为目的基因相对表达水平。

和分光光度计检测浓度和纯度。1.3.2　cDNA合成

每个总RNA样品取2μg,加入50μmol/L

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中国水稻科学(ChineseJRiceSci)　第20卷第1期(2006年1月)

2　结果与分析

2.1　RNA纯度和完整性分析

所提取总RNA经分光光度计检测,比值均大于1.90,经凝胶变性电泳鉴定,28S、18S条带清晰

可见,无明显降解(结果未列出)。2.2　标准曲线的建立

OsAMT1;3的表达量是相对于actin参照物的量而言的。系列浓度稀释的cDNA标准模板与Ct值的关系曲线见图1。OsAMT1;3和actin标准曲线的斜率分别为-3.945和-2.965,线性相关系数分别为0.9997和0.9958。2.3　检测基因表达的准确性

样品在BIO2RADiCycleriQ荧光定量PCR仪上进行实时定量扩增,最后得到了一条反映核酸扩增过程的S形荧光定量动力学曲线(图2)。用循环阈值(cyclethreshold,Ct)作为临界点,该点位于PCR产物消除荧光背景后进入指数增长期的始点。从图2可以看出,荧光定量动力学曲线基线平整;NTC因为没有模板,也不产生引物二聚体,一直是水平线;指数区较明显,斜率大且固定(平行线);线性范围广,17～36个循环都能测出,为理想的扩增曲线。2.4　检测基因表达的重复性

为了验证建立的方法技术的重复性(preci2

sion),我们对同一处理同一浓度的cDNA样品重复

值)附近,相同样品的曲线基本上是重叠的。扩增后期由于影响因素太多,曲线分散,但是符合S型,不影响定量。2.5　不同氮处理OsAMT1;3基因表达的定量检测采用以上建立的SYBRGreen实时荧光定量PCR技术,对水稻不同氮处理OsAMT1;3基因表达定量分析的最后结果如图4所示。在2个处理中,缺氮条件下OsAMT1;3的表达量比纯NH4+处理明显增加,达4倍以上。

3　讨论

水稻全基因组序列数据分析结果表明,水稻全基因组共存在10个基因编码AMT[10]。其中Os2AMT1;1、OsAMT1;2、OsAMT1;3和OsAMT2;1吸收转运铵离子的功能已经通过酵母细胞异源表达系统被证实。水稻中AMT1家族OsAMT1;1、Os2

+

AMT1;2、OsAMT1;3这3个成员都为功能NH4转运蛋白,并且各自具有明显的表达模式[5]。Os2AMT1;1为组成型表达,在根和地上部分都可以明

检测OsAMT1;3含量5次,得到的Ct值分别为26.32、26.30、26.08、26.19、26.05,其平均值(󰁫x±s)为26.20±0.13,变异系数为0.47%。　　从图3可以看出,曲线的重复效果、稳定性很好。在扩增前期,特别是在threshold(荧光临界

图2　S形荧光定量动力学曲线

Fig.2.Real2timefluorescencequantitativeamplificationcurve

withflatbaseline,distinctexponentialarea,largeandstableslope.

图3　OsAMT1;3基因检测的重复性

图1　actin和OsAMT1;3的标准曲线

Fig.1.StandardcurvesforactinandOsAMT1;3.

Fig.3.Precisonoftheestablished2methodfordetectingOs2

AMT1;3.

孙淑斌等:水稻低丰度表达基因OsAMT1;3实时荧光定量PCR方法的建立及其应用11

样品的Ct值来产生标准曲线,然后计算相对方程式,从而实现定量。本研究获得的方程式的斜率大,为最佳标准曲线。曲线的线性回归分析后的相关系数R2在0.99以上,故实验的过程和数据是可信的。使用这个方程式可以计算出未知样本的相对初始模板量。

在实时荧光定量PCR中,模板定量有两种策略:相对定量和绝对定量。虽然一般认为定量PCR可以测定基因的绝对数量,但事实上,无论进行如何

图4　不同氮处理下OsAMT1;3的相对表达差异

Fig.4.RelativeexpressionamountofOsAMT1;3underdiffer2

entnitrogentreatments.

显检测到;OsAMT1;2和OsAMT1;3只在根中诱导表达[5]。本研究利用我们建立的SYBRGreen实时荧光定量PCR技术,对后者(OsAMT1;3)在不同氮处理条件下的表达做了定量鉴定。OsAMT1;3为低丰度表达基因,PCR经过33个循环才获得荧光信号(与此对比的看家基因actin只需26个循环);在缺氮条件下OsAMT1;3的表达量与纯

NH4+处理相比明显增加(图4)。这一结果验证了

仔细的检测,都没有办法精确地知道在某个样品中到底真正存在多少拷贝的目的基因。本研究是采用相对标准曲线进行定量分析。在一定样本中目的序列相对于另一参照样本量的变化,量的表达是相对于某个参照物的量而言的,因此相对定量的标准曲线就比较容易制备,对于所用的标准品只要知道其相对稀释度即可。

在定量RT2PCR研究mRNA时,由于不同的样品在逆转录过程中的效率存在一定的差别,因此除了要制作标准品曲线来进行定量外,还需要设计表达水平相对较为稳定的内参基因来对结果进行标准化。合理地选择不受实验条件影响的内源控制物是保证实验结果可靠性的关键。本研究采用水稻内源actin看家基因作为内源特异参照基因,并取得预期效果。

SYBRGreen实时荧光定量PCR为非特异性检测方法,其分子基础是荧光染料SYBRGreen可以与双链DNA结合,掺入DNA双链后其荧光强度是游离状态下的10～100倍,可以被仪器检测到。这个方法优势在于它能监测任何dsDNA序列的扩增,不需要探针的设计,使检测方法变得简便,同时也降低了检测的成本。但特异性相对较差,受引物二聚体的影响[14]。如何消除引物二聚体并提高灵敏度?理想情况是引物设计非常完美,各种试剂的使用量恰到好处,温度变化与“变性、退火、延伸”完全吻合,使得PCR过程中产生极少引物二聚体,极少有偏差的延伸,极少非目的模板的扩增。本课题组就此问题做了大量的摸索研究工作,得出的结论是,做到以下几个方面可获得理想结果:1)设计适合realtimePCR的引物。最好用专门设计realtimePCR引物的软件,如PrimerPress来设计引物。一些常见的基因引物序列可以借鉴其他成功研究者的引物。2)除了寻找合适的引物序列,还可以改变退火温度,限制引物的浓度。3)减少配试剂到开始反应之间的非特异扩增(缩短时间+冰上操作)。

本课题组段英华等的生理结果

[11]

。Yutaka等人虽

然也有类似的报道,但他们是利用传统PCR检测获得的结果[5]。而传统PCR检测的是PCR终产物,不能确保PCR产物信号与初始模板的拷贝数成比例。也就是说,传统PCR不能准确检测各样品间真实差异。OsAMT1;2的调节模式与OsAMT1;3相反,它在氮缺乏时表达较低,NH4+处理时大幅度诱导表达[5]。

实时荧光定量PCR是一种在PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号积累实时监测整个

PCR进程,最后通过标准曲线对未知模板进行定量

分析的方法。这种方法实现了每一轮循环均检测一次荧光信号的强度,并记录在电脑软件之中,达到对整个PCR进程的实时监测。此外,实时荧光PCR采用闭管分析,无需电泳等PCR后处理步骤,有效地消除了核酸的交叉污染

[12]

。在PCR循环中,荧

光信号由本底开始进入指数增长阶段的拐点所对应的循环次数,也就是产生可被检测到的荧光信号所需的最小循环数为一个Ct值(cyclethreshold)。实时荧光PCR循环在到达Ct值所在的循环数时,刚刚进入真正的指数扩增期(对数期),此时微小误差尚未放大,Ct值的重现性极好,Ct值与起始模板的对数存在线性关系[13],因此通常用不同浓度的标准

12

中国水稻科学(ChineseJRiceSci)　第20卷第1期(2006年1月)

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