配比用表
今天作的实验是利用硫酸铵沉淀蛋白质,从之前作过的经验知道,这一个步骤是有名的烦,要慢慢用敲的把硫酸铵缓缓的加入蛋白质溶液中。
相关的原理可以在庄荣辉学习网站中找到,与盐溶刚好相反,在蛋白质溶液中加入硫酸铵,会使得蛋白质的溶解度下降,因而沉淀出来。因为硫酸铵所解离的离子容很大,所带的电子数也多(NH4+, SO42-),因此当其溶入水中时,会吸引大量水分子与这些离子水合。
蛋白质分子表面多少有一些较不具极性的区域,水分子会在这些非极性区的表面聚集,形成类似『水笼』的构造(请见下图),以便把蛋白质溶入水中。一旦蛋白质溶液加入硫酸铵,后者吸引了大量水分子,使水笼无法有效隔离蛋白质的非极性区,造成这些非极性区之间的吸引,因而沉淀下来。因此,分子表面上若有越多的非极性区域,就越容易用硫酸铵沉淀下来。
在计算所添加的硫酸铵的重量方面,找到了一个不错的网站——硫酸铵计算机
这个网页上可以靠着输入实验温度、溶液体积、想要到达的百分浓度以及初始的百分浓度这四个数值,就可以得到需要添加的硫酸铵克数,以及在加入固体硫酸铵后所增加的体积,算是一个很不错的网站。
此外另一个比较值得提的,是我有用两种方式加入硫酸铵,第一种是固体的硫酸铵模碎加入,另一种是将硫酸铵溶成饱和溶液再加入,各有各的优缺点,比较如下:
1.造成蛋白质变质的程度:固体的硫酸铵>硫酸铵饱和溶液
利用硫酸铵饱和溶液真的超棒,滴入的速度可以很快而不造成变质(没试过用倒入的)。 不像固体的硫酸铵只能磨碎慢慢加入,速度一快蛋白质就坏了(溶液有致密的白色气泡产生)。
2.操作的容易度: 硫酸铵饱和溶液>>固体的硫酸铵
固体硫酸铵最大的缺点就是操作不容易,要一直敲敲敲又不能太快,所以当你要溶解的蛋白质很多时,这是很累的步骤。然而硫酸铵饱和溶液比较麻烦只有在配制部分,要先加热让它饱合后,回到操作温度让它过饱和,最后用滤纸把硫酸铵结晶去掉。
3.蛋白质溶液的体积放大程度 硫酸铵饱和溶液>>固体的硫酸铵
这是使用硫酸铵饱和溶液最头痛的部分,举例来说,要让100 ml的硫酸铵百分比从0%到25%, 如果是加入固体的硫酸铵,只会让溶液从100 ml变成107 ml左右,但若是加入硫酸铵饱和溶液,会让溶液变成125 ml!而且若是要提高到50%,须加等量的硫酸铵饱和溶液,所以会让蛋白质溶液从100 ml变成200 ml。
因此在加入硫酸铵时,若是低百分浓度可以利用硫酸铵饱和溶液,然而如果是高百分浓度的,除非不在意蛋白质溶液体积的放大(反正都要离心离下来),否则还是用固体硫酸铵来的好。
所以今天从0%拉到25%及从25%拉到50%时,都是利用硫酸铵饱和溶液,但是当要从50%拉到75%时,我选择利用固体硫酸铵,因为如果用硫酸铵饱和溶液, 离心机无法离那么多的溶液体积。
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