微生物限度检查方法(薄膜过滤法)
验证方案
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微生物限度检查方法(薄膜过滤法) 验证方案
编码：表
一、验证方案的起草与批准
1.验证方案起草
起草人： 起草时期： 年 月 日 2.验证小组成员：
3.验证方案审核
部门 生产部 生产车间 QC QA 4.验证方案批准
批准人： 批准日期： 二、验证方案 1.验证目的和原理 1.1验证目的
为确认所采用的方法适合于该药品的细菌、霉菌、酵母菌数的测定，特制定本方案。验证过程应严格按照本方案规定的内容进行，若因特殊原因确需要变更时，应报验证委员会批准。 1.2原理
通过比较试验4组中试验菌的恢复生长结果来评价整个检验方法的准确性、有效性和重现性。 2.验证方法步骤
2.1验证前的准备：进行微生物限度检查方法（薄膜过滤法）验证前，所有的平皿和稀释剂都应该严格 按照相关的灭菌程序消毒，以确保其对试验的结果没有影响。试验菌应包括G、G+、酵母菌和霉菌
—
审核人 日 期 类微生物以基本覆盖样品中可能存在的微生物。
2.2验证试验的操作计划：用3个不同批号产品微生物限度检测方法进行平行试验，通过计算回收率来
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判断限度检查方法是否对产品有影响。
2.3试验结果可接受标准：用标准菌株评价方法“ ”的微生物限度检查对检品中微生物的抑制性，试验结果应显示3次独立的平行试验中，稀释剂对照组的菌回收率应不小于70%，试验组回收率也不低于70%。 3.试验实施 3.1试验前的准备
3.1.1主要仪器设备：恒温培养箱、生化培养箱、电子天平、高压蒸汽灭菌器、净化工作台。 3.1.2操作环境：操作间应该安装空气除菌过滤层装置。环境洁净度不应低于10000级，局部洁净度为100级（或放置同等级净化工作台）。操作间或净化工作台的洁净空气应该保持对环境形成正压，不低于4.9pa。
3.1.3试验样品：
批号： 批号： 批号： 3.1.4培养基：
培养基名称 改良马丁琼脂培养基 玫瑰红钠琼脂培养基 胆盐乳糖增菌培养基 营养琼脂培养基 培养基批号 配制日期 有效期至 3.1.5稀释液：PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液
以上经115℃高压蒸汽灭菌30min。
3.1.6验证用微生物名称及其编号
实验菌株的来源：
菌株名称 大肠埃希菌CMCC(B) 44102 金黄色葡萄球菌 CMCC(B) 26003 枯草芽孢杆菌CMCC(B) 63501 白色念珠球菌CMCC(F) 98001 黑曲霉CMCC(F) 98003 编号由菌名首字母—传代代数—制备日期组成。
3.1.7器具：无菌薄膜过滤器：（孔径0.45um直径50mm）、无菌移液管（5ml）
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内控编号 Ec- Sa- Bs- Ca- An- 标准实用
4.验证方法 4.1菌液的制备
将大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌接种至10ml的无菌营养肉汤中在30～35℃下培养18～24小时，将白色念珠菌接种至改良马丁液体培养基中，在23～28℃下培养24～48小时。将黑曲霉接种至改良马丁液体培养基中，在23～28℃下培养5～7天。将上述培养物用0.9%的无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌落数为50～100cfu的菌悬液。 4.2实验方法
供试液的制备：取样品10g（ml）加入无菌PH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液100ml，振摇使分散均匀□，用匀浆仪混匀□，置45℃水浴使胶囊壳溶化混匀□，制成1：10均匀的供试液。
A样品试验组
取1:10供试液（相当1g或1ml供试品）10ml，加至100ml稀释液中混匀，过滤并用稀释液冲洗滤膜3次，每次100ml，在最后一次冲洗液中加入50~100cfu菌液，滤完后，将接有细菌的滤膜取出，菌面向上（接触细菌和样品的面）贴于已凝固的培养基上。大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌贴于营养琼脂培养基平皿上；白色念珠菌、黑曲霉贴于玫瑰红钠琼脂培养基平皿上。
B菌液组
取上述制备菌液各1ml加至100ml稀释液中混匀，过滤并用稀释液冲洗滤膜3次，每次100ml，滤完后，将接有细菌的滤膜取出，菌面向上（接触细菌和样品的面）贴于已凝固的培养基上。大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌贴于营养琼脂培养基平皿上；白色念珠菌、黑曲霉贴于玫瑰红钠琼脂培养基平皿上。
C供试品对照组
取上述1：10供试液10ml，加至100ml稀释液中混匀，过滤并用稀释液冲洗滤膜3次，每次100ml，滤完后，将滤膜取出，接触样品的面向上贴于已凝固的培养基上。大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌贴于营养琼脂培养基平皿上；白色念珠菌、黑曲霉贴于玫瑰红钠琼脂培养基平皿上。
D稀释剂对照组
取PH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液冲洗滤膜3次，每次100ml，在最后一次冲洗液中加入50~100cfu菌液，滤完后，将接有细菌的滤膜取出，菌面向上贴于已凝固的培养基上。大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌贴于营养琼脂培养基平皿上；白色念珠菌、黑曲霉贴于玫瑰红钠琼脂培养基平皿上。 4.3培养
将大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌在30～35℃下培养48小时，将白色念珠菌、黑曲霉在23～28℃下培养72小时，点计菌落数。
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5.试验结果
5.1产品试验组微生物生长检查情况： 批号： 菌种名称 大肠埃希菌 金黄色葡萄球菌 枯草芽孢杆菌 白色念珠菌 黑曲霉 产品试验组计数结果（cfu/皿） 平均值 5.2供试品对照组微生物生长检查情况： 批号： 菌种名称 大肠埃希菌 金黄色葡萄球菌 枯草芽孢杆菌 白色念珠菌 黑曲霉 供试品对照组计数结果（cfu/皿） 平均值 5.3稀释剂对照组微生物生长检查情况： 批号： 菌种名称 大肠埃希菌 金黄色葡萄球菌 枯草芽孢杆菌 白色念珠菌 黑曲霉 稀释剂对照组计数结果（cfu/皿） 平均值 5.4菌液组微生物生长检查情况： 批号： 菌种名称 大肠埃希菌 金黄色葡萄球菌 枯草芽孢杆菌 白色念珠菌 黑曲霉 文案大全
菌液组计数结果（cfu/皿） 平均值 标准实用
6.回收率计算
6.1稀释剂对照组菌回收率 菌落计数（cfu/皿） 菌种名称 批号 稀释剂对照组 大肠埃希菌 平均值 金黄色葡萄球菌 平均值 枯草芽孢杆菌 平均值 白色念珠菌 平均值 黑曲霉 平均值 菌液组 回收率
表中：回收率=稀释剂对照组的平均菌落数÷菌液组的平均菌落数×100%。
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6.2试验组菌回收率
菌落计数（cfu/皿） 菌种名称 批号 试验组 大肠埃希菌 平均值 金黄色葡萄球菌 平均值 枯草芽孢杆菌 平均值 白色念珠菌 平均值 黑曲霉 平均值 供试品对照组 菌液组 回收率 表中：回收率=（试验组的平均菌落数－供试品对照组的平均菌落数）÷菌液组的平均菌落数×100%。 7.结论：
7.1经过验证，大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉的回收率分别
为 %、 %、 %、 %、 %。
7.2稀释剂回收率为 %、 %、 %、 %、 %。
以上验证结果证明，本品 采用上述方法进行微生物限度检查。
检验人： 复核人：
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8.验证结果评价分析
质控部负责各项验证、试验结果记录，验证小组根据验证、试验结果进行评价，起草验证报告，报验证委员会。
验证委员会负责对验证结果进行综合评审，做出验证结论，发放验证证书。对验证结果的评审应包括：
（1） 验证试验是否有遗漏；
（2） 验证实施过程中对验证方案有无修改，修改原因、依据以及是否经过批准； （3） 验证记录是否完整；
（4） 验证试验结果是否符合标准要求，偏差及对偏差的说明是否合理，是否需进一步补充试验。 9.最终审批
验证报告由验证组长审核后，报验证总负责人批准，并签发验证证书。
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验证报告
年 月 日至 年 月 日，验证小组根据批准的微生物限度检查方法（薄膜过滤法）验证文件对微生物限度检查法进行了相关的一系列验证工作，达到了预期效果，滋将有关事项说明如下：
1、验证方案在实施过程中未做修改。
2、验证方案各项性能指标在验证中未作变动，误差在允许范围内。 3、验证过程中结果符合规定要求，记录完整属实。
4、验证结果符合设计要求和GMP原则要求，可以投入使用。 5、 组分或检验条件改变时须重新验证。
以上情况，请验证委员会审批！
验证小组：
年 月 日
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试验报告审批表
微生物限度检查方法（薄膜验证名称 过滤法）验证 验证内容 审 质 阅 量 会 部 签 审核人： 年 月 日 验证委员会意见： 批准人： 年 月 日
编号 文案大全
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验证证书 验证证书编号： 验 证 名 称： 有 效 期： 上述方法已按验证方案进行验证，各项验证结果符合标准要求，批准按此方法进行本品的控制菌检查。特发此证。 验证总负责人： 年 月 日 备注： 文案大全
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