一、课程概述
课程名称（中文）：生物化学实验
（英文）：Biochemistry Experiment
课程编号： 课程学分：1.0 课程总学时：30 课程性质：科类基础课
前修课程：无机化学实验，有机化学实验 二、课程内容简介（300字以内）
生物化学是农学、畜牧学、生物学等各专业相关课程的重要基础课程，是一门实验性很强的学科，其生物化学实验课在生物化学教学中占据重要地位。生物化学实验紧密围绕生物化学实验技术的教学需求，主要针对蛋白质、酶、核酸、脂类、糖、维生素等生物分子的分离、提取、分析、鉴定和定量测定技术等内容进行课程实验项目的设计和教学，加强学生对生物化学实验技术的学习，巩固和掌握生物化学实验技术的基本理论、基本知识、实验技能，提高学生创新思维意识、综合分析问题和科学实验的能力，鼓励学生将所学知识运用于实际工作中去。
三、教学目标与要求
生物化学实验是农业院校重要的专业基础课程，是培养学生创新精神、实践能力的重要平台，是塑造高层次农业科技专门人才的基本环节之一。通过该课程的学习后，学生能够掌握生物化学实验的基本原理和操作方法，能够独立进行实验并具有发现问题和解决问题的能力，能够根据实验记录，结合理论知识，合理地分析结果，并学习对实验中出现的问题进行讨论，提出解决方案或改进措施。总的目标是提高学生综合分析能力，培养学生熟悉科学研究的基本程序和基本思维。 四、学时分配
生物化学实验课学时分配 实验项目名称 酶促转氨反应的分析鉴定 琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制作用 种子皮中VBl的提取与鉴定 3，5－二硝基水杨酸比色法测定还原糖含量 酵母RNA的提取及组分鉴定 醋酸纤维素薄膜电泳及凝胶层析法分离蛋白质 牛奶中酪蛋白的提取及定量测定 学 时 3 3 3 3 3 4 6 实验类别 验证性实验 验证性实验 验证性实验 验证性实验 验证性实验 综合性实验 综合性实验 备 注 外界因素对酶活性的影响 糖酵解中间产物的鉴定 酵母蔗糖酶的纯化效果分析 小麦萌发前后淀粉酶活力的比较 合 计 综合性、设计性实验占37.5%。
五、教学内容与安排
5 3 6 5 30（不含选修） 设计性实验 验证性实验 综合性实验 设计性实验 选修 选修 选修 注：生物化学实验课程总计1学分，安排8次实验（不含选修），其中验证性实验占62.5%，
实验一：酶促转氨反应的分析鉴定(3学时)
（一）实验目的：
通过本实验掌握纸层析的一般原理和方法；掌握利用纸层析研究代谢的基本方法，了解酶促转氨反应在中间代谢中的意义。 （二）实验主要仪器：
层析缸；培养皿；电吹风机；烘箱；恒温水浴锅；培养皿；毛细管；研钵；针、线。 （三）实验内容与方法：
1. 提取材料的酶液；
2. 用纸层析法鉴定酶促转氨反应中转氨基产物丙氨酸的存在与否； 3. 通过计算其Rf并与标准氨基酸对照，判断反应产物样品的氨基酸组成。 （四）作业（思考题）：
1. 计算各种氨基酸的Rf值并用以判断产物氨基酸的组分。 2. 人体内的转氨酶主要有哪两种，测定它们的临床意义是什么？
3. 对照和测定管显现的斑点有何不同？它们分别代表何物质？请说明理由。
实验二：琥珀酸脱氢酶酶的竞争性抑制作用(3学时)
（一）实验目的：
理解丙二酸对琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制作用，掌握测定琥珀酸脱氢酶活性的简易方法及原理。 （二）实验主要仪器：
试管及试管架；解剖剪刀；滴管；组织捣碎机（或研钵）；恒温水浴锅。 （三）实验内容与方法：
1. 从新鲜材料中提取琥珀酸脱氢酶液；
2. 以加入丙二酸的试管为对照，观察甲烯蓝被还原生成无色的甲烯白的变化过程； 3. 根据褪色时间计算琥珀酸脱氢酶相对活力。 （四）作业（思考题）：
1. 丙二酸对琥珀酸脱氢酶是否有干扰？为什么？ 2. 说明实验中各管的变色情况，并加以解释。
3. 未加丙二酸的试管观察到褪色后，振荡试管，会有什么现象？为什么？
实验三：种子皮中VBl的提取与鉴定(3学时)
（一）实验目的：
掌握VBl的提取和鉴定方法，理解VBl的作用原理及功能。 （二）实验主要仪器：
台秤；滤纸；漏斗；试管及试管架；滴管；移液管；量筒；UV灯。 （三）实验内容与方法：
1. 提取种子皮（米糠）中的VBl；
2. 分别用重氮试剂法和用荧光法观察鉴定标准管和样品管VBl。 （四）作业（思考题）：
1. 用目测结果颜色深浅，比较标准硫胺素与米糠中含维生素B1的量。 2. 维生素B1在生物体内谢中的作用是什么？维生素B1缺乏有何症状？
实验四：3，5－二硝基水杨酸比色法测定还原糖含量(3学时)
（一）实验目的：
熟悉722型分光光度计的原理及使用方法，掌握3，5一二硝基水杨酸比色法测定糖的原理及操作方法。 （二）实验主要仪器：
722S型分光光度计；恒温水浴锅；大试管和大试管架；容量瓶（100mL）；玻璃漏斗和纱布、滤纸；移液管和移液管架。 （三）实验内容与方法：
1. 称取苹果，研磨、保温、过滤；
2. 蒸馏水定容，并制作标准还原糖工作曲线；
3. 利用3，5一二硝基水杨酸比色法测定苹果中还原糖的含量。 （四）作业（思考题）：
1. 写出3，5-二硝基水杨酸的化学结构式。
2. 依据还原糖的标准曲线，计算提取材料中还原糖含量。
3. 比色测定时为什么要设空白管？如何减少该实验误差，提高测定准确度？
实验五：酵母RNA的提取及组分鉴定(3学时)
（一）实验目的：
掌握RNA的提取方法，掌握核酸粗品中各组分的鉴定方法。 （二）实验主要仪器：
离心机；天平；电炉；试管；玻棒；移液管和移液管架。 （三）实验内容与方法：
1. 称取干酵母；
2. 加入NaOH(0.2％)提取，用95%乙醇将溶液沉淀，离心，沉淀为粗RNA，酸溶解沉淀；3. 煮沸的水解液用于核酸粗品中各组分的鉴定（苔黑酚法鉴定RNA,二苯胺鉴定DNA及蛋白质等组分的鉴定）。 （四）作业（思考题）：
1. 本实验采用的稀碱法提取的物质是不是RNA？其中还包含哪些杂质？ 2. 你能知道CuO或FeCl3·6H2O在地衣酚法测定RNA中的作用吗？
实验六：醋酸纤维素薄膜电泳及凝胶层析法分离蛋白质(4学时)
（一）实验目的：
学习醋酸纤维素薄膜电泳及凝胶层析法分离蛋白质的基本原理；掌握醋酸纤维素薄膜电泳及凝胶层析法分离蛋白质的基本操作。 （二）实验主要仪器：
层析柱（1cm×20cm）；电泳仪和电泳槽；点样器和点样棒（自制）；胶头滴管；玻棒；烧杯（50mL）；铁架台；培养皿；白瓷盘；镊子；直尺和铅笔；普通滤纸；吹风机。 （三）实验内容与方法：
1. 取经巴比妥缓冲液（pH 8.6）浸泡的醋酸纤维薄膜为支持物，点样器蘸取血清样品在膜的毛面点样；
2. 将醋酸纤维薄膜放放置于水平电泳槽电泳，经染色、漂洗；
3. 观察分析动物血清的主要成分，电泳时间，装凝胶层析柱，分离动物血红蛋白。 （四）作业（思考题）：
1. 将你做的电泳图谱贴在实验报告上，标出各区带名称，并对各区带的清晰程度和区带的排序进行。
2. 利用图或表格形式描述凝胶层析法各管收集液，并分析各是什么物质。
3. 比较凝胶层析法和电泳法分离混合样异同，操作中怎样才能得到较好的分离效果？
实验七：牛奶中酪蛋白的提取及其定量测定(6学时)
（一）实验目的：
学习用等电点沉淀法从牛奶中制备酪蛋白的方法，加深对蛋白质等电点性质的理解；学习双缩脲法定量测定蛋白质浓度的基本原理与技术。 （二）实验主要仪器：
722S型分光光度计；离心机；循环水真空泵；抽滤瓶；布氏漏斗；研钵；烘箱；表面皿；量筒；容量瓶；刻度吸管；烧杯；试管及试管架；滴管。 （三）实验内容与方法：
1. 以市售液体牛奶为材料，综合分离、提取、制备、鉴定和定量测定牛奶中酪蛋白的方法；
2. pH沉淀反应测定酪蛋白等电点，双缩脲法测定提取酪蛋白浓度，并计算提取得率。 （四）作业（思考题）：
1. 何谓蛋白质等电点？为何蛋白质在等电点时溶解度最低？ 2. 计算酪蛋白提取得率；
3. 计算双缩脲法测定的酪蛋白浓度。
实验八：外界因素对酶活性的影响(5学时)
（一）实验目的：
以外界因素对唾液淀粉酶活性的影响为实验主题，在老师的指导下，学习生物化学实验设计的方法、步骤；为适应学生多元化学习，教学中设计方案可体现分层次要求。 （二）实验主要仪器：
冰箱；恒温水浴锅；电炉；试管架及试管；移液管及管架；白瓷板。 （三）实验内容与方法：
1. 以唾液为实验材料，围绕“外界因素对唾液淀粉酶活性影响”主题，查阅相关资料； 2. 撰写实验设计报告：基本要求实验设计中，针对唾液淀粉酶活性的主要影响因素pH、温度、酶浓度等设计不同梯度，如用淀粉遇碘液变色检测唾液淀粉酶活性方法，分析外界因素对酶活性的影响；或较高要求，采用正交设计，寻找唾液淀粉酶活性达到最佳的实验条件； 3.实验器材和试剂的准备； 4.实验实施操作； 5.撰写实验总结报告。 （四）作业（思考题）：
1. 以反应速度为纵坐标，pH值、温度或酶浓度等影响因素为横坐标，绘制反应速度受pH、温度或酶浓度等影响的变化关系简图。 2. 进行酶的实验必须注意控制哪些条件？为什么？ 3. 与一般方法相比，采用正交法有什么优点？
实验九：糖酵解中间产物的鉴定(3学时、选修)
（一）实验目的：
熟悉糖酵解过程中间步骤；学习利用抑制剂来研究中间代谢的方法。 （二）实验主要仪器：
冰箱；恒温水浴锅；试管架及试管；移液管架及移液管；烧杯。 （三）实验内容与方法：
1. 利用碘乙酸对糖酵解过程中3-磷酸甘油醛脱氢酶的抑制作用，使3-磷酸甘油醛不再向前变化而积累。硫酸肼作为稳定剂，可保护3-磷酸甘油醛使不自发分解； 2. 然后用2，4-二硝基苯肼与3-磷酸甘油醛在碱性条件下形成2，4-二硝基苯肼-丙糖的棕色复合物，其棕色程度与3-磷酸甘油醛含量成正比。 （四）作业（思考题）：
1. 糖酵解的中间产物有哪些？此实验检查的是哪些？
2. 实验中哪一发酵管生成的气泡最多？哪一管最后生成的颜色反应最深？为什么？
实验十：酵母蔗糖酶的纯化效果分析(6学时、选修)
（一）实验目的：
了解酵母中蔗糖酶分离提取的基本方法和操作过程；学习掌握酶蛋白质分离提取的常用技术；
（二）实验主要仪器：
离心机；分光光度计；水浴锅；冰箱；电炉；量筒；刻度吸管；烧杯；试管及试管架；滴管。
（三）实验内容与方法：
1. 以干酵母粉为材料，综合分离、提取、纯化和定量测定酵母蔗糖酶的活性方法； 2. 计算酵母蔗糖酶的分离纯化倍数及回收率。 （四）作业（思考题）：
1. 有机溶剂分级沉淀法分离提取酶（蛋白质）的原理及注意事项。 2. 根据实验数据，计算并分析蔗糖酶分离提取效果。
实验十一：小麦萌发前后淀粉酶活力的比较(5学时、选修)
（一）实验目的：
学习实验对照材料的准备和科学取样方法；熟悉实验室酶的制备基本操作；根据基本原理自行选择设计一套测定所提取酶液的适宜方法；掌握淀粉酶活力测定技术，学习如何合理利用定性或定量方法科学比较实验结果；熟悉处理实验数据的要求和方法。 （二）实验主要仪器：
离心机；分光光度计；恒温培养箱；水浴锅；白瓷板；冰箱；电炉；量筒；刻度吸管；烧杯；试管及试管架；滴管。 （三）实验内容与方法：
1. 经实验指导老师确认实验设计的可行性后，分小组自行准备实验仪器设备，提前配制相关试剂，萌发小麦种子。
2. 比较小麦萌发前后淀粉酶的活力的关键是酶活的检测方法。淀粉酶能使种子含有的淀粉水解为麦芽糖，而麦芽糖具有还原性，与3，5-二硝基水杨酸在共热的条件下生成棕色物质，在一定范围内，此棕色物质颜色的深浅程度与还原糖的量成正比，因此可利用比色法定量测定还原糖的量，从而反映淀粉酶活力大小。此外稀碘液遇淀粉显色反应，可辅助用于定性检测淀粉酶活。 （四）作业（思考题）：
1. 广泛查阅文献和资料，了解实验项目目前的研究状态； 2. 提交实验可行性报告； 3. 撰写实验报告。
六、考核方式与成绩评定
考核包括课堂回答问题、到课率、实验过程和结果，以及实验报告。成绩评定到课率占50%，实验过程和结果占30%，回答问题占10%，实验报告占10%。满分100分。 七、教材及主要参考资料
教材：赵海泉. 基础生物学实验指导:生物化学分册，北京：中国农业大学出版社，2008 主要参考资料：
蒋立科，杨婉身. 现代生物化学实验技术，北京：中国农业出版社，2004 周先碗，胡晓倩. 生物化学仪器分析与实验技术，北京：化学工业出版社，2002 董晓燕. 生物化学实验，北京：化学工业出版社，2003
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