论著•基础
慢病毒转 低HDAC1 胃癌干细胞干性增殖、
及 的影响及 研究
刘小娟，刘复娜，张艳芳，陈策
作者单位：（02552河北任丘，华北石油管理局总医院消化科 通信作者：刘小娟，E-mail: rqliuxiaojuaa@126. com
【摘要】目的通过慢病毒转染敲低胃癌干细胞观察HDAC1表达对人类胃癌干细胞干性增殖、迁移及侵袭
的影响以及对胃癌干细胞干 基 的影响J HDAC1低 人类胃癌干 分化的影响及 。方法2017年7—10月于华北石油管理局总医院 实验室 。通过慢病毒转 株分为实验组对照组。以Nang为胃癌细胞干性标志物，流式细胞术筛选出胃癌干细胞。通过慢病毒转染技术干扰胃癌干细胞中 HDAC1表达，实时定量PCR( qRT-PCR)和Western Blot方法检测干扰效率。采用MTT比色法和划痕试验分别观察2 组细胞增殖和迁移能力的差异;通过Tmnsell实验观察2组细胞侵袭能力的差异;采用qRT-PCR和Western Blot方法 检测2组细胞干性相关基因表达。结果（1)实验组胃癌干细胞的增殖能力在96 h、120 h，均显著低于对照组（= 5.471、7.251，P均<0. 001)。（2)通过细胞划痕实验观察到实验组胃癌干细胞的24 h划痕愈合速度较对照组慢， HDAC1的低 低胃癌干 的 力J; 具有统计学意义[(20.23 ±5.46)个vs. (39.96 ±3.48)个j =. 813，P =0. 001 ]。（3)Tmnsell实验显示，实验组胃癌干细胞的侵袭能力显著低于对照组，HDAC1低表达降 低胃癌干细胞的迁移能力，2组穿膜细胞数差异具有统计学意义[(21. 51 ±4. 32)个vs. (62.63 ±4.21)个J = 15.242，户=0.000]。实验组细胞干性相关基因Nan〇g、BMil、c-Myc表达均显著低于对照组（0.23 ±0.06 vs. 1.00 土 0. 0 1 J = 28.306,P =0.000；0. 64 ±0. 1 1 vs . 1.00 ±0 . 01 J =7. 288 J . 001 ；0 . 48 ±0 . 09 vs . 1.00 ±0. 01 J = 12. 841，0.000)。结论HDAC1低表达可降低胃癌干细胞的增殖、迁移及侵袭能力；HDAC1低表达下调BMi基因表达可能
6
低胃癌干细胞的 、迁移及 的 之一。
【关键词】HDAC1 ;胃癌干细胞;增殖;迁移;侵袭;Nang; BMi1 ; C-Myc 【DOI】 10.3969 / j. issn. 1671-450.2018.07.016
Effect of lentivirus transfectedlowHDAC1 expression on the dry proliferation，migration and invasion of gastriccancer stem cells and
its
mechanism
LIU Xiaojuan, LIU Funa, ZHANGYanfang， Department of
General Hospital of North China Petroleum Administration Bureau，Renqiu 062552，ChinaCorresponding author： LIU Xiaojuan， E-mag：
rqliuxiaojuan@ 126.
the
expression effect
and
of
stem cell related
genes low^ to
in
human
ga
【Abstract】 Objective
sion of human
gastric
transfected to low gastric
To investigate the effect of HDAC1 expression on stemness proliferation，migration and invacancer and
cancer stem cells，and the mechanism of HDAC1 Methods From July 2017
expression on October
the
differentiation of human gastric cancer stem cells were further explored. 2017，at the
cell laboratory of the General Hospital of the North China Petroleum Administration，the GCSCs were selected by flow^ cytometry with Nanog as marker. The expression of HDAC1 in GCSCs was down-regulated by lentiviral vector and detected by realtime quantitative reverse transcription PCR ( qRT PCR) and Western Blot. The difference of Proliferation and immigration between two groups were
evaluated by MTT assays
and
scratch test respectively;
The difference
of
invasion bet
were evaluated by trans^vell assays; The expression of stemness related genes was detected by qRT PCR and Western Blot. Results
The proliferation(= 7. 251，P = 0. 001) and immigration (=6.813
，P=0. 001)in the experimental group were
ob
viously lower than control group. The expression of stemness related genes in the experimental group were obviously lower than control group (^ = 28. 306 HDAC1 can
, P = 0.000; t = 7.288, P = 0. 001;
of BMI1，which
t = 12.841，P=0. 000). Conclusion
invasion in thought
to be
gastric one
The low expression of
stem the
cells.
The
decrease proliferation，differentiation and was
cancer of
low
down-regulate the expression mechanism that HD
• 716 •疑难病杂志 2018 年 7 月第 17 卷第 7 期 Chin J Diffic and Compl Cas，July 2018，V〇1. 17 No.7
differentiation in human gastric cancer stem cells.
【Keywords】
HDAC1 ; Gastric cancer stem cells; Proliferation; Immigration; Invasion; Nanog; BMi1 ; CMyc
胃癌是全球常见的恶性肿瘤之一，是全球第6位 常见的恶性肿瘤，是第4位常见的死亡相关恶性肿瘤。 我国是胃癌高发国家，胃癌是我国第2位常见的恶性 肿瘤，是第3位常见的死亡相关恶性肿瘤[1]。新近发 现的同源盒蛋白Nang因子是一种维持胚胎干细胞 (ESC)自我更新和多重分化能力的重要转录因子，
养液稀释的HDAC1 shRNA病毒液2ml进行病毒转 染，8h后更换培养液继续培养。对照组:使用无血清 无抗生素培养液稀释的HDAC1 cotrl病毒液，其他 理 实验 。
1.2.2增殖实验：从37°C培养箱中取出2组对数期 胃癌干细胞，分别接种于96孔板中，均取密度为1 000 Nang作为一种同源异型结构域转录因子在维持小鼠 ESC的多重分化能力、阻止ESC向原始内胚层分化
起着非常重要的作用，被誉为胚胎干细胞多项分化能 力的“总开关”。基于以上分析，为研究组蛋白去乙酰
化酶1 (HDAC1)在胃癌干细胞的自我更新及分化过程 中的作用及相关机制，笔者以人类胃癌MGC803细胞 为实验对象，以Nang为胃癌干细胞分子标志物，通过 慢病毒转染技术构建低表达HDAC1的胃癌干细胞， 研究胃癌干细胞增殖、迁移和侵袭能力变化及其“干 性”维持相关基因表达情况，初步探究HDAC1对胃癌 干细胞增殖分化的影响及相关机制，报道如下。1材料与方法
1.1实验材料（1)细胞系来源:人类胃癌MGC803 细胞（中科院上海细胞库）。慢病毒HDAC1 shRNA由 上海吉凯基因科技有限公司构建合成提供。（2)主要 试剂:RPMI1640干粉培养基、青霉素一链霉素双抗混 合液，美国Gibco公司；谷氨酰胺、胎牛血清，美国Hy-
cloe公司;碳酸氢盐缓冲液，北京中杉金桥公司；二甲
基亚砜、甘油，美国Sigma公司;甘氨酸，上海阿拉丁公 司；十二烷基磺酸钠（SDS )、二硫苏糖醇、Tween-20，美 国Amersco公司；蛋白裂解液，美国Novagen公司；蛋 白抑制剂，瑞士 Rohe公司；PVDF膜，美国Bio-Rad公 司;胰蛋白酶、乙二酸四乙酸，北京索来宝科技有限公 司；CCK8试剂盒、蛋白上样缓冲液，上海碧云天生物 制品公司；RT-PCR试剂盒，日本TAKARA公司；鼠抗 人HDAC1单克隆抗体、鼠抗人Nang单克隆抗体、鼠 抗人BMi1单克隆抗体、鼠抗人C-Myc单克隆抗体、兔 抗人GAPDH单克隆抗体，美国SantaCruz公司。1.2实验方法2017年7 —10月于华北石油管理局 总医院细胞实验室进行实验。1.2.1慢病毒转染：通过慢病毒转染将本实验细胞 株分为2组。实验组:取对数生长期的Nang-GFP + 细胞稀释至1.0接种至50 ml培养瓶内，在细胞贴壁 60%融合时，按照M0I为20加入无血清无抗生素培
个/孔。孵育条件为C〇2饱和湿度5%，温度37°C，至 细胞单层铺满96孔平底板板底，细胞贴壁后更换新的 培养液，每组设置5个复孔，以反映真实增殖情况孵育 条件同上，再次孵育16 h后在每孔添加浓度为0. 5% 的MTT溶液20 一，继续培养4 h后离心弃去培养液， 小心用PBS冲2 ~3遍后，再加入含MTT的培养液。 终止培养后用移液器小心吸去孔内培养液，每孔加入
二甲基亚砜150 一，放置于摇床上低速振荡10 min，充 分溶解结晶物。在酶标仪450 nm处测量各孔的吸光 值0D，记录数据，分析数据并绘制表格。1.2. 3
划痕实验：用makei•笔在12孔培养板背面画
横线做好标记。细胞消化后取对数生长期实验组及对 照组胃癌干细胞对称接种于6孔板中。待细胞铺满板 底后，用1 ml枪头垂直于孔板制造细胞划痕，每个划 痕宽度尽量一致。移液器吸去细胞培养液，用PBS洗 板2次，去除脱落的细胞，再更换培养液继续培养，加 入无血清培养基，拍照记录初始划痕宽度。将培养板 放入培养箱培养，观察2组细胞划痕愈合情况，于24 h 后再次拍照记录。根据收集图片数据分析实验结果。 1.2.4 Transwell实验：实验组及对照组的Transwell 上室小孔内均均勻铺Matrigel基质胶，37°C放置30
min使其凝固。将经胰酶处理的2组胃癌干细胞悬液
接种于小室，上室再加入无血清培养基200 pl，下室加 入含有10%胎牛血清培养基500 “。培养24 h，观察 到下室有细胞穿透后，取出上室，吸取其中液体，棉棒
轻轻擦除滤膜上未穿透的细胞，经4%多聚甲醛固定 和结晶紫染色后随机选取200倍高倍镜视野5个观察 并计数。
1.2.5实时定量PCR检测2组细胞干性相关基因表 达差异：用紫外分光光度计测量提取的RNA纯度及 浓度后，取RNA 1 000 ng加入逆转录体系中，用特异 性引物序列将 HDAC1、BMi1、Nan〇g、c-Myc mRNA 逆 转录为靶cDNA，对靶cDNA进行扩增。每个样本设置 一个GAPDH作为内参。引物序列如下：GAPDH:FP
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5’-TAGCCCAGGATGCCCTTGAG-3’；HDAC1:RP5’-
GGACCTGACCTGCCGTCTAG-3’；FP5’-CGCATGACT- CATAAT-3’；RP5’-GCTGTGGTACTTGGTCATCT— BMi1 FP 5 ’ TCGTTCTTGTTATTACGCTGTTTT- ’ ； RP
义[(21. 51 ±4. 32)个 v. (62. 63 ±4. 21)个，= 15.242，P=0.000]。图2见插页 n。
2.4胃癌干细胞干性相关基因的表达应用qRT-
PCR和Western Blot方法检测2组胃癌干细胞干性相
5 ’ -CGGTAGTACCCGCTTTTAGGC-3 ’ ； Nanog: FP 5，-
ACCTATGCCTGTGATTTGTGG- ’ ； RP 5，-AAGAG- TAGAGGCTGGGGTAGG-3，； c-Myc: FP 5，-TCG- GACTCTCTGCTCTCCTC-3，； RP 5，-CTTGTCGTTCTC- CTCGGTGT-，。
关基因 BMi1、Nanog、c-Myc 的 验组胃癌干细胞干
。 实
基因BMi1、Nanog、c-Myc表
分
力。
达均显著低于对照组(P <0. 05)。说明肿瘤干细胞较 通 具有更强的自我更新
见 1 、 3 。1.3统计学方法采用SPSS 18. 0软件包进行统计 学处理。符合
分布的计量资料以均3 ±
差
(% ±4表示，组间
两独立样本£检验。计数
资料以频数和百分率（％)表示，组间比较采用x2检 验。P<0.05: 统计学意义。2
结果
2.1经HDAC1 SRNA病毒转染的胃癌干细胞增殖 能力的变化本实验2组在96孔板内连续培养胃癌 干细胞5 d，记录不同时间段（24 h、48 h、72 h、96 h、 120 h)实验 于酶标仪450 nm处吸光度变化， 的数
成生长曲线，并计算2组胃
癌干
的倍
间。
HDAC1低
的实验组胃癌干 的 力在96h、120h，
低
于对照组〇=5.471、7.251，尸均<0.001)，见图1。
图1
MTT法测定经HDAC1 SRNA
病毒转染的
胃癌干细胞的增殖能力的变化
2.2细胞划痕实验结果实验组胃癌干细胞的24 h 划痕愈合速度
慢，HDAC1低
低了胃癌
干 的 力，2: 具有统计学意义
[(20.23 ±5. 46)个 vs. (39.96 ±3.48)个，=6. 813,
P =0.001]。
2. 3 Tmnsell实验结果胃癌干细胞的侵袭能力实 验组显著低于
，HDAC
1的低
低了胃癌干的
力，2;
数
具有统计学意
表1
HDAC1 SRNA
病毒转染胃癌干细胞后其BMi1、c-Myc
及Nanog表达的变化（± s)
组另
Nanog
BMi1
c-Myc
对照组1.00
±0.011.00
±0.011.00
±0.01
实验组
0.23 ±0.060.64 ±0.110.48 ±0.09“直28.306
7.288
12.41
P'
0.000
0.001
0.000
mock
shHDACI
Nanog
bmii
('-Myc
GAPDH
图3
HDAC1SRNA病毒转染胃癌干细胞后其 BMi1、c-Myc及Nanog表达的变化
3讨论胃癌的发
发展
至今尚
，但越的研究支持“肿瘤干
假说”在胃癌发生发
展中的重要作用，即认 由多种处于 分化段的 构成，而干 发生、发展、转
的
，针对胃癌干
的 措施，才 本上控制胃癌的发 发展，目
于
干
的的主 点在于其分 物的
，目前常用的肿
干
分
物特 ，且在非转
早
中
所 。CD44是一种在白 、内皮
、干、间质
中 的
糖蛋白，它与 、分
项生理病理
。CD44高
的
谷胱甘
的
强的抗性，且可以上调抗
基因的 []。有
CD44 、 间质 及 非 干
中同样 ，因此目前的观点认为CD44并不
度特异的
胃癌干
d
CD44联合
分子标志
■ 718 ■疑难病杂志 2018 年 7 月第 17 卷第 7 期 Chin J Diffic and Compl Cas,July 2018,V〇1. 17 No.7
物如EPCAM[3]、CD54W和CD24[5]也经常被应用到对 肿瘤干细胞的鉴定过程中。尽管如此CD44作为胃癌 干细胞分子标志物的特异性仍然较低。其他分子标志 物如CD133、上皮细胞黏附分子（EpCAM)、CD49f、
CD54也面临着特异性较低的问题。
细胞中存在c-Myc的过度表达，且c-Myc的高表达与 患者的预后显著相关（P < 0• 01 ) [1]。wnt-B-cateni (wnt)通路是肿瘤干细胞自我更新的重要信号通路之 一，wnt通路的激活是胃肠道肿瘤干细胞的标志之一，
cMyc作为wnt通路明确的耙基因之一，在wnt通路中
组蛋白的共价修饰在表观遗传学众多形式中占重 要地位，其乙酰化与去乙酰化是基因表达调控的重要 驱动力[6]，组蛋白去乙酰化酶家族（HDAC)是具有调 节组蛋白转录后修饰的
一
发挥着重要的调控作用[12]。研究证明BMi1可通过与
c-myc的共同作用调节INK4a/ARF基因表达，进而促
进细胞增殖，抑制细胞凋亡[3]。Jung等[0]的研究证 实组蛋白去乙酰化酶通过平衡polycomb的表达在成 熟干细胞中实现调控功能。BMi1基因是被多数实验 类酶，HDACs可被特定的转
录因子募集结合在特定的启动子区域，通过与组蛋白
乙酰化酶（HAT)的相互制衡作用对基因的正常表达 进行调控，一旦这种相互制衡作用失衡将会导致基因 表达异常，可进一步影响细胞的增殖及分化，HDAC1 可使组蛋白及其他一些癌症相关蛋白发生去乙酰化， 进而影响一系列肿瘤相关基因转录或蛋白表达的变 化，因此被认为在肿瘤发生发展的进程中具有至关重 要的作用。在多种恶性肿瘤中均可发现HDAC1蛋白 表达的上调，包括胃癌。许力等[]通过免疫组化法检 测111例胃癌患者术后标本发现，HDAC3在胃癌组织 中呈高表达，且在胃癌组织中的表达阳性率显著高于 癌旁组织（P = 0. 001)，同时发现HDAC3表达和胃癌 患者的临床分期呈正相关（P <0. 05)，提示HDAC3高 表达的胃癌细胞可能具有更强的侵袭和迁移能力，更容 易向周围和远处组织器官侵润和转移。HDAC1是
HDACS超家族成员之一
，
具有介导位点特异DNA结合
的转录抑制子的转录抑制作用，可调控细胞周期的进展 分化过程，在胃癌和癌前病变组织中的表达增高[]，但 其对胃癌细胞的增殖分化的影响及机制尚不明确。
Polycomb复合物主要由Polycomb 1和2构成，
PRC1 含有 BMi1、RING1、CBX 等，PRC2 含有 SUZ12、 EED、EZH2等，Pdycmb家族成员在胚胎干细胞和肿
瘤干细胞中发挥着重要的作用，SUZ12参与了胚胎干 细胞的分化;BMi1是Polycomb家族成员之一，是前列 腺癌干细胞的重要分子标志，并参与了前列腺癌自我 更新等一系列生理学过程;林云华等[]的研究也证明
BMil蛋白在前列腺癌组织中呈高表达状态，且其表达 和前列腺癌的分化程度及预后不良显著相关。有研究 证实组蛋白去乙酰化通过平衡Polycomb和jmjc3的表 达在成熟干细胞中实现调控功能[0]。
c-Myc是原癌基因Myc家族中的一员，是Wnt通 路调控的最重要的靶癌基因，参与肿瘤细胞的增殖分 化过程，并通过多种途径在肿瘤的发生发展中发挥作 用。研究报道在Burkitt淋巴瘤、弥漫型大B细胞淋巴 瘤、结肠癌、胃癌、胶质母细胞瘤、黑色素瘤等多种肿瘤
证实的癌基因，在多种肿瘤中表达上调，同样在胃癌中 高表达[1415]，基因表达是否受组蛋白乙酰化影响正是 本实验的研究内容。
本研究以特异性较高的Nang为胃癌细胞干性标 志物，流式细胞术筛选出胃癌干细胞，通过复制缺陷型 含抑制HDAC1表达siRNA序列的腺病毒重组体
(HDAC 1shRNA病毒）转染胃癌干细胞，构建低表达 HDAC1的胃癌干细胞，并通RT-PCR和Western Blot
试验证实了实验组的HDAC1表达显著低于对照组。 经MTT法观察到HDAC1低表达的实验组胃癌干细胞 的增殖能力显著低于对照组胃癌干细胞。划痕试验及 Tranwell实验显示HDAC1的低表达降低了胃癌干细 胞的迁移及侵袭能力。同样通过RT-PCR和Western
Blot实验证实了实验组胃癌干细胞“干性”相关基因 BMi1、Nanog、c-Myc的表达均显著低于对照组。
综上所述，HDAC1低表达对胃癌干细胞的生物学 行为产生了一定的影响。证明了组蛋白去乙酰化酶1 低表达对胃癌干细胞增殖分化产生了负性调节作用，
而这种负性作用的产生的机制可能与HDACI的低表 达降低了 polycomb家族成员BMi1的表达有关，为
HDAC1作为胃癌的重要分子标记物提供了新的理论
依据。但肿瘤的生物学行为不仅仅是受某一个基因的 表达影响，而是受到复杂的基因网络调控，此外肿瘤细 胞的增殖分化同样受到微环境的影响，单个基因的表 达尚不能解释完全肿瘤细胞的生物学行为及其背后的 含义。胃癌是常见的消化道肿瘤，对胃癌干细胞的表 观遗传学研究可以为胃癌的诊断和治疗提供新的思路 和策略
利益冲突:无 作者贡献声明
刘小娟、刘复娜:设计研究方案,实施研究过程，资料搜集 整理，论文撰写，论文修改；张艳芳、陈策:提出研究思路，分析 试验数据，论文审核，统计学分析
(下转728页）
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(收稿日期;2017-12-12)
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