临床ELISA检测的常见问题与对策

临床ELISA检测的常见问题与对策

就目前的情况来说，酶联免疫吸附法（ELISA）作为一种十分常用的感染性标志物的检测手段，其测定结果的准确性及可靠性将直接影响临床诊断及治疗的效果，在临床实际操作的过程中，经常会因为仪器、试剂、工作人员操作等方面地原因影响到酶联免疫吸附法（ELISA）的测定结果。为了进一步提高ELISA的测定结果，本文主要对临床ELISA的检测常见的问题进行分析，并提出了针对其相关原因采取的措施。

标签：ELISA测定；问题分析；对策措施

前言

ELISA测定的主要原理是利用抗原、抗体之间的特异反应通过某种或者是几种酶来连接测物，经过底物及酶的相互作用，将改变溶液的颜色，进而通过观察溶液的颜色，来判定测定的结果。在医院检验科，ELISA是作为常用的，也是最为重要的一种感染性标志物的检测方法，本文主要对ELISA在临床测定实践中存在的常见问题及其发生原因进行分析。

一、临床ELISA检测的主要问题

在进行临床ELISA测定过程中，常常会碰到整板显色、白板、无法检测出弱阳性质控样本以及测定重复性较差等问题。

1、整板显色主要表现在没有彻底清洁洗板，污染了洗液，进而导致显色液毁坏、变质，或者是加反酶结合物，通常这种问题主要存在于HBsAb、HBsAg测定中。

2、白板主要是指整板无色，也将阳性对照包括在内，比如像洗液中存在酶抑制剂，酶结合物漏加，显色剂漏加A或B。或者是将终止剂当做显色剂用。

3、无法检测出弱阳性质控样本。比如显色时间不足，不能准确判定样本测定结果；或者是水浴温度没有达标，水育时间不足等。

4、测定重复性较差。具体指标本处理方法不对，没有正确设置酶标仪，混合应用不同批号的试剂组，微板孔条受到污染，显色时间、洗板时间、水育时间不一，样本加错，样本量添加不准确。

二、临床ELISA试剂盒的选择及使用

1、按照临床实际检测项目选择ELISA试剂盒

从试剂盒的生产厂家宣传材料及说明书中，能够大概了解不同厂家试剂盒的

地相同点及不同点，例如：固相材料的来源，包破抗体或者是抗原的性质、检测模式、色原底物、检测时间等，按照实验室的条件做出初步的选择意向。

2、试剂盒质量的检查

在试剂盒拿到手的时候，应先对其内外的包装进行仔细的观察，查看其有效期，试剂瓶是否有漏液，真空包装是否破损，试剂盒是否齐全等。在采用下列方法以判断其内部质量，采用弱阳性定值质控血清进行质检，对不同的厂家或者是同一厂家的不同批号试剂盒，需要采用同一弱阳性定值血清检测，能够比较得出试剂盒地灵敏度差异。对判断试剂盒的质量和稳定性具有一定的参考价值。

3、试剂盒使用

试剂盒必须是在有效期内使用，一般来说，ELISA试剂盒地有效期限是按照试剂盒中酶结合物的稳定性确定的。试剂盒的各组分要求复温后方可使用。酶结合物是ELISA试剂盒的核心部分，要防止反复冻融。因为酶结合物活性易受到温度的变化失活，部分标本少的试验试剂盒会因为需多次反复使用，检测耗时较长，若是每次检测时从冰箱内取出试剂盒一直到发出报告后，才将试剂盒放回冰箱，这样酶结合物的活性丧失快，可能效期未到或试剂才用了一部分已经不能再使用，必须做到即取即用即收。

三、临床ELISA实验过程中需注意的问题

1、在实验前的半个小时从冰箱中取出试剂盒、平衡至室温。选取精确移液管，实验中稀释液、酶标液、质拉物、阴阳性对照、标本的加入量必须够准确，在恒温孵育之前，必须对其进行振摇，确保其操作过程准确无误，避免阳性对照以及未知阳性标本地溅洒造成假阳性地结构，防止感染到操作人员。

2、夹心法的形成主要在于孵育的温度及时间，也是反应整个过程的必要因素，所以，必须加强对其的控制。通常来讲，温度相对的提高而抗原体结合的时间能够有效的缩短，否则时间便会延长，因此必须要选择最佳的温度及时间对其进行试验。

3、由于洗涤的干净程度将直接影响其结果，所以在洗板的时候，应该使洗液注满反应孔，调节洗板的次数，确保洗板的彻底，洗涤作为ELISA检测地重要环节，必须按照说明书严格进行，在满足洗涤次数及间隔时间的要求，进而确保结果的准确度。

4、显色问题和临界值的结果判定。若是所有的检测孔均无色：其主要原因是因为酶结合物或者底物的漏加、阳性对照漏加或者错加，其中以酶结合物实效及底物错加为常见。查找原因的主要方法是将酶结合物与底物直接混合，观察有无显色。若是显色提示为阳性对照漏加或者底物错加所致。若是不显色则提示底物实效，显色提示原用酶结合物失效。若是所以的检测孔均显色：其主要原因多是洗板不净或者是显色的时间太长。临界值的结果判定一定要用酶标仪测定，在

进行酶标仪检测时必须要注意板条各孔中比色液体积的一致，否则将产生误差。

四、临床ELISA实验的质量控制

影响ELISA检测结果准确性的因素较多，很难对其质量进行有效的控制，复杂的统计计算，能够用简单方式来处理。就是在免疫的试验中，采用同一批的试剂盒，每天第一块微孔板的连续20d的质控数据，求其均值和标准差值，作为质控框架图就可以。在试剂批号变更的时候，能够经过计算新的均值，上下平移原框架图便可，只有固定使用同一厂家的试剂盒，便可不必重新计算新框架图，出现连续7各质控点的偏向x轴的一侧的时候，不可认为是失控造成的，应该是因为框架上下平移不到位，所以可选择运用生化的质控原则，免疫学的检验存在着特殊的即刻法特点，开展临床的ELISA试验的质量控制，能够有效地提高ELISA检测结果的准确性。

结束语

根据上述常见的问题及其对策的分析，必须综合考虑人为操作、试剂因素、标本因素等多方面的影响，及早的查明影响ELISA测定的根本原因，并及时纠正进行重新测定，确保ELISA测定结果的准确性及可靠性，为临床提供科学的依据。

参考文献：

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[2]施根林；何海明；林国英；等；临床ELISA试剂盒的选择与使用体会[J]；实用医技杂志；2002（9）

[3]周先碗；胡晓倩；生物化学仪器分析与实验技术[M]；北京：化学工业出版社；2012