一、实验材料
Western Blot相关试剂：
2×Sample Buffer：1ml Glycerol（甘油）;0。5ml Beta mercaptoethanol（β-巯基乙醇）; 3ml 10%SDS; 1。25ml 4×Upper buffer; 4。25ml dH2O; Add bromophenol blue （溴酚蓝）to color。 4×Upper buffer：60。6g Trizma Base(氨基丁三醇); 20ml 20%SDS; Add dH2O to 1000ml; 用盐酸调pH 至6。8。
10×电泳缓冲液（pH 8。3）：在1L大烧杯中加入800ml去离子水，称取Tris 30。2g、甘氨酸188g，混匀，加入100ml 10%SDS(10g)，定容至1L。（注：SDS在68℃水浴中溶解）。工作液：1×电泳缓冲液 去离子水稀释 室温保存。
1。5M Tris-HCl(pH8。8)：Tris 181。7g去离子水溶解，用浓盐酸调至pH8。8，定容至1L 室温保存。
1M Tris-HCl(pH6。8)：Tris 121。1g去离子水溶解，用浓盐酸调至pH7。5，定容至1L 室温保存。
10×TS(洗膜液)：在800ml去离子水，加入Nacl 90g， 1M Tris-HCl(pH7。5) 100ml，去离子水定容至1L。工作液：1×TS 室温保存。
1M Tris-HCl(pH7。5)：Tris 121。1g去离子水溶解，用浓盐酸调至pH7。5，定容至1L 室温保存。 10%SDS：称取十二烷基磺酸钠（SDS）10g，加入约80ml去离子水，68℃加热溶解。用10%HCl调pH至7。2，定容至100ml。
1×Transfer Buffer： 在1L大烧杯中加入800ml去离子水，加入3。03g Trisgrams，14。43g甘氨酸，最后加入200ml甲醇。4℃保存。
30%储备胶：丙烯酰胺Acr 29。0g、亚甲双丙烯酰胺（Bis）1。0g，混匀后加入去离子水37℃溶解，定容至100ml。4℃避光保存。 10%AP（过硫酸铵）：称取1gAP，加入10ml去离子水搅拌。分装，-20℃保存。
Western Blot相关仪器：
电泳仪；转移仪；摇转仪。
二、实验原理
经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。
三、操作程序与结果判定
操作程序：
（一）蛋白样制备
1. 无双抗DMEM（10%血清）接皿，代细胞长至80%时，细胞转染，6h后换含双抗DMEM
（10%血清），再过22h后处理细胞。 2. 吸出培养液，用PBS洗1-2次。
3. 每个皿（60mm）加入200-300ul细胞裂解液，摇均匀，刮细胞。(最好处理完一个样品后再处理另外的样品，不要同时处理)
4。 用一次性1ml针筒吸出裂解的细胞液，注入1。5ml离心管中，用针筒吸打至清亮。 5。 取80ul 2×Sample Buffer混匀，37度30min，沸水10min，1200rpm 10min 取上清，冰浴，上样，剩余样品-20度储存。 （二）SDS-PAGE
1. 制备分离胶5ml加入组装好的玻璃板中，立即水封。（一般配10%分离胶）
2. 待两液相出现折线，胶凝后将水倒出，加入制备的浓缩胶3ml插入梳子，待凝固。 3. 胶凝后拔出梳子，将玻璃板转过来，加入电泳缓冲液。 4. 用针筒吹净每个孔。
5. 上样，通电电泳：浓缩胶电压90V（约30min）分离胶120V（约90min）。 （三）转膜（湿转）
1. 海绵，滤纸在转膜液中浸泡，PVDF膜在甲醇中浸泡2min。
2. 在玻璃板上铺海绵，五层滤纸，用玻璃棒赶走气泡，将电泳后的胶轻放在滤纸上，玻璃
棒赶走气泡，贴上PVDF膜，再铺上五层滤纸及海绵，玻璃棒赶走气泡。将其整体转移到转膜夹上。
3. 12V电压下转膜过夜，在其四周放上冰袋。
注意：方向应为：阴极-海绵-五层滤纸-胶-PVDF膜-五层滤纸-海绵-阳极 （四）封膜
1. 配制封膜液，在20ml 1×TBST中加入1g脱脂奶粉（一块膜的用量），充分混匀倒入保
鲜盒中。
2. 将膜用镊子夹出平铺在封闭液中，蛋白面朝下。 3. 摇床上摇2h。 （五）一抗
把膜从封闭液中夹出剪去边缘，平铺入一抗溶液中，蛋白面朝下，摇床上摇4h。 （六）二抗
1. 将一抗回收，放入-20度冰箱中。
2. 在保鲜盒内加入8ml 1×TBST摇床10min 3次。 3. 倒掉冲洗液，加入二抗溶液（8ml），摇床2h。 （六）洗膜，显影，定影
1. 将二抗回收，放入-20度冰箱中。在保鲜盒内加入8ml 1×TBST摇床10min 3次。 2. 将A、B液按1：1配制，在一试管中各加400ul的A液和B液。
注明：ECL A、B液最好选用Pierce公司的Super Signal West Pico，国产可选用碧云天的。 3. 在工作台上铺好保鲜膜，在保鲜膜上滴一小滴ECL混合液，将洗好的膜放上，在膜上
滴ECL混合液，盖上保鲜膜，确定无气泡。
4. 关灯，黑暗中拿出胶片，折起一角，放在膜上，压膜（压膜必须带手套，且不能有水，
否则会有非特异性黑斑，压膜时间越长，条带越浓）。 5. 将压好的膜放入显影液中在红光下观察膜片上的条带。 6. 用水冲洗，放入定影液中定影，用水冲洗，晾干。
结果判定
问题 目的蛋白信号弱 可能原因 样品上样量不足或目的蛋白浓度过低 转膜效率低 抗体浓度偏低 显色剂底物浓度不足 显色剂失效 加大上样量或浓缩样品 见下 增加抗体浓度或延长孵育时间 增加显色剂用量 更换显色剂；吸取Reagent A和B的移液管不可交叉混用 显色或曝光时间不足 转膜效率低 转膜缓冲液pH值与目的蛋白等电点相近 凝胶与转印膜之间存在气泡 凝胶与转印膜两侧的滤纸大面积接触 延长显色或曝光时间 提高转膜缓冲液的pH值 转膜时应排除所有气泡 将滤纸、转印膜裁剪成与凝胶相同大小，避免两侧的滤纸边缘直接接触 转印膜种类选择不当 电压或电流过小 转印时间过短或过长，蛋白存留在凝胶中或穿透印迹膜 湿转过程中环境温度过高 显色或曝光后无条带 选用的一抗、二抗及显色方法不适合 目的蛋白含量低于检测下限 抗体效价过低 抗体孵育时间不足 抗体过度洗涤 加入HRP底物反应与曝光检测之间间隔时间过长 背景过高 封闭物使用不当 封闭的时间不够 抗体非特异性结合 抗体浓度过高或洗涤不彻底 化学显色底物过多 封闭物用量不足 使用质量可靠的PVDF或硝酸纤维素膜 湿转法使用20 mA恒流；半干转法使用25 v左右电压 通过对转印后的凝胶和蛋白膜染色判断原因，根据蛋白大小及转印装置选择合适的转印时间 使用预冷的转膜液或将湿转装置置于4℃ 选择适合的一抗、二抗和显色方法 加大上样量或浓缩样品 增加抗体浓度 增加孵育时间，37℃孵育1小时以上 减少洗涤时间和次数 反应5分钟后及时检测 提高封闭物浓度，使用适当体积保证孵育时完全覆盖转印膜 检测生物素标记的蛋白时不可用脱脂奶封闭 室温或37℃封闭1小时以上；4℃封闭过夜 减少抗体的浓度和孵育时间 降低抗体浓度，增加洗涤时间和次数 按照说明书加入适量的显色底物 解决方案
四、注意事项
1. 免疫印迹杂交的敏感与检测系统有关。因此,凝胶电泳时的蛋白上样量应该保证被检测抗
原量不至于太低，如果过低应该重新纯化和浓缩使用，或者建议做一次梯度稀释。 2. 形成凝胶的试剂要有足够的纯度,激活剂的浓度适当，不仅可以决定凝胶聚合的速度,也
将影响凝胶的质量,聚胶时的温度也将影响凝胶聚合的速度。因此，建议要根据不同温度下适量增减激活剂的用量以保证分离胶从加入激活剂起至开始出现凝胶凝聚的时间为15-20分钟最佳,对于浓缩胶最佳聚合时间为8-10分钟开始可见聚合。灌完分离胶加水封闭分离胶与外界氧气的结合。
3. 未聚合的丙烯酰胺具有神经毒性,操作时应该戴手套口罩防护。梳子插入浓缩胶时，应确
保没有气泡，可将梳子稍微倾斜插入以减少气泡的产生，梳子拔出来时应该小心,不要破坏加样孔，如有加样孔上的凝胶歪斜可用针头插入加样孔中纠正但要避免针头刺入胶内。
4. 加样前样品应先离心，尤其是长时间放置的样品,以减少蛋白质带的拖尾现象 。 5. 为避免边缘效应，可在未加样的孔中加入等量的样品缓冲液 。 6. 上样时，小心不要使样品溢出而污染相临加样孔 。
7. 样品缓冲液中煮沸的样品可在-20℃存放数月，但是反复冻融会使蛋白质降解。 8. 为减少蛋白质条带的扩散,上样后应尽快进行电泳，电泳结束后也应尽快转印。
9. 取出凝胶后应注意分清上下，可用刀片切去凝胶的一角作为标记(如左上角)转膜时也应
用同样的方法对PDVF膜做上标记(如左上角)以分清正反面和上下关系。
10. 转膜时应依次放好PDVF膜与凝胶所对应的电极,即凝胶对应负极,PDVF膜对应正极。
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