聚丙烯酰胺电泳法测定小麦种子纯度方法的改进

维普资讯 http://www.cqvip.com 第８卷第２期　分析测试技术与仪器　Ｖｏｌｕｍｅ　８　Ｎｕｍｂｅｒ　２　２００２年６月　ＡＮＡＬ　ｓＩＳ　ＡＮＤ如　Ｓ叨ｌＮＧ　ＴＥＣＨＮＯＵ０ＧＹ　ＡＮＤ　ＩＮ　ＵＭＥＮｑＳ　Ｊｕｎｅ　２００２　分析测试经验介绍（１１９～１２１）　聚丙烯酰胺电泳法　测定小麦种子纯度方法的改进　习　莉　，李亚兰，李芳芳　（西北农林科技大学测试中心，陕西杨陵７１２１００）　摘要：使用ＳＥ－－２０００Ａ型对小麦、玉米专用的电泳仪，对ＧＢ／Ｔ３５４３．５—１９９５聚丙烯酰胺电泳法测定小麦种子纯度方　法的样品提取、点样量及电泳条件进行了改进．结果表明：改进后使麦醇溶蛋白电泳图谱的蛋白质区带界限更明　显，公共带和特征带清晰、可靠，且样品提取时间缩短了２３．５　ｈ．　关键词：聚丙烯酰胺；电泳图谱；小麦；种子；纯度　中图分类号：０６５７．７　文献标识码：Ｂ　文章编号：１００６．３７５７｛２（Ｘ）２｝０２—０１１９—０３　种子贮藏的蛋白主要是醇溶蛋白　］．不同品种　依照ＧＢ／Ｔ３５４３．５—１９９５附录Ａ３．１１３　Ｊ分别选取　所特有的蛋白组成能反映出该品种的基因组成　Ｊ，　上述供试材料各４００粒，单粒小麦种子用单粒粉碎　且有不同的遗传特性．能够得到其清晰、稳定、准确　器粉碎后，置１．５　ｍＬ离心管中，加入蛋白质提取液　的电泳图谱，对鉴别种子真实性及纯度十分重要．　（每管加０．２　ｍＬ）充分摇动混和，室温静置２４　ｈ，再于　作者在实施ＧＢ／Ｔ３５４３．５—１９９５附录Ａ聚丙烯酰胺　１８　０００　ｒ／ｍｉｎ条件下离心１５　ｍｉｎ，取上层清液备用．　电泳法测定小麦种子纯度的方法过程中发现不但其　２．１样品提取改进的两种方法　实用性不佳，且有一些不足之处，因而对部分操作进　２．１．１样品加入蛋白质提取液充分搅动　昆和后，　行了改进，旨在能使他人重复试验结果，获得清晰、　将室温静置２４　ｈ改为低温４±１℃静置２４　ｈ，　准确的电泳图谱．　并于１　８　０００　ｒ／ｍｉｎ离心１　０　ｍｉｎ．　１供试材料和仪器　２．１．２样品加入蛋白质提取液充分搅动混合，室　温静置１０～１５　ｍｉｎ后，再搅动一次，室温静置半小　１．１供试材料　时，上清液备用．　良种陕优２２５，２２５—１２，远丰８９８，陕麦７５７．均　２．２结果分析　。　由西北农林科技大学农学院提供．　从图１～３看出，按标准方法Ｌ３　Ｊ所述提取样品中　１．２仪器　的醇溶蛋白，染色后蛋白质区带界限不明显，谱带失　ＳＥ一２０００Ａ型电泳仪（农业部小麦、玉米种子质　真，染色本底高，分析原因是由于样品中的醇溶蛋白　量监督检验测试中心监制（郑州）），垂直平板凝胶规　在略高温度（室温１８　ｃＩ二）下，放置时间过长，醇溶蛋　格１７．５　ｃｍ×１０．０　ｃｍ×０．１　ｃｍ，样品梳３７齿，样品槽　白水解过度而分解．改进后的两种方法，谱带清晰，　宽度０．３　ｃｍ．　区带界限明显，后者在提取时间上明显优于前者，快　１．３试剂　速简便．　试剂及其配制依照ＧＢ／Ｔ３５４３．５—１９９５附录　ＧＢ／　５４３．５—１９９５附录Ａ３．１没有实施细则，在　Ａ３．１［３１．　实用性方面存在一定缺陷．实验中发现：首先不能　２样品中醇溶蛋白提取方法的改进　取霉烂和变质的病粒，每粒种子粉碎后的细度应尽　作者简介：习莉，女，４６，大专，主要从事农业分析测试工作．　＊　通汛联系人．收稿日期：２０Ｏ２．０１．２０；收到修改稿日期：２００２．０３．２２　维普资讯 http://www.cqvip.com 分析测试技术与仪器　第８卷　量一致，保证提取的蛋白质含量相同，否则，容易造　成误检．其次对待检样品先依照ＧＢ／Ｔ３５４３．３—　１９９５、ＧＢ／　５４３．６—１９９５作水分、净度分析，应选择　的差异．　３选择合适的进样量　标准方法ＧＢ／Ｔ　３５４３．５　Ａ３．４［　，每个样品点样　ｌ０～２０　，选取每个样品点样ｌ５　进行试验，电泳　图谱见图１．　水分含量小于等于１３．０％，净度大于等于９８．０％　的合格种子　Ｊ．因为种子愈干燥、愈易夹碎，醇溶蛋　白取提充分．反之，提取不充分，造成谱带深浅程度　陕麦７５７　远丰８９８　陕２２５　陕优２２５　陕优２２５—１２　—■—一　乙　刁Ｅ习……［＝＝］　表示着色依次减弱　表示扩散带　图１　室温条件下的麦醇溶蛋白电泳图谱模式圈　Ｆｉｇ．１　Ｔｈｅｍｏｄｅ　ｐｒｏｆｉｌｅ　ｏｆｗｈｅａｔ　ｇｌｉａｄｉｎｄｅｃｔｏｐｈｏｒｅ￣ｓＩｒｌｌｌｄｅｌｔ－ｔｈｅ　ｅｏｎｄｉｌｌｏｎ　ｏｆ　ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌｔｅｍｌｍ＇ａｔｕｒｅ　３．１不同进样量的比较试验　白逐一分离，造成谱带重迭或相连，难以分离．加样　过少，谱带丢失，影响准确度．　———————＿＿二＝＿二　＝————～　Ｈ　对同一样品分别点样５　、ｌ０　、ｌ５　．图谱　见图２、图３．３．２结果分析＝＝＝——　图１点样ｌ５　，公共谱带重迭，特征谱带相连．　图２、图３点样５　，谱带之间界限明显，公共带和　—一　■■■●　特征谱带清晰．点样ｌ０　，谱带间界限较为明显，　公共带和特征带较为清晰．点样ｌ５　谱带界限较　亿Ｚ　刁　Ｅ习Ｈ＋　　模糊，公共带和特征带分离效果较差．点样量与凝　胶板面积、厚度及样品槽宽度有关．选用１７．８　ｃｍ　Ｘ　１０．０　ｃｍＸ　０．１　ｃｍ，３７齿，样品槽宽０．３　ｃｍ的凝胶片　点样５　（每　样品液约含０．１～１０　ｇ醇溶蛋白）　较为适量．严防加样过多或过少．加样过多，尚不　ｃｚ：囫仨目　　Ｈ＋　陕优２２５　５　ｌ　１０　ｌ　１５　Ｉ　图２低温条件下的麦醇溶蛋白电泳图谱模式圈　ｉｇ．２　ＴＦｈｅｍｏｄｅ　ｐｒｏｆｉｌｅ　ｏｆｗｈｅａｔ　ｇｌｉａｄｉｎ　ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓＩｌｌｌｄｅｌ＂　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ　ｏｆｌｏｗ　ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ　能把所有不同位点上的不同等位基因编码的醇溶蛋　维普资讯 http://www.cqvip.com 第２期　习　莉等：聚丙烯酰胺电泳法测定小麦种子纯度方法的改进　１２１　处理采取的办法是：用６％（ｗ／ｖ）铬酸洗液浸泡玻　璃板４　ｈ以上，再用２　ｍＬ／１　Ｌ（ｖ／ｖ）聚山梨酯一８Ｏ溶　液浸泡片刻，经过这样处理的玻璃板凝胶很容易完　整揭下，便于照像、扫描和保存．　５　小　结　按统计学观点：一个谱带的出现与否，足以为品　种真实性和纯度鉴定提供最直接的表达方式ｌ５］．然　陕优２２５　５　Ｉ　１０　Ｉ　１５　Ｉ　而要得到准确、可靠的电泳测定结果，测定时应尽量　图３室温条件下的麦醇溶蛋白低温电泳图谱模式图　减少误差，其测定的精确度应在容许误差范围内．　（制备样品室温静置半小时）　经过对上述供试良种的反复试验，对标准方法中样　Ｆｉｇ．３　Ｔｈｅ　ｍｏｄｅ　ｐｒｏｆｉｌｅ　ｏｆｗｈｅａｔ　ｇＵａｄｉｎ　ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ　ａｔ　ｔｈｅ　ｃｏｎｄｉ－　ｉｆｏｎ　ｏｆ　ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ　ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ　品的提取、点样量和电泳条件进行了改进，所做小麦　（ｐｒｅｐａｒａｔｉｖｅ　ｓａｍｐｌｅ　ｗａｓ　ｐｕｔ　ｈａｌｆ　ｈｏｕｒ　ａｔ　ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ　ｃｏｎｄｉｉｔｏｎ）　醇溶蛋白的电泳图谱相对迁移率：１～０．８８区的谱　带为ａ一醇溶蛋白，０．８５—０．７５区的谱带为Ｇ一醇溶蛋　４电泳条件的改进　白，０．７４～０．６６区带的谱带为了一醇溶蛋白，０．５９～　０．２１４区带的谱带为∞一醇溶蛋白．根据谱带特征，供　标准方法ＧＢ／Ｔ　３５４３．５　Ａ３．５［３　Ｊ，工作电压５００　试材料的公共带和特征谱带清晰、可靠、重现性较　Ｖ，１５～２０℃条件下电泳６０～８０　ｍｉｎ．试验在工作电　好，已进入实用阶段．　压４９７±１　Ｖ，１８　ｏｃ条件下，电泳７０　ｍｉｎ．图谱见图１．　电泳在４±１℃冰箱内进行，工作电压４９７±１　参考文献：　Ｖ，电流９６±２　ｍＡ（两板），甲基绿迁移至凝胶下沿用　２５　ｍｉｎ，电泳时间５５　ｍｉｎ，图谱见图２、图３．　［１］赵会贤，薛秀庄．习莉．小麦一黑麦异易位系Ｍ８００３麦谷蛋　室温（１８℃）电泳时，在电流电压的作用下，仅　白电泳分析［Ｊ］．西北农林科技大学学报，１９９２，２０（３）：８６．　１５　ｍｉｎ胶片微热，时间愈长愈热，致使凝胶分子筛孔　［２］郑成超，金锡奎．种子蛋白电泳在品种纯度鉴定中的应用［Ｊ］．　径增大，样品中的蛋白质未能分离而水解变性，凝胶　种子．１９９０，（３）：４５．　［３］中华人民共和国国家标准．农作物种子检验规程［Ｓ］，北京：中　片上只有醇溶蛋白走过的轨迹，无被分离的谱带．　国标准出版社，１９９５，６０－６１．　改进后的电泳条件，弥补了上述不足．　［４］　中华人民共和国国家标准．农作物种子质量标准ＧＢ４４０４．１—　此外，标准没有对玻璃板的预处理进行详述，凝　１９９６　Ｅｓ］．北京：中国标准出版社，１９９７，２．　胶浓度为１０％，胶片脆而粘，与玻璃板粘的紧，电泳　［５］颜启传，邓光联，支巨振．农作物品种电泳鉴定手册［Ｍ］．上　后凝胶片不易揭下而前功尽弃．我们对玻璃板的预　海：上海科学技术出版社，１９９８，７８．　Ｔｈｅ　Ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ　ｏｎ　Ｍｅｔｈｏｄ　ｏｆ　Ｍｅａｓｕｒｉｎｇ　Ｗｈｅａｔ　Ｐｕｒｅｎｅｓｓ　ｂｙ　Ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ　Ｇｅｌ　Ｅｌｅｃｔｒ０ｐｈ０ｒｅｓｉｓ　ＸＩ　Ｌｉ，ＬＩ　Ｙａ—ｌａｎ，ＬＩ　Ｆａｎｇ—ｆｎａｇ　（Ｎｏｒｔｈｗｅｓｔ　Ｓｅｉ—Ｔｅｃｈ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ　ａｎｄ　Ｆｏｒｅｓｔｒｙ　Ｔｅｓｔｉｎｇ　Ｃｅｎｔｒｅ，Ｙａｎｇｌｉｎｇ　７１２１００；Ｃｈｉｎａ）　Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｕｓｉｎｇ　ＳＥ一２０００Ａ　ｔｙｐｅ　ｓｐｅｃｉａｌ　ｗｈｅａｔ　ｎａｄ　ｍａｉｚｅ　ｅｌｅｅｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ　ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ　ｎａｄ　ｔｈｅ　ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ　ｔｏ　ｓａｍｐｌｅ　ｐｒｅｐａ—　ｒａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｅｌｃｅｔｍｐｈｏｍｓｉｓ　ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ　ｉｎ　ＧＢ／Ｔ３５４３．５—１９９５　ＰＡＧＥ　ｅｌｅｅｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ　ｍｅｔｈｏｄ　ａｒｅ　ｄｅｓｃｒｉｂｅｄ．Ｔｈｅ　ｒｅｓｕｌｔ　ｓｈｏｗｅｄ：ｔｈｅ　ｅｌｅｅｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ　ｐｒｏｆｉｌｅｓ　ｏｆ　ｗｈｅａｔ　ｇｌｉａｄｉｎ　ｇｅｔｉｔｎｇ　ｂｙ　ｔｈｅ　ｉｍｐｒｏｖｅｄ　ｍｅｔｈｏｄ　ｈａｖｅ　ｃｌｅａｒｅｒ　ｐｒｏｆｉｌｅ　ｏｕｔｌｉｎｅ，ａｎｄ　ｓａｍｐｌｅ　ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ　ｔｉｍｅ　ｉｓ　ｓｈｏｒｔｅｒ．　Ｋｅｙ　Ｗｏｒｄｓ：ｐｏｌｙａｅｒｙｌａｍｉｄｅ；ｅｌｅｅｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ　ｐｒｏｆｉｌｅ；ｗｈｅａｔ；ｓｅｅｄ　Ｃｌａｓｓｉｆｙｉｎｇ　ｎｕｍｂｅｒ：０６５７．７