褚秀玲袁段玉梅袁曲绪友袁李俊霞袁苏建青
渊聊城大学农学院袁山东聊城圆缘圆园园园冤
摘要院采用细胞培养法对疑似犬细小病毒的粪便和内脏进行了分离和鉴定袁并对分离到的病毒进行生物学特性鉴定和动物回归试验遥结果共分离到猿株悦孕灾袁分离株在猫肾细胞云愿员产生明显细胞病变袁血凝效价达1颐圆7病死亡遥
耀1颐圆10袁细胞病变能被犬细小病毒阳性血清所抑制袁接种幼犬后袁分离株猿可以引起试验犬发
关键词院犬细小病毒曰分离曰鉴定中图分类号院杂愿缘圆援远缘垣怨援圆
文献标识码院粤
文章编号院0439原愿114渊圆园12冤20原4576-03
IsolationandIdentificationofCanineParvovirusonDog
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犬细小病毒渊悦葬灶蚤灶藻责葬则增燥增蚤则怎泽袁悦孕灾冤属于细小后续研究提供一定的理论基础遥
阅晕粤病毒科细小病毒属病毒袁为单股尧负义尧线形无囊膜的
咱员暂员材料与方法炎袁并使白细胞大量减少遥悦孕灾可引起犬的出血性肠胃炎和心肌袁在幼犬中的发病率和死
员援员亡率都很高咱圆暂具有较强的抵抗力遥悦孕灾袁在对多种理化因素和常用消毒剂源耀员园益存活远个月袁猿苑益存牛血清员援员援员材料
尧主要试剂
谷氨酸胺尧阅酝耘酝双抗尧胰蛋白酶等购自大连宝生培养基为郧ibco产品曰小
活圆周袁缘远益存活圆源h袁愿园益存活员缘min袁在粪便中物可存活数月至数年咱猿暂抵抗力咱源暂曰该病毒对乙醚袁氯仿和醇类有
员援员援圆栽葬运葬砸葬有限公司院收集或其他养犬场送检的可疑病料病料为曰其他化学试剂均为分析纯试剂圆园园怨耀圆园员员年聊城大学兽医遥悦孕灾病料袁包括饲养管理条件骤变遥悦孕灾一年四季均可发病尧长途运输尧寒冷袁以冬尧拥挤均可促使
尧春多发咱缘暂袁该病发生咱远暂圆园便中均有大量病毒遥病犬是主要传染源咱苑暂遥根据临床症状和血清学反应袁其呕吐物尧唾液尧粪袁
员援员援猿份粪便样品和试验动物和细胞员园份脏器渊抗悦孕灾匀陨抗体效价小于愿遥
只源园耀缘园员颐源冤袁日龄的山东细健康状况良可做出准确诊断咱8原员猿暂遥本研究通过对山东毒株分离袁犬幼犬好曰猫肾传代细胞系渊云愿1冤和犬肾传代细胞系
并对其部分生物学特性进行研究袁为该病的防治和
渊酝阅悦运冤等由聊城大学农学院实验室保存遥
收稿日期院圆园员圆原园圆原圆苑基金项目院山东省自然科学基金项目渊圆园园怨在砸粤员缘园园缘冤作者简介院褚秀玲渊员怨苑园原冤袁女袁河北张家口人袁副教授袁博士袁主要从事动物疾病发病机理及疾病防控研究袁渊电话冤员缘园圆园远圆远圆猿缘渊电子信箱冤糟澡怎曾蚤怎造岳赠葬澡燥燥援糟燥皂援糟灶曰通讯作者袁苏建青遥.com.cn. All Rights Reserved.第20期褚秀玲等院犬细小病毒的分离与鉴定4577
员援圆员援圆援员方法
试剂的配制
皂蕴袁吸入阿氏液员冤员豫猪红细胞悬液的制备猿耀缘皂蕴袁于健康猪前腔静脉采血遥用圆园皂蕴注射器内员园耀员缘
存的猪红细胞立即混匀袁源袁员益园园园保存备用则辕皂蚤灶离心遥使用时用缘皂蚤灶袁孕月杂洗涤洗涤保猿次袁取红细胞泥员皂蕴加稀释液员园园皂蕴袁再加入小牛血清白蛋白园援员早袁即为员豫猪红细胞悬液加稀释液圆冤匀粤圆缘抗原配制滋蕴袁然后吸取遥用移液器向圆缘滋蕴经福尔马林灭活灾型血凝板每孔遥
的悦孕灾细胞培养物袁在血凝板上倍比稀释袁最后员
孔不稀释袁作为阴性对照曰接着每孔加稀释液圆缘滋蕴和员豫猪红细胞悬液缘园滋蕴袁于振荡器上振荡员皂蚤灶混匀袁于源益冰箱静置员耀圆澡袁待红细胞完全沉淀后判定遥判定的方法是以缘园豫红细胞凝集为终点袁在对照孔红细胞完全不凝集袁呈圆形小点沉于孔底时袁凝集终点的稀释倍数即为该抗原的匀粤效价袁将此效价除以员援圆援圆病料的处理
愿袁即是愿单位血凝抗原的稀释倍数遥液稀释员冤粪便样品的处理则夜辕皂in袁再经离心渊m园援圆圆员园颐m=1颐9冤袁滋皂皂蚤灶袁微孔滤膜过滤除菌取上清再加等量的氯仿混匀院将病犬粪便用阅酝耘酝袁加入双抗袁原圆园圆园园滋蕴袁源袁源培养益保存备益园园园
过
用遥
磨器进行研磨圆冤脏器样品的处理袁并反复冻融遥将脏器样品用灭菌后的研猿次袁同时加入怨倍体积的阅酝耘酝细胞培养液袁缘园园园则辕皂蚤灶离心圆缘皂蚤灶袁取上清液袁经过滤除菌遥将处理好的样品置原圆园益保存员援圆援猿袁待分离鉴定园援圆血清样品遥
匀陨抗体效价的测定
取待检血清
稀释液澡袁离心取上清液待检皂蕴袁加入猪红细胞悬液圆缘滋蕴袁然后吸取待检血清遥先用移液器向血凝板每孔加
员滴袁混匀于室温吸收员圆缘滋蕴袁在血凝板上倍比稀释袁最后圆孔不稀释作为对照袁每孔加愿
单位匀粤抗原圆缘滋蕴袁最后员孔不加袁作为血清对照遥加完后振荡混匀袁于源益冰箱静置员耀圆澡判定遥判定的方法是以完全不凝集为终点袁在抗原对照孔完全凝集袁血清对照孔完全不凝集的情况下袁血清出现终点抑制的稀释倍数员援圆援源袁即为该血清的匀陨效价消化传代后病毒的分离袁按培养液量体积的采用同步接毒法员辕员园袁在接入处理过云愿员细胞
遥的样品袁猿苑益静置培养猿耀缘凿袁每天观察有无细胞病变遥如无细胞病变袁则于培养的第源耀缘凿收取上清袁继续按常规传代培养袁至第缘代仍无病变判为分离结果阴性曰若出现细胞病变则分离结果为阳性袁反复冻融猿次袁收毒袁原圆园益保存遥
员援圆援缘
员冤理化特性生物学特性鉴定
遥按叶动物病毒学曳咱3暂规定进行袁取分离病毒的云愿员细胞培养物袁分别做以下处理院缘园益水浴作用远园皂蚤灶曰加圆园豫乙醚振荡员园皂蚤灶袁放源益
过夜袁并无菌挥发除去全部乙醚曰将病毒液调节责匀为猿时于源益作用处理员澡袁再用园援员皂燥造辕蕴晕葬韵匀调至责匀苑援圆袁进行耐酸性试验袁然后分别用云愿员细胞测定其分别用圆冤红细胞血凝试验栽悦陨阅缘园变化遥
园援缘豫的鸡尧猪尧大鼠遥采用微量血凝尧兔和人渊韵型渊匀粤冤冤的红细胞试验袁悬液测定病毒培养液的肾传代细胞系猿冤细胞敏感谱渊酝阅悦运冤遥选用猫肾传代细胞系匀粤效价遥
作为接种对象袁分别分离得
渊云愿1冤尧犬到HA效价逸1颐128的细胞培养液遥按常规方法进行同步接毒袁猿苑益静置培养圆源澡后袁换液袁每天观察细胞病变缘渊CPE冤袁源耀缘凿收获冻融袁再以同样方法连传员援圆援远代袁以出现悦孕耘作为感染指标遥用所分离的动物回归试验
悦孕灾分离株员袁圆和猿渊匀粤效价均为员颐缘员圆耀员颐圆园源愿冤对试验犬进行人工感染试验遥接种途径为口服袁剂量为缘皂蕴袁设空白对照组和试验组遥将幼犬随机分为源组袁每组圆只遥试验玉组幼犬
接种分离株员曰试验域组幼犬接种分离株圆曰试验芋组幼犬接种分离株猿曰将第源组设为空白对照袁接种生理盐水遥对源组试验犬进行隔离饲养遥接种后袁每天观察试验犬的临床变化并进行体温的测量凿便进行一次白细胞计数袁并进行悦孕灾的匀粤辕袁匀陨自接种后检测遥攻毒后观察缘凿开始收集粪袁每猿员缘凿袁如无眼观临床症状尧白细胞总数正常袁则视为试验犬健康遥
圆结果与分析圆援员病毒分离结果
将处理后的病料接种云愿员细胞后袁采用同步接毒进行病毒分离遥在第一代细胞病变不明显袁但盲传至第猿耀缘代时袁部分接毒细胞出现细胞圆缩尧拉网和脱落等细胞病变袁而对照细胞排列紧密袁生长旺盛袁呈不规则形渊见图员耀圆冤遥试验共从猿份病料中分离出病毒袁分别命名为悦孕灾分离株员尧分离株圆和分离株猿遥
圆援圆处理后员冤生物学特性
理化特性袁通过比较处理前遥经缘园益尧圆园豫后栽悦陨阅乙醚和酸缘园的变化发渊责匀猿援园冤现栽悦陨阅缘园效价相差都小于圆个数量级袁变化不大遥说明分离毒株能抵抗乙醚尧酸渊责匀猿援园冤和热渊缘园益冤袁这与细小病毒理化特性一致遥
.com.cn. All Rights Reserved.4578
湖北农图员对照细胞
图圆接毒细胞
病毒分离株对鸡圆冤红细胞血凝结果尧猪尧大鼠遥采用微量血凝试验测定各尧兔和人红细胞的匀粤效价遥分离株对猪红细胞的凝集效价达到1颐圆7而对其他红细胞的血凝效价为圆园文献记载的悦孕灾血凝谱相符遥
袁没有血凝性耀1颐圆遥10与
曰步接毒培养猿冤细胞感染谱缘代袁并每天观察遥将悦孕灾分离株在多种细胞上同悦孕耘遥结果表明袁有3株CPV分离株连续传代后出现细胞病变现象袁分别命名为分离株1尧2尧3遥
圆援猿动物回归试验结果
用病毒分离株感染幼犬后第缘耀远天袁试验组均发病遥其中试验芋组即接种悦孕灾分离株猿的圆只幼犬在接种后第缘天开始出现临床症状袁精神沉郁袁呕吐袁排稀粪遥随后转为拉血尧脱水尧食欲废绝袁最后死亡遥
对病死幼犬病理剖检发现空肠和回肠局部充血尧粘膜脱落袁肠系膜淋巴结肿胀袁肠腔内有血样粪便遥其他圆组试验组犬接种后第远天表现出精神沉郁袁体温增高袁食欲下降袁拉稀便袁但后来自行康复遥所有接毒试验犬的白细胞总数均出现不同程度的下降遥但对照犬的白细胞总数没有明显变化遥试验组犬在攻毒后缘耀愿凿袁幼犬粪便的匀粤效价为员颐员圆愿耀员颐缘员圆袁对照犬的粪便匀粤检测结果均为阴性遥
业科学2012年
猿讨论猿援员病毒分离
本试验通过采集疑似悦孕灾感染犬的粪便和内脏袁经处理后接种于猫肾细胞分离病毒袁然后通过对分离病毒的生物学特性尧血凝抑制试验和动物回归试验等方法对病毒株进行了鉴定毒失活悦孕灾袁有利于该病毒的分离和纯化无囊膜袁用氯仿处理粪便可使有囊膜的病遥
遥部分出血很明显的细小病毒样本袁反而没有分离出病毒遥可能因为在疾病中后期袁由于肠道出血袁血液中的犬细小病毒抗体和细小病毒形成抗原抗体复合物袁造成样品中的病毒量减少袁细胞分离呈阴性遥粪便中毒素和组织分解代谢产物会对培养细胞产生一定的影响遥因此袁如何处理粪便袁尽量减少对细胞的毒性袁成为能否成功分离病毒的关键遥可以减少接种样本数量渊员辕圆园耀员辕猿园冤袁或接种后及时换液袁可有效降低粪便中毒素对细胞的毒害作用袁提高病毒分离
率遥悦孕灾的复制须完全依赖宿主细胞阅晕粤的复制机制袁复制主要发生在细胞周期的杂期晚期和郧圆早期袁病毒的接种最好采用同步接种方式遥所以袁在试验中采用了同步接毒的办法遥但由于样本的毒性袁可以在传代后远耀愿h再接种袁能减少样本对细胞的影响遥
猿援圆病毒鉴定
通过对分离的病毒进行理化鉴定袁发现所分离的病毒具有抗酸尧抗脂溶剂和耐热的特性袁与文献报道的细小病毒的理化性质一致遥通过对不同动物红细胞的血凝谱测定袁所分离病毒能够凝集猪的红细胞袁不能凝集鸡尧兔和人的红细胞袁与报道的悦孕灾的血凝谱一致遥病毒除了能在云愿员细胞增殖外袁病毒株圆还可以在酝阅悦运细胞增殖遥病毒血凝抑制试验进一步确认所分离的病毒血凝特性能够被犬特异性细小病毒血清抑制袁证明试验中分离到的病毒为犬细小病毒遥
猿援猿动物回归试验
为了检验所分离犬细小病毒的致病性袁进行了动物回归试验袁分别将猿株病毒人工接种试验犬遥动物试验结果显示袁试验组均发病袁表现为拉稀尧脱水尧精神沉郁尧食欲废绝袁对照组健康遥
本试验采用云愿员细胞同步接毒的方式从送检的疑似悦孕灾感染的猿园份样品中分离出猿份悦孕灾阳性样品遥并对分离病毒进行了生物学和动物接种试验袁检验了分离病毒的致病性遥其中分离株猿可以引起接种幼犬死亡袁表明是一株犬细小病毒的强
渊下转第4588页冤
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湖北农业科学2012年
咱猿暂悦匀耘晕早燥遭蚤造燥遭葬藻曾贼则葬糟贼咱允暂援耘曾责藻则蚤灶贼蚤葬袁员怨愿怨袁源缘院苑园愿原苑员猿援凿则燥曾赠造糟燥灶泽贼蚤贼怎原藻灶贼泽悦袁宰耘陨燥枣栽耘郧遭原苑远员栽袁在匀粤韵燥灶月葬责燥责贼燥泽蚤泽蕴袁藻贼葬造援阅蚤枣枣藻则藻灶贼蚤灶则葬贼藻枣枣藻糟贼泽燥枣贼澡藻咱缘暂曹春玲袁则葬凿蚤糟葬造泽咱允暂援晕藻怎则燥灶朱建伟袁任宁袁等杂糟蚤藻灶糟藻援银杏提取物对自然衰老大鼠脑组织蕴藻贼贼藻则袁员怨怨远袁圆员源院员员缘原员员愿援和心肌组织的抗氧化作用咱允暂援中国医疗前沿袁圆园园怨袁源渊圆冤院苑原愿援怎造藻糟藻造造泽蚤灶凿怎糟藻凿遭赠澡赠凿则燥曾赠造则葬凿蚤糟葬造泽咱允暂援月蚤燥糟澡藻皂糟藻则藻遭藻造造葬则酝燥造早则葬灶鄄陨灶贼藻则灶袁员怨怨怨袁源苑院猿怨苑原源园缘援月蚤燥造咱远暂月耘阅云韵砸阅咱源暂晕陨再悦袁在匀粤韵月蕴袁匀韵哉允宰袁藻贼葬造援孕则燥贼藻糟贼蚤燥灶燥枣糟藻则藻遭藻造造葬则皂怎皂燥曾赠早藻灶栽糟燥灶泽怎皂责贼蚤燥灶郧袁栽陨孕栽韵晕燥枣悦则葬贼泽酝袁宰陨蕴杂韵晕葬灶凿蚤贼泽糟澡葬灶早藻泽晕悦袁藻贼憎蚤贼澡葬造援增葬则蚤燥怎泽酝葬曾蚤鄄灶藻怎则燥灶遭赠g蚤灶噪早燥遭蚤造燥遭葬藻曾贼则葬糟贼葬早葬蚤灶泽贼葬责燥责贼燥泽蚤泽蚤灶凿怎糟藻凿遭赠澡赠鄄藻曾责藻则蚤皂藻灶贼葬造责则燥糟藻凿怎则藻泽咱允暂援粤责责孕澡赠泽蚤燥造袁员怨苑怨袁源苑渊远冤院员圆苑愿原员圆愿猿援渊责任编辑程碧军冤
渊上接第4575页冤
苗暂时的中和抗体作用袁造成突然出现的低抗体鸡圆园园远袁圆圆渊缘冤院圆圆员援更加易感咱愿原员园暂副作用袁笔者认为应使用干扰素遥比较两种方案的治疗效果和产生的
咱缘暂陶爱云兽医袁圆园园苑渊园缘冤院源缘援袁王维霞援肉仔鸡新城疫的临床诊断与防制咱允暂援山东畜牧尧白介素等提高机体免疫力的药物进行治疗袁对本病能起到很好的控咱远暂世界动物卫生组织禽鸟与蜜蜂冤咱酝暂援第五版援陆生动物诊断试验和疫苗手册援中国动物卫生与流行病学中心渊哺乳动物袁译尧援制作用遥
北京院中国标准出版社袁圆园园苑援参考文献院
咱员暂姜咱苑暂李春华的原因分析袁王秀满咱允暂援袁养禽与禽病防治王桂英袁等援新城疫引起大批蛋鸡和肉仔鸡死亡袁圆园园园渊源冤院员圆援的疗效观察成袁赖红娥咱允暂援援肉仔鸡非典型新城疫的诊断和用不同方剂治疗黑龙江畜牧兽医袁圆园员员渊1冤院员园原员圆援咱圆暂王咱愿暂董运超病防治袁袁圆园园员渊远冤院员猿援范雪力援控制肉仔鸡非典型新城疫的体会咱允暂援养禽与禽咱猿暂姜八一圆园园愿渊员缘冤院圆猿援军袁梁凤援肉仔鸡新城疫的诊疗体会咱允暂援农村养殖技术袁援山东省肉仔鸡新城疫流行病学调查咱允暂援家禽科学袁咱怨暂李建涛饲料与养殖援脂多糖刺激对肉仔鸡内分泌激素和免疫机能的影响袁圆园园远渊源冤院猿怨咱允暂援咱源暂杨凤娟圆园园远渊远冤院员源原员怨援援一起疫情严重的新城疫病例的诊断咱允暂援广西畜牧兽医袁咱员园暂郝明秋圆园园猿渊源冤院猿员原猿圆援援肉仔鸡非典型新城疫的防治咱允暂援黑龙江畜牧兽医袁渊责任编辑程碧军冤
渊上接第4578页冤
毒株遥本研究为犬细小病毒病的预防和控制提供了圆园园远院源圆圆原源圆缘援理论依据袁同时为深入研究该病毒的致病机理奠定咱苑暂戈中国预防兽医学报锐袁彭广能袁夏咸柱袁圆园园苑袁圆怨渊员员冤院愿猿远原愿猿怨援袁等援犬细小病毒四川株的分离与鉴定咱允暂援了基础遥
参考文献院
咱愿暂杨龙峰序列分析袁李英杰咱允暂援山东畜牧兽医袁艾萍萍袁等援一株犬细小病毒的分离及袁圆园员员袁猿圆渊员冤院远原愿援灾孕圆基因咱员暂马景霞源苑原源怨援援犬细小病毒研究进展咱允暂援山东畜牧兽医袁圆园园愿袁圆怨渊缘冤院咱怨暂易咱圆暂赵世华达咱阅暂援立援北京犬细小病毒的分离鉴定院中国农业科学院袁圆园园愿援尧序列分析及灾孕圆基因的融合表外培养特性研究袁宋爱军袁陈伟咱允暂援畜牧与饲料科学袁等援犬细小病毒袁圆园员园袁猿员渊怨冤院员远愿原员远怨援渊悦孕灾冤内蒙古分离株的体咱员园暂杜学进展强袁袁圆园园怨袁猿园渊猿冤院缘缘原缘愿援邱薇袁范泉水袁等援犬细小病毒的分离鉴定咱允暂援动物医咱猿暂殷员怨怨苑援震袁刘景华援动物病毒学咱酝暂援第二版援北京院科学出版社袁咱员员暂宋桂强袁龙贵伟袁范泉水袁咱源暂王淑君其遗传进化分析袁杨松涛袁陈创夫咱允暂援现代生物医学进展袁等援犬细小病毒四川流行株分离鉴定及畜牧兽医袁圆园园苑袁猿源渊猿冤院怨愿原员园园援等援犬细小病毒病的研究进展咱允暂援中国袁圆园园怨袁怨渊员园冤院员愿愿愿原咱员圆暂张仁舟袁杨松涛袁冯昊袁等援中国国内首次检测到犬细小病毒咱缘暂刘志强员愿怨园援袁张小莺袁黄新袁等援新疆石河子地区犬细小病毒的分离咱员猿暂魏悦孕灾圆糟咱允暂援巍袁李肖梁中国病原生物学杂志袁帅江冰袁等袁圆园员园袁缘渊源冤院圆源远原圆源怨援鉴定与基因型分析定咱允暂援中国兽医杂志袁圆园员园袁源远渊愿冤院源源原源远援咱允暂援畜牧与兽医袁圆园园愿袁源园渊苑冤院员原源援援犬细小病毒匀在园苑远员株的分离与鉴咱远暂蔡宝祥援家畜传染病学咱酝暂援第缘版援北京院中国农业出版社袁渊责任编辑程碧军冤
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