无菌操作规范

3无菌操作规范

3.1目的

规范在洁净室内进行的、与细胞培养有关的实验操作。

3.2适用范围

全部细胞制备及质控人员。

3.3内容

3.3.1所有实验用物品在传递入洁净间之前，要进行脱外包装，消毒。

3.3.2开始实验前要打开超净台及洁净室的紫外灯，消毒半个小时以上；超净台内应避免放入过多的物品（一般放入当次实验所需的物品）。所使用的试剂、耗材等都是事先灭菌，并附有使用期限。

3.3.3进入洁净室前先关闭洁净室内的紫外灯，打开风机等待半个小时以上，以尽量排尽臭氧。

3.3.4除去腕部手表和饰物，穿好隔离服，戴好口罩、一次性医用隔离帽，穿隔离衣要做到“三不露”：不暴露头发，不暴露口鼻，不暴露躯干部皮肤或内穿衣物。

3.3.5双手要进行清洗、消毒。

3.3.6要经风淋室风淋30秒后再进入洁净室。

3.3.7在局部百级区域操作要戴一次性无菌手套。

3.3.8实验操作过程中应尽量减小进入洁净室人员（不超过4人/间洁净间）并尽量减少人员走动。

3.3.9所有要放入洁净工作台的物品都要用消毒液喷洒擦拭消毒。

3.3.10无菌物品若取离超净台则视为已污染，不得放回再用；无菌液体在取离超净台前必须密封其开口；密封的无菌液体容器在放入超净台后，对其开口前须对开口用碘伏或医用酒精消毒，并在酒精灯火焰上烧烤2次。

3.3.11在拆开任何一次性无菌使用耗材的包装时都要在超净台内完成，并须同时保证与细胞直接接触的使用端/面不得与超净台内的任何物品发生触碰；

3.3.12工作台面上的用品要放置有序、布局合理，一般说酒精灯（当工作不需要时也可不用）在中间，右手使用的物品在右侧，左手使用的物品在左侧。工作时忌忙乱而要有序。

3.3.13点燃洁净工作台内的酒精灯，在打开/关闭试剂瓶口、试管口时应将瓶口或者试管口过火；手术剪、止血钳、镊子在使用前或在与台面发生碰触后应经过火焰的灼烧；手术剪/止血钳/镊子的过火操作方法为：使其头部到身部反正面在火焰上各烤燎5秒钟；烧过的器械要冷却后才能使用，以免对细胞和组织造成损伤。

3.3.14无菌消毒盒/包的开启必须在超净台内进行。

3.3.14.1开启前先用医用酒精对双手进行消毒，无菌消毒盒/包的摆放位置距超净台外缘应大于10cm；

3.3.14.2打开消毒盒时，应用左手托住消毒盒，用右手打开上盖；将上盖内面/口朝上，平放在超净台内，用经消毒、过火的镊子取用物品；从消毒盒内取出的物品不得再放回原盒中。

3.3.14.3开启消毒包时，应将消毒包平放在超净台中央，打开捆绳、逐层翻开包布、暴露所包物品，再用经消毒过火的镊子取出无菌物品；消毒包一旦打开，不得包住再用；

3.3.15注射器拆开的标准无菌操作为：在超净台内首先检查注射器包装是否封闭，然后拆开包装，取出注射器，拔掉针头与过滤器或者与血袋相连。在整个操作过程中，注射器不应与超净台内的任何物品发生触碰；

3.3.16开启生理盐水瓶盖或者其他类似的瓶盖时应在超净台内操作，标准的开瓶消毒程序为：

3.3.16.1首先用医用酒精棉球对瓶盖进行彻底的消毒。

3.3.16.2将瓶盖在酒精灯火焰上反转镣铐两周，用消毒的镊子翻开并取下瓶盖；然后将瓶盖内口朝上，放在超净台内。

3.3.16.3再将打开的瓶口在火焰上镣铐两周，放好备用；在放置可能会重复使用的离心管盖子或者其他试剂的胶塞时，应将盖子或者胶塞倒置摆放在尽可能远离手臂所能触及的范围以外。

3.3.16.4在超净台内，尽量避免瓶口长时间敞开直立。

3.3.16.5盖封瓶口时，应将瓶口和瓶盖内面各自在火焰上燎烤两周再盖上瓶盖。

3.3.17在开启和关闭有细胞生长的培养瓶时应遵照3.1.16，但是，火焰灭菌时间要短，防止因温度过高烧死细胞；实验用胶塞、橡皮乳头等橡胶和塑料用品在过火焰时也不能时间过长，以免烧焦产生有毒气体，危害培养的细胞；

3.3.18袋装液体的标准开启、消毒程序为：首先将开启的袋装液体直立放在专用架子上，用碘伏反复擦待开启的部分（消毒范围应在开启部位上下各2cm）；然后再用酒精棉球反复擦消，范围同前；再用经消毒过火的手术剪剪开或打开封口；打开的袋子必须开口向上放置；

3.3.19无菌液体标准转移程序：

3.3.19.1无菌液体的转移须在超净台进行，转移过程要尽量保持密闭，必须用移液管或移液器来完成操作；

3.3.19.2无菌液体瓶再封口时，须将瓶口和瓶盖分别燎烤2周后再封盖；封盖后须贴上相应的标签；

3.3.19.3在使用移液管转移液体时，应保证移液管尖端距移液器边缘1cm以上；在使用移液管对血细胞和生理盐水进行吹打混匀时，每次液态混合物的吸入量不应超过移液管的警示标记，更不能触及移液管上方的防尘棉絮；在使用移液管移出废液时，移液管尖端应距废液缸5cm以上；在将细胞悬液转移至培养瓶中时，移液管尖端应距培养瓶0.5cm

以上；在向培养瓶内添加因子时，tip头应稍许深入1-1.5cm以利于液滴的流入；

3.3.19.4放置吸管时管口应向下倾斜，以防液体倒流入橡皮乳头内而引起污染或者损坏电动移液枪；

3.3.20向离心管、细胞冻存管、培养瓶、培养皿内添加液态物质时，所加入的量不应超过管上所标示的最大量；

3.3.21实验人员在操作时，应保证开口离心管或开口试剂的上方为不可逾越区；严格禁止采用双臂交叉的方式来拿取尚在开口状态的离心管或试剂瓶；在面向操作台工作时勿大声讲话或咳嗽，以免喷出的唾沫把细菌带入工作台面发生污染；

3.3.22在使用细胞刮刀时，手握部位应尽量远离培养瓶口，以防污染；

3.3.23如果在转移任何液态物质的过程中出现滴漏，则应立即使用消毒液浸泡的棉球或纱布擦净；

3.3.24使用完毕的实验耗材应在第一时间内处理完毕，避免堆积在超净台内或层流罩上，以防污染；

3.3.25当所有操作完成后，应及时使用消毒液对台面进行清理；擦拭完毕后再开启紫外灯照射一个小时。