美国芝加哥大学分子肿瘤实验室提供
一、 准备试剂：
1、 TBST (Tris-Buffered Saline-Tween-20):
10mM Tris-HCl (pH8.0)
150mM NaCl
0.05% Tween-20 (after all and water are mixed, add tween-20)
2、 Transfer Buffer:
800ml 甲醇（终浓度为20％）
12.12g Tris Base
57.63g 甘氨酸
加入ddH2O 使总量达到4L
注意： 最终pH 值应该是 8.3~8.6, 但不能通过加酸或者碱来调节。
二、实验步骤（一些具体步骤可以参考NC膜的方法）：
1、 首先，将蛋白质样品在SDS-PAGE胶中进行电泳（180V，30mA）。
2、 将转移膜（PVDF）在甲醇中浸泡1分钟后，去离子水中洗涤3次，浸泡于转移缓冲液中待用。
3、 组装转移组合，顺序如下：
负极起：塑料底垫——底层泡沫——滤纸——SDS-PAGE胶——PVDF膜——滤纸——上层泡沫——塑料底垫
注意：应该绝对避免层与层之间有气泡的现象。
4、 将转移组合放入转移电泳槽中进行蛋白质转移（4°C最佳）。转移条件
为： 250mA ，60-100 minutes 。
5、 转移完成后，将PVDF膜取出，采用封闭液 (5-10% milk-TSBT) 在摇床上
封闭2小时或过夜。
6、 准备一抗：按一般推荐比例1:500-1:1000将一抗稀释在封闭液中。
7、 将PVDF膜直接放入一抗-封闭液混合液体中，液体能够覆盖膜表面即
可 ，室温下在摇床上震荡1-2小时。
注意：绝对避免让膜变干的现象
8、 使用TBST缓冲液洗涤PVDF膜3次，每次5分钟。
9、 准备二抗：按一般推荐比例1:5,000-10,000将二抗稀释于TBST缓冲液中（二抗直接联结于辣根过氧化酶HRP）。
10、将PVDF膜放入二抗-TBST混合液中，室温下在摇床上震荡1小时。
11、使用TBST缓冲液洗涤PVDF膜3次，每次5分钟。
12、显色：按照显色底物说明配制HRP反应底物，将PVDF膜放入显色底物中，反应1分钟后取出。
13、将PVDF透明薄膜包装后防入X成像系统中曝光，或直接于成像系统中成像。
注意：如使用二抗联结生物素-亲和素-辣根过氧化酶系统，则在第11步后，加入 亲和素-辣根过氧化酶（于TBST中按1：5000-10000稀释）混合液，室温下摇床震荡30分钟，然后TBST洗涤3次，每次5分钟。再最后进入步骤12。
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