(12)发明专利申请
(10)申请公布号 CN 107918016 A(43)申请公布日 2018.04.17
(21)申请号 201710852332.6(22)申请日 2017.09.19
(71)申请人 中华人民共和国龙口出入境检验检
疫局
地址 265700 山东省烟台市龙口市港城大
道府东二路广电大楼(72)发明人 苏远科 王辉 王猛 刘同辉 (74)专利代理机构 北京快易权知识产权代理有
限公司 11660
代理人 陈伊雯(51)Int.Cl.
G01N 33/569(2006.01)
权利要求书1页 说明书6页 附图2页
CN 107918016 A(54)发明名称
一种基于生长曲线对食品中沙门氏菌定量检测的方法(57)摘要
本发明属于食品检测技术领域，公开了一种基于生长曲线对食品中沙门氏菌定量检测的方法，建立酶联免疫分析仪(Vidas)测试值与沙门氏菌浓度函数关系C1；对沙门氏菌缓冲蛋白胨培养液梯度稀释，对各个梯度稀释液进行计数，同时使用酶联免疫分析仪对各个梯度沙门氏菌稀释液检测获得测试值，建立Vidas测试值与沙门氏菌浓度数学函数关系式；绘制生长曲线，通过生长曲线得出增菌培养一定时间后沙门氏菌浓度x与接种量y的函数关系C2。本发明通过制定不同接种量细菌的生长曲线，建立经增菌一定时间h后沙门氏菌浓度与接种量(增菌前起始含量)函数关系；通过函数关系得知接种浓度，既是样品中沙门氏菌含量。
CN 107918016 A
权 利 要 求 书
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1.一种基于生长曲线对食品中沙门氏菌定量检测的方法，其特征在于，所述基于生长曲线对食品中沙门氏菌定量检测的方法包括：
建立酶联免疫分析仪测试值与沙门氏菌浓度函数关系C1；对沙门氏菌缓冲蛋白胨培养液，进行多个梯度稀释；对各个梯度稀释液进行计数，同时使用酶联免疫分析仪对不同梯度的沙门氏菌稀释液检测并获得测试值，建立Vidas测试值与沙门氏菌浓度函数关系式；使用不同浓度沙门氏菌分别接种增菌液；绘制不同接种浓度的沙门氏菌在培养液中的生长曲线；通过生长曲线得出增菌培养一定时间后沙门氏菌浓度与接种量的函数关系C2；沙门氏增菌培养后经酶联免疫分析仪检测读取荧光值通过函数C1得到增菌液中沙门氏菌浓度，通过函数C2得知接种量，得到样品中沙门氏菌含量。
2.如权利要求1所述的基于生长曲线对食品中沙门氏菌定量检测的方法，其特征在于，所述酶联免疫分析仪测试值与沙门氏菌浓度函数关系C1为：y＝0.102x3-0.648x2+1.563x+5.826；相关系数R2＝0.994，x测试值，y沙门氏菌浓度为对数形式，0.2 3.如权利要求1所述的基于生长曲线对食品中沙门氏菌定量检测的方法，其特征在于，所述基于生长曲线对食品中沙门氏菌定量检测的方法，具体包括以下步骤： 步骤一、建立酶联免疫分析仪测试值与沙门氏菌浓度函数关系，肠炎沙门氏菌株纯化后，挑去单菌落接种于缓冲蛋白胨水中10-20mL，36℃培养12-18h；分别进行10倍稀释，5倍稀释，4倍稀释3倍稀释和2倍稀释； 步骤二、选取2、3、4、5、10、20、30、40、50、100、200、300、400、500、1000倍稀释液使用Vidas检测，同时使用3M细菌菌落计数测试片对培养液进行计数。 步骤三、建立Vidas测试值与沙门氏菌浓度数学函数关系式；步骤四、使用不同浓度沙门氏菌分别接种TTB、SC增菌液100mL于42℃和36℃培养间隔1个小时或2个小时取样，使用测试片对沙门氏菌计数，培养至16-20h； 步骤五、绘制不同接种浓度沙门氏菌在两种培养液中的生长曲线；步骤六、建立增菌培养一定时间h后沙门氏菌浓度与沙门氏接种量函数关系。4.如权利要求1所述的基于生长曲线对食品中沙门氏菌定量检测的方法，其特征在于，步骤一中，36℃培养16h。 5.如权利要求1所述的基于生长曲线对食品中沙门氏菌定量检测的方法，其特征在于，步骤六中，增菌培养时间h为8h或9h。 6.一种如权利要求1所述基于生长曲线对食品中沙门氏菌定量检测的方法的基于生长曲线对食品中沙门氏菌定量检测系统。 2 CN 107918016 A 说 明 书 1/6页 一种基于生长曲线对食品中沙门氏菌定量检测的方法 技术领域 [0001]本发明属于食品检测技术领域，尤其涉及一种基于生长曲线对食品中沙门氏菌定量检测的方法。 背景技术 [0002]沙门氏菌属(Salmonella)是一大群寄生于人类和动物肠道内，生化反应和抗原构造相似的革兰氏阴性杆菌，有的专对人类致病，有的只对动物致病，也有对人和动物都致病，这些统称为沙门氏菌。沙门氏菌目前已经发现1800种以上，按抗原成分可分为甲、乙、丙、丁、戊等基本菌型。其中与人类疾病有关的主要有甲组的副伤寒甲杆菌，乙组的副伤寒乙杆菌和鼠伤寒杆菌，丙组的副伤寒丙杆菌和猪霍乱杆菌，丁组的伤寒和肠炎杆菌。此菌可引起禽伤寒、鸡白痢、猪霍乱、鼠伤寒沙门氏菌病、猪副伤寒、马流产沙门氏菌病等疾病。致病性最强的是猪霍乱沙门氏菌(Salmonella cholerae)，其次是鼠伤寒沙门氏菌 (Salmonella typhimurium)和肠炎沙门氏菌(Salmonella enteritidis)。感染沙门氏菌或食用被带菌者粪便污染的食品，可使人发生食物中毒。据统计在世界各国的种类细菌性食物中毒中，沙门氏菌引起的食物中毒常列榜首。[0003]在食品安全日益受到重视的今天，致病性微生物引起食物中毒依然是关注的焦点。如何提高检测的准确性，检测效率，是我们检验检疫行业及其他相关部门一直不懈努力的方向。检测技术不断改进，各种先进设备和检测技术不断涌现。 [0004]国内外对食品中沙门氏菌的检测技术或检测方法研究并不鲜见。这些方法大多是对沙门氏菌的定性检测，但是对沙门氏菌定量研究很少。目前涉及沙门氏菌检验的标准主要有食品安全国家标准食品微生物学检验沙门氏菌检验 GB4789.4-2010，出口食品沙门氏菌属(包括亚利桑那菌)检验方法SN0170-1992，SN/T1509.7-2010进出口食品中沙门氏菌检验方法实时荧光PCR法。GB/T 28642-2012饲料中沙门氏菌的快速检测方法聚合酶链式反应(PCR)法，SN/T 1059.1-2002进出口食品中沙门氏菌滤膜筛选法，SN/T0040-1992出口食品沙门氏菌属(包括亚利桑那菌)计数检验方法。其中SN/T0040-1992是沙门氏菌定量方法原理基于MPN法，其他国标或行标都是定性检测。SN/T0040-1992虽然可以定量检测但是缺点操作繁琐，需要稀释三个梯度或更多，每个梯度三管共九管，每个管都要进行阴阳性判断才能确定，耗时费力。由于从225mL10倍样品稀释液中取1mL用来增菌培养存在漏检风险。[0005]综上所述，现有技术存在的问题是：现有的对沙门氏菌定量检测，需要稀释三个梯度或更多，每个梯度三管共九管，每个管都要进行阴阳性判断才能确定，耗时费力；并且由于从225mL10倍样品稀释液中取1mL用来增菌培养存在漏检风险。 发明内容 [0006]针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种基于生长曲线对食品中沙门氏菌定量检测的方法。 [0007]本发明是这样实现的，一种基于生长曲线对食品中沙门氏菌定量检测的方法，所 3 CN 107918016 A 说 明 书 2/6页 述基于生长曲线对食品中沙门氏菌定量检测的方法包括： [0008]建立酶联免疫分析仪测试值与沙门氏菌浓度函数关系C1 (y＝0.102x3-0.648x2+1.563x+5.826相关系数R2＝0.994，x测试值，y沙门氏菌浓度为对数形式，0.2 [0018]本发明的另一目的在于提供一种基于生长曲线对食品中沙门氏菌定量检测系统。[0019]本发明的优点及积极效果为：建立数学模型，表示抗原(沙门氏菌浓度) 和荧光值间的数学关系。通过制定不同接种量细菌的生长曲线，建立经增菌时间h后沙门氏菌浓度与接种量(增菌前起始含量)函数关系。把两个联系起来通过Vidas荧光值得到培养一定时间的增菌液中沙门氏菌浓度，通过后者函数关系得知接种浓度，既是样品中沙门氏菌含量。附图说明 [0020]图1是本发明实施例提供的Vidas测试值横坐标与菌浓度纵坐标(取对数值) 函数关系示意图； [0021]图2是本发明实施例提供的肠炎沙门氏菌若干稀释梯度在SC增菌液36度培养生长曲线示意图； [0022]图3是本发明实施例提供的肠炎沙门氏菌若干稀释梯度在TTB增菌液42 度培养生长曲线示意图； [0023]图4是本发明实施例提供的基于生长曲线对食品中沙门氏菌定量检测的方法的流 4 CN 107918016 A 说 明 书 3/6页 程图。 具体实施方式 [0024]为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。 [0025]下面结合附图及具体实施例对本发明的应用原理作进一步描述。[0026]材料，仪器设备和试剂的选择：[0027]试管20mm×150mm：三角瓶或广口瓶200mL和500mL；平皿，直接90mm；吸管1mL和10mL移液器1mL；试管振荡器。 [0028]MiniVidas酶联免疫分析仪，恒温培养箱36℃和42℃。[0029]缓冲蛋白胨水(BP)，亚硒酸盐胱氨酸增菌液(SC)，四硫磺酸盐煌绿增菌液(TTB)，3M菌落总数测试片。 [0030]肠炎沙门氏菌株，大肠杆菌，奇异变形菌(购置中国工业菌种保藏中心)。[0031]图1中，Vidas测试值与沙门氏菌浓度(对数值)函数关系，用一元三次方程表示，相关系数R2＝0.994，x值适应范围0.2至3.8，对应沙门氏菌浓度范围约106至108，因为vidas对沙门氏菌检测底限约在106cfu/mL，而菌浓度超过 108会出现x值钝化状态，既是当菌浓度大于108cfu/mL vidas荧光值变化不明显处于基本稳定状态3.8左右，应该是与抗原抗体结合饱和有关。这样通过vidas 测试值和上公式计算出对应的沙门氏菌浓度。 [0032]表1验证试验中通过vidas检测得到数值代入公式计算值与实测值对比分析 [0033] [0034] 验证试验，取经过一系列稀释梯度的肠炎沙门氏菌液6管分别对其进行 vidas检 测和使用3M测试片计数见表1，可见通过vidas检测计算值与测试片所得值相对误差最小0.13％，最大2.50％，平均相对误差1.33％。[0035]图2中，肠炎沙门氏菌若干梯度(0.58cfu/mL、5.8cfu/mL、20cfu/mL、 58cfu/mL、200cfu/mL、580cfu/mL)在sc增菌液36度培养生长曲线。可以看出 图2有几条近乎平行的曲线组成，其中每条曲线就是一定接种浓度肠炎沙门氏 菌在0-16h的生长曲线。每条曲线都有三段既调整期、对数期和平稳期组成。调 整期大约两个小时随后进入时间不等的对数期接着曲线斜率慢慢变小进入平稳 期。生长曲线对数期的中后期培养大约8-10h是进行vidas检测较好时机，因为 vidas最佳检测区间在沙门氏菌浓度在106到108，这时各梯度生长曲线区分度 分较好，进入平稳期曲线则近于粘合。[0036]图3为接种浓度(1cfu/mL、10cfu/mL、50cfu/mL、150cfu/mL、380cfu/mL) 在TTB42度培养的生长曲线。和图2类似曲线有3部分组成分别是调整期，对数期和稳定期，区别是在 5 CN 107918016 A 说 明 书 4/6页 TTB中生长曲线的对数期要短些，培养12h后基本进入稳定期，以接种1cfu/mL为例经过2h的调整期进入对数期约14h后进入稳定期，不同接种浓度沙门氏菌在调整期都是2h不同的是浓度越高对数期时间越短更早的进入稳定期，比如接种380cfu/mL培养9h进入稳定期，150cfu/mL则需要10h，50/mL要12h，1cfu/mL要14h才进入稳定期。可见接种浓度越高进入稳定期时间越短。 [0037]选用样品常温和冷鲜猪和鸡肉25g进行人为污染，放入25mL增菌液均质1 分钟，然后加入剩下的200mL增菌液置于36度和42度培养。 [0038]表2加入系列浓度沙门氏菌的人为污染样品在sc增菌液中增菌9h后vidas检测。 [0039] [0040][0041] 表3实际添加肠炎沙门氏浓度和检测值比较分析 [0042][0043] 表4加入系列浓度沙门氏菌的人为污染样品在ttb增菌液中增菌9h后vidas检测。 [0044][0045] 表5实际添加肠炎沙门氏浓度和检测值比较分析 通过表3可以看出只有第一个样品相对误差较大为54.40％，其他均在10％以内。 通过表5可以看出第一组样品相对误差在28.6％其他平均8.0％[0047]选择大肠杆菌，金黄色葡萄球菌，单核细胞增生李斯特氏菌，变形杆菌作为干扰 [0046] 6 CN 107918016 A 说 明 书 5/6页 菌。设置两组相同的样品，一组如同验证试验部分，只添加一定浓度的肠炎沙门氏菌到样品中，另一组在第一组的基础上添加干扰菌混合液包括大肠埃希菌，金黄色葡萄球菌，单增李斯特氏菌和变形杆菌，每种干扰菌的添加量均是目标菌10倍以上。操作同验证试验部分，在SC增菌液中增菌10h，使用 vidas对增菌液检测。每种干扰菌的添加量均是目标菌10倍以上。操作同验证试验部分，在SC增菌液中增菌10h，使用vidas对增菌液检测。见表4。[0048]表6干扰试验第一组样品和第二组添加干扰菌的样品经过SC增菌10h vidas检测结果。 [0049] vidas检测值带入方程y＝0.102x3-0.615x2+1.403x+5.991得到值代入方程 y＝ 1.028*X-5.202，根据增菌10h曲线方程，得到对增菌液中肠炎沙门氏菌起始浓度估计。[0051]vidas检测值带入方程y＝0.102x3-0.615x2+1.403x+5.991得到值代入方程 y＝1.028*X-5.202根据增菌10h曲线方程，得到对增菌液中肠炎沙门氏菌起始浓度估计。 [0052]表7第一组样品和第二组添加干扰菌的样品的增菌液初始沙门氏菌浓度估算cfu/mL [0050][0053] 通过表7表明干扰试验中对含有干扰菌的样品检测与不含干扰菌的检测误差平均 值为0.17，相对误差平均值在11.0％。 [0055]对鲜肉及制品中肠炎沙门氏菌定量检测研究，基于沙门氏菌在选择性增菌液中的生长曲线。选择性增菌液对干扰菌会有一定的抑制作用，同时还能促进沙门氏菌的生长，这样能够更好的对目标菌的分离。通过生长曲线可以看出，无论接种浓度大小，都经历2h停滞期(适应期)然后进入对数生长期，对数生长期随着接种菌浓度增加而缩短，进过培养9-16h不同接种浓度沙门氏菌基本上都到达平稳期菌含量在5-8×108cfu/mL。在对数生长期不同接种浓度沙门氏菌形成斜率基本相同的平行斜线，如在SC增菌液中对数期生长曲线斜率在 0.71-0.73。对数生长期某一定时间不同接种浓度的沙门氏菌增殖达到浓度形成一定斜率的直线，如SC增菌中培养9h时得出方程y＝1.028×X-5.202相关系数 R2＝0.995，根据此方程和此时增菌液沙门氏菌浓度x可以计算出增菌液初始接种浓度。本发明中使用vidas对增菌液浓度检测根据检测值与菌浓度数学模型 y＝0.102x3-0.648x2+1.563x+5.826相关系数R2＝0.994，0.2 7 CN 107918016 A[0056] 说 明 书 6/6页 如图4所示，基于生长曲线对食品中沙门氏菌定量检测的方法包括以下步骤： [0057]S101、建立酶联免疫分析仪测试值与沙门氏菌浓度函数关系，肠炎沙门氏菌株纯化后，挑去单菌落接种于缓冲蛋白胨水中10-20mL，36℃培养12-18h；分别进行10倍稀释，5倍稀释，4倍稀释3倍稀释和2倍稀释。[0058]S102、选取2、3、4、5、10、20、30、40、50、100、200、300、400、500、 1000倍稀释液使用Vidas检测，同时使用3M细菌菌落计数测试片对培养液进行计数。[0059]S103、建立Vidas测试值与沙门氏菌浓度数学函数关系式。[0060]S104、使用不同浓度沙门氏菌分别接种TTB、SC增菌液100mL于42℃和 36℃培养间隔1或2个小时取样，使用测试片对沙门氏菌计数，培养至16-20h。[0061]S105、绘制不同接种浓度沙门氏菌在两种培养液中的生长曲线。[0062]S106、建立增菌培养一定时间h后沙门氏菌浓度与沙门氏接种量(沙门氏菌起始含量)函数关系。 [0063]以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。 8 CN 107918016 A 说 明 书 附 图 1/2页 图1 图2 9 CN 107918016 A 说 明 书 附 图 2/2页 图3 图4 10 因篇幅问题不能全部显示，请点此查看更多更全内容