常用溶液

Kanamicin 使用10μg/ml 配置10mg/L DP 2,2’-二连吡啶 配置100Mm 酒精溶解 FeSO4 使用40μΜ，配置20mM 盐酸溶解

I

分泌型信号肽的筛选及其在鳗弧菌分泌表达中的应用 1

1.

菌种、质粒 、引物 大肠杆菌TOP10克隆宿主菌

AV-1鳗弧菌表达宿主 野生型鳗弧菌MVM425

载体质粒pUC18

来源 本实验室 本实验室 本实验室 Novagen

2.① LB液体培养基:按酵母粉5 g/l，胰蛋白胨 10 g/l，NaCl 5 g/l称取各组分，加入

去离子水后用10 mol/l NaOH调pH至7.0，并用去离子水定容。混匀后121℃高压蒸气灭菌25 min。

② LB氨苄固体培养基:按2g/100ml向LB液体培养基中加入琼脂粉，121℃高压灭菌

25 min。趁热摇匀，冷却至约60℃，加入Amp至终浓度100 g/ml，摇匀后倒入培养皿中。凝固后于37 ℃恒温箱中烘干，保存在4 ℃冰箱中。 ③ A-I-X平板配制:

每100ml的LB中加入 a 100l Amp(50mg/ml) b 100l IPTG(24mg/ml) c 200l X-Gal(20mg/ml) 3.用于琼脂糖凝胶电泳的试剂

① 0.7 %琼脂糖凝胶：称取0.28 g琼脂糖溶于40 ml 1TAE缓冲液中，在微波炉中加

热，待琼脂糖完全溶解后迅速倒入制胶台。冷却40分钟后可点样电泳。

② 10TAE缓冲液：将2.42 g Tris碱溶于400 ml双蒸水中，加入5.71 ml冰乙酸和 10ml

0.5 mmol/L的EDTA，定容至1000ml。使用前稀释10倍。 4. 用于SDS-PAGE电泳的试剂

① 5样品缓冲液：分别加入0.6 ml 1 mol/l Tris-HCl (pH6.8)，5 ml 50%(v/v)甘油， 2 ml

10%SDS，0.5 ml 2-巯基乙醇(DDT)，1 ml 1%溴酚蓝，补蒸馏水至10 ml。使用时与样品混合，稀释至1。

② 5电泳缓冲液：称取15.1 g Tris碱，72.0 g甘氨酸，5.0 g SDS，加去离子水定容至

1000 ml，使用前稀释至1。

③ 染色液：称取2.5 g考马斯亮蓝R-250，加入450 ml甲醇，100 ml乙酸，定容至1000

ml，用滤纸过滤后可使用。

④ 脱色液：量取100 ml乙醇，50 ml冰乙酸，稀释至500 ml。

5. ELISA及western实验中所需要的一些试剂的配制方法

ELISA洗液及HRP标记抗体稀释液pH 7.4，PBST的配制见表3.4。

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表3.4 ELISA及western实验试剂配方

NaCl KH2PO4 Na2HPO4·12H2O

NaN3 KCl H2O Tween 20

4°C保存备用

2.0克 0.2克 2.9克 0.2克 0.2克 至1000ml 0.5ml

Western blot 抗体或免疫球蛋白稀释液0.01mol/L pH 7.2的PBS配方见表3.5。

表3.5 pH 7.2的PBS配方

NaH2PO4·2H2O Na2HPO4 NaCl NaN3 H2O（蒸馏水）

6.连接

0.39克 1.27克 0.85克 200mg 至 1000ml

目的基因与pMD19 T-simple Vector相连，连接体系见表3.12:

表3.12 T-载体连接体系

物质

pMD19 T-simple Vector 目的基因 Solution 总体积

连接反应在16℃下，反应8h。 b转化

用量 1l 4l 5l 10l

将连接液转化Top10大肠杆菌感受态细胞，涂LB(A-I-X)的LB琼脂平板，置37℃恒温箱，培养14-18h。 c菌落PCR

从LB(A-I-X)平板上挑取几个白色单菌落并做好对应标记，分别接入含800l低盐培养液的无菌EP管中， 250rpm培养3h左右。每个菌取200l在沸水中煮5min，12000rmp室温离心2min。上清作为PCR的模板DNA,PCR体系见表3.13 表3.13 Premix Taq (Takara)反应体系

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物质

ExTag Master Mix 模板DNA（验证的菌） 引物M13 forward 引物M13 reverse ddH2O 总体积

反应条件

预热 95℃ 1 min

模板DNA变性 95℃ 30 sec

用量 6.5l 2 l 1.3 l 1.3 l 1.9 l 13 l

引物退火 55℃ 50 sec 35 cycles 链延伸 72℃ Bmin

72℃ 7min 4℃ Forever

d电泳鉴定

PCR产物进行0.7%琼脂糖凝胶电泳，阳性菌接种到5ml的低盐培养液中，加Amp至终浓度100ug/ml，200rpm,37℃过夜培养。 7. 抽取含有目的基因的质粒。

使用质粒抽提试剂盒（上海天根生化科技公司（Tiangen）），抽提得50 l质粒，于-20℃保存备用。

8. 重组质粒的构建、转化及鉴定 (1)载体质粒的制备 抽提载体质粒

使用Plasmid Mini Kit（上海天根生化科技公司（Tiangen），抽提得50 l质粒pUC18，于-20℃保存备用。

(2)载体质粒与目的基因的酶切消化及回收

①载体质粒与目的基因的双酶切（酶切反应体系见表3.14a,3.14b）

表3.14a 双酶切反应体系

DNA溶液 目的片段 15 l 10×T buffer 3 l SmaI 1 l XbaI 1 l 0.1%BSA 3l ddH20 7l 总V 30 l

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体系均在37℃水浴保温下酶切3 h。 ②酶切片段的回收纯化

将上述酶切后的DNA样品在0.7 %琼脂糖凝胶上电泳，割下含目的片段的琼脂糖块，用Gel Extraction Mini Kit进行回收纯化，得到双酶切片段各30l。 (3)载体质粒和目的基因的连接

根据电泳结果确定载体与目的基因的用量比例。

使用DNA Ligation Kit(Takara)进行操作，连接体系见表3.15：

表3.15 连接体系

载体 2 l

置16℃恒温箱中反应8 h。 8.重组质粒的转化及鉴定 ①感受态细胞的制备

基因 3 l

Solution I 5l

总V

10l

克隆宿主TOP10 competent cell的制备

①蘸取TOP10甘油保存的菌液，接种于2 ml LB培养基，37℃，250 rpm振摇14-18h ②取1 ml已活化的菌液，接种于100 ml LB培养基中37℃，250 rpm恒温振摇至OD600=0.375

③将培养液分装到2个50 ml离心管中，冰浴5-10 min ④4℃，1600 g离心7 min，弃上清

⑤各管细胞沉淀用10 ml 冰冷CaCl2(0,06 mmol/L CaCl2，15 %甘油，0.01 mmol/L

PIPES，pH7.0，过滤灭菌)重悬，4℃，1100g离心5 min，弃上清

⑥各管细胞沉淀用10 ml 冰冷CaCl2重悬，冰浴30 min ⑦4℃，1100 g离心5 min，弃上清

⑧各管细胞沉淀用2 ml冰冷CaCl2重悬，按100 l/管分装于预冷的无菌EP管中 9.重组质粒转化克隆宿主

①将全量连接反应液12 l加入100 l TOP10competent cell，轻旋混合 ②冰浴10 min后，42℃水浴3 min，迅速放入冰水中淬2 min ③加入800l LB液体培养基，150 rpm，37℃恒温振摇1 h ④将培养液以8000rpm室温离心2 min，弃750 l 上清

⑤用管中剩余上清将沉淀重悬，涂布于含A-I-X的LB琼脂平板上 ⑥置37℃恒温培养16 h后观察

10. 克隆宿主中重组质粒的鉴定(菌落PCR法) a 菌落PCR反应体系见表3.16。

表3.16 Premix Taq (Takara)反应体系

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物质

Premix Taq (Takara) 模板DNA(上清液) 引物M13forward 引物M13reverse ddH20 总体积

11. 重组质粒转化表达宿主 ① AV-1 competent cell的制备:

①接单菌落于5ml高盐LB中，30℃，过夜

用量 12.5 l 5 l 1 l 1 l 5.5 l 25 l

④ PCR产物进行0.7%琼脂糖凝胶电泳，鉴定转化结果。

②按1:100接二级种，50ml，30℃约3h,至O.D.600=0.4~0.6 ③收菌体，5000rmp,4℃,10min

④用272mM蔗糖洗涤3次，分别用40ml，20ml，10ml重悬菌体，5000rmp，4℃，10min

离心

⑤1ml272mM蔗糖重悬沉淀，按100l/支分装

12. 根据电泳结果从LB(A-I-X)平板上挑取对应的阳性克隆(命名为TOP10 (pUC18-gfp) TOP10(pUC18-gfpSPN))，接种于含Amp的30 ml LB培养基中，250rpm，37℃恒温振摇16h。

取适量菌体，使用Plasmid Mini Kit（修改同上）抽提重组质粒:pUC18-gfp及pUC18-gfpSPN。

13. 取10l 重组质粒转化表达宿主AV-1competent cell，方法如下:

电转杯用乙醇消毒后吹干，-20℃预冷

↓

待转质粒10l，与AV-1感受态细胞混合，加入到电转杯(2mm)，场强2KV(1KV/mm)，

电击3ms，之后迅速放在冰上降温

↓

电击后，质粒/细胞混合物加入1ml高盐培养基，30℃，恢复培养3h

↓

收集菌体，涂LB高盐平板（Amp200），30℃培养

从LB(Amp)平板上挑取几个单菌落并做好对应标记，进行菌落PCP鉴定，用M13引物同③。根据电泳结果从转化板上挑取对应的阳性克隆得转化子