辣椒种质疫病抗性鉴定及SRAP分析
2023-03-23
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江西农业大学学报2016,38(6):1049—1055 http://xuebao.jxau.edu.cn Acta Agriculturae Universitatis Jiangxiensis DOI:10.13836/j.jjan.2016148 方荣,周坤华,陈学军,等.辣椒种质疫病抗性鉴定及SRAP分析[J].江西农业大学学报,2016,38(6):1049-1055 辣椒种质疫病抗性鉴定及SRAP分析 方 荣 ,周坤华 ,陈学军 ,马辉刚 ,吴 茵 。, 何烈干 ,袁欣捷 ,石 博 (1.江西省农业科学院蔬菜花卉研究所,江西南昌330200;2.江西省农业科学院植物保护研究所,江西南昌 330200;3.江西农业大学农学院,江西南昌330045) 摘要:为科学评价辣椒种质资源,应用苗期人工接种鉴定方法和SRAP技术,对204份辣椒种质进行疫病抗性 评价和遗传多样性分析。筛选出高抗和抗性材料各8份、中抗材料l6份,感病材料172份;抗病材料占供试种 质数的比例为15.69%,且主要来自我国南方地区。SRAP分析结果表明,20条引物组合共扩增出585条带,平 均每个引物扩增出29.25条,多态性位点比例82.91%。204份材料两两不同种质问Jaccard相似系数0.413— 0.996,平均为O.788。通过UPGMA聚类分析,以相似系数O.700为阀值,将204份种质分为7类,有25份抗病 材料分布在第V类和第Ⅵ类,占全部抗病材料的78.10%。 关键词:辣椒;疫病;抗性;SRAP 中图分类号:¥641.3 文献标志码:A 文章编号:1000-2286(2016)06-1049-06 SRAP Analysis and Evaluation of Resistance to P tophthora capsici in Pepper FANG Rong ,ZHOU Kun—hua ,CHEN Xue-jun ,MA Hui—gang , WU Yin ,HE Lie—gan ,YUAN Xin-jie ,SHI Bo (1.Vegetable and Flower Institute,Jiangxi Academy of Agricultural Sciences,Nanchang 330200,China;2. Plant Protection Institute,Jiangxi Academy of Agricuhural Sciences,Nanehang 330200,China;3.College of Ag— ronomy,JAU,Nanchang 330045,China) Abstract:For scientific evaluation of germplasm resource in pepper,204 germplasms were selected to as— sess the genetic diversity by SRAP technique and analyze the resistance to Phytophthora capsici by root--irriga-- ting methods.It was found that,8 germplasms were highly resistant,8 resistant,16 moderately resistant,and 172 sensitive.The resistant materials accounted for 15.69%of aU the trial germplasms.and most of the resistant ma— terials originated from the southern regions in China.The results of SRAP analysis showed that:twenty primer combinations generated 585 scorable bands.82.91%were polymorphic.Each primer combination amplified an average of 29.25 fragments.Jaccard’S similarity between pairs of germplasms ranged from 0.413 to 0.996 wih a t收稿日期:2016—05.16 修回日期:2016-07—23 基金项目:国家自然科学基金项目(31260479,31460520)、江西省自然科学基金(20133BAB20010)、江西省现代农业 产业技术体系建设专项(JXARS一06)和江西省现代农业科研协同创新专项(JXXTCX2015005) Project supposed by the National Natural Science Foundation of China(3 1260479,3 1460520),the Natural Sci— ence Foundation of Jiangxi Province(20133BAB20010),Jiangxi Special Fund for the Technology System Con— structing of Modern Agricultural Industry(JXARS一06)and Jiangxi Specila Fund orf Agro・scientific Research in the Collaborative Innovation(JXXTCX2015005) 作者简介:方荣(1965一),女,研究员,主要从事蔬菜种质创新与分子生物学技术研究,fangrongrui@sohu.corn; 通 信作者:陈学军,研究员,博士,19889766@163.corn。 ・1050・ 江西农业大学学报 第38卷 mean of 0.788.The results from UPGMA cluster analysis suggested that 204 germplasms could be classified into seven groups at similarity coefifcient 0.700.Twenty—five resistant materials distirbuted in the V cluster and the VI cluster.which occupied 78.10%of all the resistant materials. Keywords:pepper;phytophthora blight;resistance;SRAP 辣椒(Capsicum spp.)为茄科辣椒属蔬菜作物,是我国栽培面积最大的蔬菜作物之一,201 1年播种 面积达130万hm ,产量1 452万t(FAO,STATE:http://faostat.fao.org),居世界首位。辣椒疫病(Phyto- phthora blight)是由疫霉菌(Phytophthora capsici L.)侵染引起的一种土传性病害,自1918年在美国新墨 西哥州被首次发现以来¨J,辣椒疫病就成为制约辣椒生产的一种毁灭性病害 。J。据不完全统计,世界 辣椒产区每年因疫病造成的损失均超过1亿美元,且呈现逐年加重趋势 J。 辣椒种质资源疫病抗性评价与遗传多样性分析,是辣椒种质资源深化研究与遗传改良的重要基础, 近年来,不少学者开展了相关研究。马辉刚等 比较了游动孢子灌根法和离体叶接种法的鉴定效果, 发现2种方法对辣椒疫病抗性鉴定结果呈显著正相关。方荣等 开展了中国野生灌木辣椒(C.frutes— Celts)种质资源疫病抗性评价,筛选出H108等高抗种质。关天舒等 利用苗期接种方法对217份辣椒 材料进行了疫病抗性分析,有84份材料表现抗病。其他研究者也先后开展了辣椒种质疫病抗性鉴定, 筛选出一些抗性材料 。 。SRAP标记是Li和Quiros 12]发展的一种针对外显子区域进行扩增的新型标 记,具有操作简单、稳定性好、多态性高等优点,已应用于辣椒种质遗传多样性分析u j。 本研究在前期收集、保存国内外辣椒种质资源基础上,对204份辣椒种质开展了疫病抗性鉴定、农 艺性状观察和DNA差异SRAP分析,以期为辣椒种质资源的开发利用与抗性育种提供理论参考。 1材料与方法 1.1供试材料 供试材料共204份,除B120为灌木辣椒(C.frutescens)外,其他均为1年生辣椒(C.annuum)种质 (表1)。204份材料中,有117份引自国家蔬菜种质资源中期库,其他均由江西省农业科学院蔬菜花卉 研究所提供。 1.2农艺性状观察 上述材料2015年3月29日播种,5月2日定植。每个材料定植l0株,行距65 CB,株距40 am,田 问管理与常规管理相同。每份种质在开花座果盛期随机选取6株进行始花节位、株高、果形、单果质量、 果长、果宽、果肉厚和辣味等的观察记载,具体参照陈学军等¨ 的方法进行。 1.3疫病抗性鉴定方法 疫病抗性鉴定试验在江西省农业科学院蔬菜花卉研究所塑料大棚内进行,2015年9月20日塑料 育苗盘播种育苗,草碳为育苗基质,一钵一苗。当幼苗具6片真叶时,采用游动孢子灌根法接种鉴定,每 个材料接种10株,重复3次,共3O株,详细参考马辉刚等 的方法。 接种后7 d按农业部1999年颁布的分级标准调查发病级别,并计算病情指数 J。 病情指数(DI)=[∑(病级数值×该病级病株数)×100]/(病级最高值×调查株数) (1) 抗病性划分标准,高抗(HR):病情指数≤10;抗病(R):10<病情指数≤30;中抗(MR):30<病情指 数≤5O;感病(s):病情指数>50。 1.4辣椒基因组DNA的提取及SRAP分析 在生长盛期采摘无病虫辣椒嫩叶提取基因组DNA,对每份参试材料,从10个随机单株中取3—5 g 叶样,在液氮中冻干研磨成细粉。提取方法参照改良CTAB法¨。进行。SRAP方法:选用本试验室筛选 的20对多态性好、条带清晰稳定的SRAP引物进行扩增分析,PCR总反应体系参照本试验室优化的 10 L体系进行 17],SRAP引物由生工生物工程(上海)有限公司合成。PCR产物采用6%变性聚丙烯酰 胺凝胶(7 mol/L)尿素电泳,电泳缓冲液为1xTBE,70 w恒功率电泳1.5 h。银染法 引染色显影,在荧光 灯上观察分析条带。 1.5数据统计与分析 将电泳图谱上清晰条带记为“1”,同一位置没有条带记为“0”,获得数据矩阵,用Jaccard系数表示 遗传相似系数,采用SPSSI7.0软件计算材料问遗传相似系数并聚类分析。 第6期 方荣等:辣椒种质疫病抗性鉴定及SRAP分析 ・105l・ 2结果与分析 2.1疫病抗性鉴定结果 204份种质中,表现高抗的种质有8份,即A124、A200、A252、BO02、B015、B018、B092和B199。表 现抗病的有8份,即A080、A161、A187、A208、A229、A250、A259和B139,表现中抗的材料有16份,感病 材料172份,详见表1。 表1 204份辣椒种质疫病抗性鉴定结果 Tab.1 The resistance evaluation to Phytophthora capsici of 204 accessions in pepper N序um号be 材r Acces料io 病n8 Di e指B s, 抗。Resist性an Nce ue孵sions一茹。~:… Res挠ist眭ant eNumber AccesBi0ns :as。Resista1ce index index 序号 材料 指 抗性 N uessions. :… index B083 B084 B088 B089 BO9l BO92 BO93 B094 B096 67.5 77.5 80.0 l00 82.5 10.0 72.5 82.5 90.0 霉Resi stance S S S S S HR S S S l 2 3 4 5 6 7 8 9 A0o2 A∞3 A005 A0o6 Aoo8 A0o9 A010 A015 A016 72.5 62.9 50.0 85.7 57.5 37.5 67.5 96.0 40.0 S S MR S S MR S S MR 53 54 55 56 57 58 59 60 6l A202 A205 A206 A207 A208 A209 A21l A212 A214 74.3 55n 92.5 42.5 27 5 65 0 97.5 92.5 97 5 S s S MR R S S S S 105 l06 1o7 1o8 lO9 l10 l11 l12 l13 A261 A262 A263 A265 A266 A267 A268 A269 A270 48.6 7(】O 46.7 100 65.7 83.33 83-3 92.5 印.O MR S MR S S S S S S 157 158 159 l60 161 162 163 164 165 10 1l l2 13 14 15 16 l7 18 l9 20 21 22 23 24 25 26 A023 A024 A026 A040 A050 AO67 Ao76 Ao78 A080 A085 A089 A090 A093 AlO4 A1O6 Alo7 A116 77.5 733 933 97.5 87.5 62.5 75.0 97.5 22.5 70.0 65 0 80.O 印O 88.6 75.0 90.0 97.5 S S S S S S S S R S S S S S S S S 62 63 64 65 66 67 68 69 70 7l 72 73 74 75 76 77 78 A215 A216 A217 A218 A219 A22l A222 A224 A225 A226 A227 A228 A229 A23O A231 A232 A233 77.5 90.0 55.0 95.0 80.0 75.O 97.5 9o.O 67.5 96 7 90.O 70.0 25.O 85.0 72.5 62.5 97.5 S S S S S S S S S S S S R S S S S ll4 l15 1l6 1l7 ll8 1l9 120 121 122 l23 l24 l25 126 127 128 l29 130 A271 A272 A273 A274 B002 B0o9 B010 BOI1 BOl2 B013 B014 BO15 BO16 B018 BO19 B0: B022 67.5 80.0 9o.O 80.O 10.0 70.0 l0o 82 5 82.9 85.7 77.1 5.7 67.5 7.5 77.5 85 0 90 0 S S S S HR S S S S S S HR S HR S S S l66 167 168 169 170 171 172 173 174 175 176 177 178 179 180 181 182 B097 B099 B121 B120 Bl22 B127 B128 B130 B132 B135 B138 B139 B141 Bl45 Bl46 B149 B150 80.O 65.0 80.0 87 5 77.5 95 0 87.5 87.5 100 85.0 60.0 12.5 85.0 87 5 65.O 57.5 95.0 S S S S S S S S S S S R S S S S S 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 4l 42 43 44 Al17 A124 A144 A146 A160 A161 Al64 A166 Al70 Al74 A176 A177 A179 A183 A184 A187 A189 A19O 87.5 7.5 R0.O 72.0 65.0 15.0 65.0 9oO 77 5 7O.0 90.0 67.5 42.5 97.5 92.5 25.0 87.5 72.5 S HR S S S R S S S S S S MR S S R S S 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 9o 91 92 93 94 95 96 A234 A235 A236 A237 A238 A239 A24o A241 A242 A243 A244 A245 A246 A247 A248 A249 A250 A25l 47.5 82.9 75 0 85.7 65 0 l00 97 5 97.5 95.0 92.5 40.0 8o.O 100 87.5 97.5 5o.O 30.O 88 6 MR S S S S S S S S S MR S S S S MR R S 131 132 133 l34 135 136 137 138 139 140 141 142 143 144 145 146 147 148 B023 B024 B025 B028 B029 B030 B03l B034 B036 B037 BO41 Bo47 B050 B052 B055 B057 B058 B059 77.5 95.0 85.0 82.5 32.0 65.7 6o.O 95.0 l00 86.7 80.0 70.0 6o.0 85.0 62.5 62 5 l00 77.5 S S S S MR S S S S S S S S S S S S S 183 184 185 186 187 188 189 190 191 l92 193 194 195 196 197 198 l99 200 B166 B168 B182 B183 BlSg Bl85 Bl86 Bl87 B188 B189 B191 B195 B197 Bl99 B351 B354 B355 B361 95.0 77.5 10o 75.0 8"/.5 47.5 70.0 92.5 90.0 70.0 57.5 45.0 67.5 10.0 77.5 85.0 87.5 82.5 S S S S S MR S S S S S MR S HR S S S S 45 46 47 48 A191 A192 A193 A】95 82.5 77.5 90.0 85.0 S S S S 97 98 99 1oo A252 A253 A254 A256 0 8O.0 95.0 70.0 ttR S S S 149 150 151 152 B0印 B06l B063 B076 77.5 80.O 72.5 R2.5 S S S S 201 202 203 2o4 CO06 COIO C018 C024 37.5 60.0 90.0 77.5 MR S S S 49 50 51 52 A197 A198 A200 A201 80.0 95.0 0 48.0 S S HR MR I 101 102 lo3 104 A257 A258 A259 A260 62.9 75.O 17.1 62.5 S S R S 153 154 155 l56 B077 B078 B080 B082 42.5 97 5 lo0 91.4 MR S S S HR:高抗;R:抗;MR:中抗;s:感病。HR:high resistance;R:resistance;MR:medium resistance;S:susceptible ・1052・ 江西农业大学学报 第38卷 2.2农艺性状分析 供试的204份材料,表型变异较大。株高变幅为24.0—94.0 cm,平均61.3 em,始花节位变幅为 2—24节,平均10.2节;单果质量变幅为1.1 ̄431.0 g,平均44.1 g;果长变幅为1.4 ̄26.6 cm,平均10.57 em; 果宽变幅为1.9-9.9 cm,平均为3.31 em;果肉厚变幅为0.09一O.98 cm,平均0.32 em。有44个材料果实为 灯笼形,20个为锥形,2个为近圆形,其他138份种质均为长椒类型中的羊角形、指形或牛角形。 从表2看到,32份抗性材料多为锥形或羊角形,牛角椒仅2份,灯笼形材料有5份。32份抗性材料平 均单果质量为22.2 g,远低于204份材料的平均果质量(4.1 g),平均果长、平均果宽也低于24份材料的 0均值。绝大多数抗性材料果实具有辣味,仅3份材料无辣味。 表2 32份抗性种质农艺性状分析 Tab.2 Agronomic traits and fruit quality characters of32 resistant accessions 2.3 SRAP分析 20对SRAP引物在204份辣椒种质中共扩增出585条带,平均每对引物产生29.25条带,扩增片段大 部分集中在100-1 500 bp,其中多态性位点485个,多态性位点比例82.91%。 第6期 方荣等:辣椒种质疫病抗性鉴定及SRAP分析 ・1053・ 基于SRAP的204份材料两两不同种质问Jaccard相似系数为0.413—0.996,平均为0.788。C.annuum 种质171(B127)与172(B128)遗传相似系数最高,达0.996,C.frutescens种质169(B120)与C.annuum种质 180(B146)相似系数最低,为0.413,种质169与203份C.annuum种质平均相似系数为0.446,C.annuum种 质之间平均相似系数为0.791。 2.4聚类分析 基于Jaccard相似系数矩阵,用 SPSS17.0软件对204份材料进行聚类 分析,获得了基于SRAP的亲缘关系 树状图(图1),一些形态相近或地理 来源相近的种质首先聚在一起,如种 赴嚣嚣篮鹕嚣嚣嚣 质39(A179)和103(A259)均是来自 云南地区的抗性种质,在相似系数 0.874处聚为一类;种质28(A124)和 162(B092)分别来自台湾亚洲蔬菜中 心和泰国,农艺性状相近,且均为抗性 种质,在相似系数0.875处相聚。 以0.700的相似系数为阀值,可 将204份材料分为7类,第1类42份种 质,主要为甜椒和大果形牛角椒,仅有 1份抗性材料,即种质153(B077);第 Ⅱ类5份种质,有1份抗性材料,即种 质95(A250);第1II类21份,有抗性材 料3份;第Ⅳ类18份,抗性材料2份; 第V类20份,有4份抗性材料,且均 为高抗材料;第Ⅵ类97份,有抗性材 料21份,其中4份为高抗种质;第Ⅶ 类1份,即C.frutescens种质169 (B120),为江西会昌小米椒。 3讨论 本研究采用游动孢子灌根接种 法,对204份不同类型辣椒种质材料 进行了疫病抗性鉴定,筛选出抗性材 料32份,其中,高抗材料8份,且种质 51(A200)和97(A252)达到免疫级 别,这2份材料均来自亚洲蔬菜研究 中心,在辣椒抗性育种中具有重要利 用价值。 本研究发现,抗性种质与地理来 源和品种类型具有一定的相关性。32 份抗性材料,大部分来自我国长江流 域及华南、西南地区,来自北方干旱地 区材料只有2份。这可能是因为疫霉 菌(Phytophthora capsici L.)喜高温高 1 00 0 90 0 80 0 70 0 60 0.50 0 40 Jaccard系数Jaccard coefficient 图1基于SRAP分析的204份辣椒种质聚类分析 Fig.1 Cluster analysis of 204 accessions in pepper based on SRAP ・1054・ 江西农业大学学报 第38卷 湿环境条件,在南方多雨地区,病原菌与辣椒种质在长期的侵染和抗侵染的互作过程中,协同进化 ,形 成了抗性种质。在32份抗性材料中,有24份材料平均单果质量小于20.0 g,且果形以锥形和羊角形为主, 因此,总体来看,小果型品种比大果型品种抗病性强,这与马辉刚等 J、何烈干等 报道结果是一致的。 基于SRAP技术,本研究对204份不同类型辣椒种质DNA差异进行了分析,扩增片段的多态性比例高 达82.91%,材料间遗传相似系数变幅为0。413—0。996,平均为0.788。灌木辣椒(C.frutescens)种质169 (B120)与1年生辣椒(C.annuum)遗传相似系数较小,平均值只有0.446,在聚类分析中单独聚为一类,说 明两者亲缘关系较远,这与陈学军等u 研究结果一致。 通过UPGMA聚类分析,在相似系数0.700处,将204份种质分为7类。疫病抗性种质相对集中分布 于第V类和第Ⅵ类,第V类有4份抗性种质,第Ⅵ类有21份,两者占全部挠陛材料的78.10%,说明这些抗性 材料具有一定的相同或相似的DNA遗传基础,其分子遗传机理尚有待今后进一步深人研究解析。 参考文献: [1]Leonian L H.Stem and fruit blihgt of peppers caused by Phytophthora capsici[J].Phytopathology.1922,12(9):401..408. 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