ELISA检测过程中影响因素及防控措施分析

・１１２・　国际检验医学杂志２０１３年１月第３４卷第ｌ期Ｉｎｔ　Ｊ　Ｌａｂ　Ｍｅｄ，Ｊａｎｕａｒｙ　２０）１　１　Ｄ１．翌！Ｎ０．　３讨　论　缓、羊水过少、发育畸形等不良结局的可能性明显高于低风险　本研究共筛出高风险孕妇１７２例，筛查阳性率为７．６８　。　孕妇，与Ｐａｌａｃｉｏ等　报道相符。产生这种结果的原因可能是　以３５岁为分界点，年龄大于３５岁的高龄孕妇组共有１８７例，　由于异常妊娠和胎盘激素分泌异常。这为临床医师预防此类　筛查阳性者５１例，阳性率为２７．２７％（５１／１８７）；年龄小于或等　疾病提供了理论依据。　于３５岁低龄孕妇组共有２　０５３例，筛查阳性者４６例，阳性率　参考文献　为２．２４　（４６／２　０５３），高龄组阳性率明显高于低龄组（Ｐ＜　０．０５）。所以年龄因素是引起ＤＳ和１８一三体综合征的高危因　［１］戚庆炜，孙念怙．产前唐氏综合征筛查概论［Ｊ］．实用妇产科杂志，　素，与夏家辉嘲、梁雄等嘲的报道相符，应对高龄孕妇进行产前　２００８，２４（１）：４－７．　诊断。各年龄组ＮＴＤ筛查阳性率无统计学差异（Ｐ＞０．０５）。　［２］夏家辉．医学遗传学ＥＭ］．北京：人民卫生出版社，２００４：１６１．　由表１可见，孕妇生育年龄集中在（＞２５～３０）岁，占５３．２６　，　［３］梁雄，朱峰，朱兰芳，等．３１９５例孕中期唐氏综合征的血清筛查和　大于３５岁的孕妇仅占８．３５　，说明９Ｏ　以上的妇女在３５岁　产前诊断临床分析［Ｊ］．中国现代医学杂志，２００５，１５（２０）：３０７９—　之前生育，避开了ＤＳ和１８一三体综合征高风险年龄段。目前　３０８４．　［４］杨灿锋，陈道桢，王峻峰，等．影响唐氏筛查准确性相关问题的分　产前筛查的指标均以孕周为基础，而孕妇提供的孕周与实际孕　析［Ｊ］．中国优生与遗传杂志，２０１１，１９（４）：１１７—１１８．　周相差２周即可导致三项指标评估的危险率差异１Ｏ　ｌ４ｊ。本　［５］Ｐａｌａｃｉｏ　Ｍ，Ｊａｕｎｉａｕｘ　Ｅ，Ｋｉｎｇｄｏｍ　Ｊ，ｅｔ　ａ１．Ｐｅｒｉｎａｔａｌ　ｏｕｔｃｏｍｅ　ｉｎ　研究筛查者孕周集中在１５～１９周，１４、２Ｏ周所占比例较少，各　ｐｒｅｇｎａｎｃｉｅｓ　ｗｉｔｈ　ａ　ｐｏｓｉｔｉｖｅ　ｓｅｒｕｍ　ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ　ｆｏｒ　Ｄｏｗｆｆｓ　ｓｙｎｄｒｏｍｅ　孕周组筛查高风险率比较，无统计学差异，所以要准确计算孕　ｄｕｅ　ｔｏ　ｅｌｅｖａｔｅｄ　ｌｅｖｅｌｓ　ｏｆ　ｆｒｅｅ——ｂｅｔａ——ｈｕｍａｎ　ｃｈｏｒｉｏｎｉｃ　ｇｏｎａｄｏｔｒｏｐｉｎ　周。本研究显示年龄大于３５岁的孕妇ＤＳ、１８一三体综合征和　［Ｊ］．Ｕｌｔｒａｓｏｕｎｄ　Ｏｂｓｔｅｔ　Ｇｙｎｅｃｏｌ，１９９９，１３（１）：５８—６２．　ＮＴＤ筛查高风险率高于小于或等于３５岁的低龄孕妇。表３　显示筛查高风险孕妇发生妊娠期高血压综合征、胎儿发育迟　（收稿日期：２０１２—０７—０４）　・经验交流・　ＥＬＩＳＡ检测过程中影响因素及防控措施分析　徐新蓉，龚国富，马　萍　（鄂州市中心医院，湖北鄂州４３６０００）　摘　要：目的探讨酶联免疫吸附法（ＥＬＩＳＡ）操作进程中的干扰因素和防控措施。方法　对ＥＬＩＳＡ操作试验步骤进行回顾　分析，总结各种影响因素。结果ＥＬＩＳＡ检测虽然操作简单，但标本、试剂、加样、温育、洗板、质量控制等因素都会对其结果产生　影响。结论ＥＬＩＳＡ检测过程中需重视各种感染因素，严格按操作规程操作，从而提高ＥＬＩＳＡ检测质量。　关键词：酶联免疫吸附测定；　灰区；　重复性　ＤＯＩ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１６７３—４１３０．２０１３．０１．０５９　文献标识码：Ｂ　文章编号：１６７３—４１３０（２０１３）Ｏ１一Ｏ１１２—０２　酶联免疫吸附法（ＥＬＩＳＡ）是应用最为广泛的酶免疫测定　测出现假阳性结果＿３］。（２）尽量避免标本被细菌污染。细菌中　技术＿１］。其基本原理是将抗原（抗体）在不破坏其免疫活性的　可能含有内源性ＨＲＰ，造成假阳性结果。（３）血清标本储存时　条件下预先结合到固相载体表面，再将待测抗体（抗原）和酶标　间不能过长。２～８℃下保存时间过长可使血清中的ＩｇＧ聚合　抗原（抗体）按一定顺序与结合在固相载体上的抗原（抗体）反　形成多聚体，导致间接法检测中本底过深，造成假阳性结果。　应并形成免疫复合物，经洗涤去除反应体系中的其他物质，使　一般在２～８℃下保存不可超过１周。一７Ｏ℃以下可长期保　固相载体上的免疫复合物与待测抗体（抗原）的量呈一定比例，　存标本，但不能反复冻融。反复冻融所产生的机械剪切力将对　加入酶反应底物后，底物即被固相载体上的酶催化变为有色产　标本中的蛋白等分子产生破坏作用，引起假阴性结果。（４）避　物，最后根据颜色深浅进行定量或定性分析　］。由于酶的催化　免在血液标本完全凝固前离心分离血清标本。如在血液标本　效率很高，故可有效放大免疫反应，提高检测灵敏度，加之操作　完全凝固前分离血清标本，将导致血清中残存未凝固的纤维蛋　简单，使ＥＬＩＳＡ已成为目前临床检验中应用较广泛的免疫测　白原，后者可在ＥＩ　ＩＳＡ微孔板中形成纤维蛋白凝固性团块，使　定方法。本为以检测乙型肝炎病毒表面抗原为例，探讨　待测抗原（抗体）不能与固相抗体（抗原）有效结合，引起假阳性　ＥＬＩＳＡ操作过程中常见的问题和防控措施。在ＥＬＩＳＡ检测　或假阴性结果。（５）其他化学物质的影响。乙二胺四乙酸、酶　过程中，常会遇见弱阳性质控品无法检出、处于灰区的弱阳性　抑制剂（如ＮａＮ。）可抑制ＨＲＰ活性，造成假阴性结果。（６）标　结果难以报告、重复性差、阴阳性对照品检测均不显色、阴阳性　本中的内源性干扰物影响检测结果，常见干扰物包括类风湿因　对照品检测均显色或间隔有规律地显色等。ＥＬＩＳＡ检测的每　子、补体、交叉反应物质和其他物质等。　步环节都至关重要，现将几点体会总结如下。　２试剂准备　１　临床标本的采集和保存　（１）尽量选择高质量的检测试剂。（２）检测前应将试剂在　（１）避免使用溶血和混有红细胞的血清标本。血红蛋白　室温中平衡２Ｏ～３０　ｍｉｎ，使温育反应步骤中反应微孑Ｌ的温度可　（Ｈｂ）分子中的血红素基团含有类过氧化物酶的活性物质，如　较快达到所要求的温度，从而避免弱阳性标本出现假阴性结　血清标本中Ｈｂ浓度较高，则容易在温育过程中吸附于固相载　果。（３）必须使用符合质量要求的蒸馏水或去离子水配制洗　体表面，导致以辣根过氧化物酶（ＨＲＰ）为标记酶的ＥＬＩＳＡ检　板液。　国际检验医学杂志２０１３年１月第３４卷第１期Ｉｎｔ　Ｊ　Ｌａｂ　Ｍｅｄ，Ｊａｎｕａｒｙ　２０１３，Ｖｏ１．３４，Ｎｏ．１　・　１１３　・　３检测过程中各环节应注意事项　忽视，否则将影响检测结果的准确性ｌ５］。一般而言，弱阳性质　３．１质量控制每次检测均应设置双孑Ｌ阳性与阴性对照，并　控品无法检出可能与试剂质量缺陷、温育时间及温度不够、显　绘制标准曲线。　色和反应时间太短或检测用水有问题等有关；检测结果重复性　３．２加入标本及试剂　微量加样器必须经过校准，使用洁净　差可能与标本或试剂加入量不准确、加入速度过快导致孔间污　的加样吸管　；标本需加在微孔板底部，如加在孑Ｌ壁上部的非　染及温育、洗板、显色时间不一致等因素有关；阴阳对照品检测　包被区，易导致非特异性吸附；加样速度不可太快，从而保证加　均不显色可能与漏加酶结合物、洗板液中含有酶抑制剂（如　样准确性和均匀性；避免标本溅出和产生气泡，从而避免孔间　ＮａＮ。）、漏加显色剂及终止液当显色剂使用等因素有关；阴阳　污染及反应界面的差异。试剂使用前需颠倒混匀数次，并垂直　性对照品检测均显色或间隔有规律地显色可能与洗板不彻底　加入微孔板中；试剂滴加速度不能太快，否则很容易出现重复　（如洗板机中无洗板液、洗板针堵孔、洗板机管道密封不严导致　滴加或试剂黏附于孔壁上部，从而导致在非包被区出现非特异　不能形成有效负压）、洗板液受酶污染和显色剂变质等因素有　性吸附，引起非特异性显色，造成假阳性结果；每一步试剂都不　关。对于灰区标本（通常将临界值上下限一定范围设为灰区）　可遗漏，否则将导致假阴性结果。　应重复检测，以避免假阳性和假阴性结果　］。　３．３温育的温度及时间　ＥＩ　ＩＳＡ作为一种固相免疫测定方　为保证ＥＬＩＳＡ检测质量，在实际工作中一定要按操作规　法，抗原抗体的结合反应在固相上进行，且必须保证一定的温　程和试剂说明书的要求进行＿７］，重视每一步操作细节，从而保　育温度和时间。如温育温度较低，可能出现弱阳性标本漏检的　证检测质量，为临床提供准确、可信的诊断依据。　情况。为了使反应微孔尽早达到３７℃，可在检测前对微孔板　进行温育。检测过程中进行温育时，需在微孔板表面加贴封　参考文献　片，从而防止孑Ｌ内液体成分蒸发或水珠等杂质滴人孔内引起的　［１］陈慰峰．医学免疫学［Ｍ］．４版．北京：人民卫生出版社，２００４：２４４—　污染；封片不能重复使用，以免引起交叉污染。　２４５．　３．４洗板使用符合要求的蒸馏水或去离子水配制洗板液，　［２］王兰兰．临床免疫学和免疫检验［Ｍ］．３版．北京：人民卫生出版　且洗板液应在临用前配制。严格按操作说明书设定洗板机的　社，２００３：９１—９２．　各项参数，注意观察洗板液加入量是否充足；保持洗板针通畅，　［３１孙艳霞．简要分析标本溶血对Ｅ１　ＩＳＡ检测血清乙肝表面抗原的　及时清除洗板针内积存的纤维蛋白原等杂质；洗板后须在干净　影响［Ｊ］．标记免疫分析与临床，２００９，１６（４）：２５３—２５４．　的吸水纸上拍干。　［４１谢璩，崔江龙．ＥＬＩＳＡ法对乙肝六项检测结果的影响及处理对策　［Ｊ］．实验与检验医学，２０１１，２９（１）：８４—８５．　３．５加入显色剂与终止液　显色剂应在临用前配制，加显色　［５］岳希全，石宏，李迎．Ｅｌ　ＩＳＡ法检测ＨＢＳＡｇ影响结果的重要因素　剂不能溅出孔外，加终止液时要避免产生气泡，以免酶标仪比　分析ＥＪ３．中国实验诊断学，２００７，１１（２）：２１３－２１５．　色时结果不准确。　［６１伍伟健，郭如华．ＥＬＩＳＡ试验灰区设置方法的探讨［Ｊ］．中国生物　３．６结果判读使用酶标仪判读结果时，应注意阴阳性对照　制品学杂志，２００８，２１（１０）：９１１　９１２．　空ＯＤ值设定及试剂盒提供的阴阳性对照品检测值上下限等　［７］叶应妩，王毓三，申子瑜．全国临床检验操作规程［Ｍ］．３版．南京：　诸多因素。　东南大学出版社，２００６：６１８　６１９．　４讨　论　ＥＩ　ＩＳＡ检测步骤简单，但操作过程中的各个环节都不可　（收稿日期：２０１２－０８—２８）　・经验交流・　２１０例肝病患者血清肝纤维化指标检测结果分析　史连盟，郝玉梅　（西宁市第三人民医院内科，青海西宁８１０００５）　摘要：目的探讨血清透明质酸（ＨＡ）、Ⅲ型前胶原（ＰＣ—ＩＩＩ）、Ⅳ型胶原（Ⅳ一Ｃ）和层黏连蛋白（ＬＮ）检测在肝纤维化诊断中的　价值及其临床意义。方法　采用放射免疫法检测２１０例肝病患者及５５例健康者血清ＨＡ、ＰＣ－Ⅲ、ＩＶ—Ｃ和ＬＮ水平。结果　慢性　乙型病毒性肝炎（简称慢性乙肝）、肝硬化、肝癌患者血清ＬＮ、ＨＡ、ＰＣ—Ｉｌｌ和Ⅳ一Ｃ水平高于健康者（Ｐ＜Ｏ．０５），肝硬化、肝癌患者血　清Ｉ　Ｎ、ＨＡ和Ⅳ一Ｃ水平高于慢性乙肝患者（Ｐ＜Ｏ．０５），肝硬化、肝癌患者血清ＰＣ－ｌｌＩ水平与慢性乙肝患者比较无统计学差异（Ｐ＞　０．０５），急性肝炎、丙型病毒性肝炎患者血清ＬＮ、ＨＡ、ＰＣ—Ｉｌｌ和Ⅳ一ｃ水平与健康者比较没有统计学差异（Ｐ＞０．０５）。结论　Ｉ　Ｎ、　ＨＡ、ＰＣ－Ｉｌｌ和Ⅳ一Ｃ是反映肝脏状况和肝纤维化程度的良好指标，动态观察其变化可用于判断患者病情进展，也可用于判断患者治　疗效果。　关键词：肝病；肝纤四项；肝纤维化　ＤＯＩ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１６７３—４１３０．２０１３．０１．０６０　文献标识码：Ｂ　文章编号：１６７３—４１３０（２０１３）０１—０１１３—０２　肝纤维化是指由各种急慢性肝病引起的肝脏持续创伤修　纤维化尚有逆转至正常的可能，而肝硬化则没有，阻止或延缓　复反应导致细胞外基质过度沉积和肝功能损伤，进而导致肝脏　肝纤维化发生、发展有助于治愈大部分慢性肝病患者，因此肝　纤维结节形成并破坏正常肝脏结构，最终发展成为肝硬化而出　纤维化早期诊断十分重要　。肝纤维化诊断以组织病理学检　现肝功能衰退，甚至有演变为肝癌的可能　。有学者认为肝　查为金标准，但该项检查具有创伤性，且不便于多次进行。为　此，笔者检测了多种类型肝病患者血清肝纤维化标志物水平，包