一种盐酸沙格雷酯杂质Ⅲ用于增强CIK细胞活性的用途[发明专利]

(12)发明专利申请

(10)申请公布号 CN 107595831 A(43)申请公布日 2018.01.19

(21)申请号 201710925273.0(22)申请日 2017.10.03

(71)申请人 南京普氟生物检测技术有限公司

地址 211198 江苏省南京市江宁区高新园

天元东路1009号(72)发明人 杨豪伟　张思静　王斌　(51)Int.Cl.

A61K 31/225(2006.01)A61K 47/32(2006.01)A61P 35/00(2006.01)

权利要求书1页 说明书4页 附图1页

(54)发明名称

一种盐酸沙格雷酯杂质Ⅲ用于增强CIK细胞活性的用途(57)摘要

本发明公开了一种盐酸沙格雷酯杂质Ⅲ用于增强CIK细胞活性的用途。本发明提供了盐酸沙格雷酯杂质Ⅲ用于制备增强CIK细胞增殖活性和杀瘤活性的药物的用途，盐酸沙格雷酯杂质Ⅲ可以用于增强CIK细胞的增殖能力和对肿瘤细胞的杀伤能力，这突破了现有技术对盐酸沙格雷酯杂质Ⅲ的认知水平；本发明还提供了一种盐酸沙格雷酯杂质Ⅲ的药物制剂，该制剂中至少含有PVP K-90，PVP K-90可以用于提高盐酸沙格雷酯杂质Ⅲ的热稳定性，抑制其在高温条件下的降解水平。CN 107595831 ACN 107595831 A

权　利　要　求　书

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1.盐酸沙格雷酯杂质Ⅲ用于制备增强CIK细胞增殖活性和杀瘤活性的药物的用途。2.一种用于增强CIK细胞增殖活性和杀瘤活性的药物制剂，其特征在于：含有权利要求1所述的盐酸沙格雷酯杂质Ⅲ。

3.根据权利要求2所述的药物制剂，其特征在于：还含有药学上可以接受的载体或赋形剂制成药学上可以接受的剂型。

4.根据权利要求3所述的药物制剂，其特征在于：所述载体或赋形剂为PVP K-90。5.PVP K-90在增强盐酸沙格雷酯杂质Ⅲ热稳定性方面的应用。

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一种盐酸沙格雷酯杂质Ⅲ用于增强CIK细胞活性的用途

技术领域

[0001]本发明属于药物领域，涉及已知化合物的新用途，具体涉及一种盐酸沙格雷酯杂质Ⅲ用于增强CIK细胞活性的用途。

背景技术

[0002]盐酸沙格雷酯片1993年在日本首次上市，商品名为Anplag，是一种5-HT2受体阻滞剂，能够抑制血小板凝聚、抑制血管收缩，具有抗血栓作用以及改善微循环。其适应症为改善慢性动脉闭塞症引起的溃疡、疼痛以及冷感等缺血性诸症状。[0003]盐酸沙格雷酯杂质Ⅲ是盐酸沙格雷酯的一种光降解杂质，其化学结构式如下：

[0004]

[0005]

现有技术中，盐酸沙格雷酯杂质Ⅲ主要用于盐酸沙格雷酯原料及制剂的质量控制，没有关于其药理活性的报道。

发明内容

[0006]本发明的目的在于提供一种盐酸沙格雷酯杂质Ⅲ用于增强CIK细胞活性的用途。[0007]本发明通过下面的技术方案得以实现：

[0008]盐酸沙格雷酯杂质Ⅲ用于制备增强CIK细胞增殖活性和杀瘤活性的药物的用途。[0009]一种用于增强CIK细胞增殖活性和杀瘤活性的药物制剂，含有上述盐酸沙格雷酯杂质Ⅲ。

[0010]优选地，还含有药学上可以接受的载体或赋形剂制成药学上可以接受的剂型。[0011]优选地，所述载体或赋形剂为PVP K-90。[0012]PVP K-90在增强盐酸沙格雷酯杂质Ⅲ热稳定性方面的应用。[0013]本发明的优点：

[0014]本发明提供了盐酸沙格雷酯杂质Ⅲ用于制备增强CIK细胞增殖活性和杀瘤活性的药物的用途，盐酸沙格雷酯杂质Ⅲ可以用于增强CIK细胞的增殖能力和对肿瘤细胞的杀伤能力，这突破了现有技术对盐酸沙格雷酯杂质Ⅲ的认知水平；本发明还提供了一种盐酸沙格雷酯杂质Ⅲ的药物制剂，该制剂中至少含有PVP K-90，PVP K-90可以用于提高盐酸沙格雷酯杂质Ⅲ的热稳定性，抑制其在高温条件下的降解水平。附图说明

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图1为不同浓度盐酸沙格雷酯杂质Ⅲ对CIK细胞增殖的影响(OD450值比较)；图2为盐酸沙格雷酯杂质Ⅲ对CIK细胞体内外杀瘤活性的影响。

具体实施方式

[0017]下面结合具体实施例进一步介绍本发明的技术方案。

[0018]实施例1盐酸沙格雷酯杂质Ⅲ增强CIK细胞增殖活性和杀瘤活性[0019]一、实验材料[0020]DMEM、RPMI-1640和GT-T551培养液，以及胎牛血清均为美国Gibco公司产品。青霉素-链霉素溶液产自碧云天。淋巴细胞分离自健康志愿者外周血。SMMC-7721肝癌细胞系于上海中科院购买，本实验室长期保存。盐酸沙格雷酯杂质Ⅲ自制，HPLC归一化纯度大于98％。

[0021]二、实验方法[0022]1、CIK细胞分离及原代培养[0023]采集健康志愿者血液20mL，平衡温度至室温。取50mL离心管若干，将血样转移至离心管，用生理盐水稀释至30mL，充分吹打均匀。将稀释后的血样缓缓加入另一管装有15mL淋巴细胞分离液的上方，形成上下两相。22℃，390g离心30min。离心后血浆层与分离液之间有白膜层可见，分别收集上层血浆和中间白膜层至新的离心管。于收集白膜层的离心管中加入RPMI-1640至45mL，混匀，22℃，1000g离心10min。重复上一步骤两次，离心速度分别改为400g和201g，最后一次离心之前取20μL混匀的细胞悬液进行台盼蓝染色计数。离心后重悬细胞，按细胞数5×106个/mL加含有500μg/L CD3mAB，1000U/mL IL-2和10％FBS的GT-T551培养基诱导培养成CIK细胞。[0024]2、肿瘤细胞培养[0025]在37℃，5％CO2及90％相对湿度的细胞培养箱中用DMEM完全培养液(含10％胎牛血清和100mg/L青-链霉素溶液)培养SMMC-7721细胞。[0026]3、CCK-8检测细胞增殖活力

[0027]将培养7d的CIK细胞数调整至3×105个/mL，于96孔平底细胞培养板每孔加入细胞悬液50μL，设干预组和对照组，对照组为生理盐水组，干预组分为低、中、高浓度组，分别加入盐酸沙格雷酯杂质Ⅲ终浓度为5、10、20μM的培养基各50μL，每个浓度4个平行对照孔，置于细胞培养箱中处理细胞72h，加入10μL CCK-8溶液，4h后用酶联免疫检测仪检测OD450值，测定低、中、高浓度干预组OD450值。[0028]4、肿瘤杀伤实验

[0029]将培养9d的CIK细胞均分为两组，分别为对照组和干预组，对照组为生理盐水组，干预组为培养基终浓度为10μM的盐酸沙格雷酯杂质Ⅲ，置于细胞培养箱中处理细胞72h(至12d)。另外，在CIK细胞培养11d时，将培养至对数生长期的SMMC-7721细胞调整细胞密度为2×105个/mL，于96孔板中铺板每孔100μL细胞悬液，培养箱中培养24h。CIK培养至第12天进行CIK杀伤肿瘤细胞实验，弃去SMMC-7721旧的培养液，分别按n(效应细胞)/n(靶细胞)为10:1调整两组CIK细胞至相应数目加入SMMC-7721细胞孔中，每个比例3个复孔，同时设单独靶细胞和单独效应细胞对照组，于细胞培养箱中培养4h。4h后每孔加入10μL CCK-8溶液，细胞培养箱中孵育4h，酶标仪测定OD450值A。按下式计算杀伤率：

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杀伤率(％)＝[1-(实验组A值-单独效应细胞组A值)/单独靶细胞组A值]×100％。

[0031]5、对裸鼠肝癌移植瘤生长的抑制作用[0032]裸鼠先经3Gy 60Co照射后，随机分成对照组及干预组，每组雌雄各半。每只裸鼠于左肩胛部皮下接种处于对数生长期的SMMC-7721肝癌细胞2×105。次日，对照组裸鼠在接种肿瘤细胞部位处注射5×107个常规诱导培养12d的CIK细胞，干预组裸鼠在接种肿瘤细胞部位处注射5×107个经盐酸沙格雷酯杂质Ⅲ诱导培养12d的CIK细胞(将培养9d的CIK细胞用含10μM盐酸沙格雷酯杂质Ⅲ的培养基继续培养3d)，体积均为0.25ml，连续注射6d。观察肿瘤生长情况，5周后裸鼠颈椎脱臼处死，剥离肿瘤块并称重，用游标卡尺测量肿瘤的大小，并计算肿瘤的体积。[0033]6、统计分析

[0034]数据以均数±标准差表示，采用SPSS19.0统计软件及Graphpad软件进行方差及显著性分析，检验水准(P)设为0.05。[0035]三、实验结果[0036]1、盐酸沙格雷酯杂质Ⅲ对CIK细胞增殖的影响[0037]结果可见，低、中、高浓度盐酸沙格雷酯杂质Ⅲ干预组OD450值显著高于对照组，各组OD450值如下表和图1所示。该结果证明，盐酸沙格雷酯杂质Ⅲ对CIK细胞的增殖具有促进作用，且呈一定的浓度依赖关系。

[0038]

 对照组低浓度干预组中浓度干预组高浓度干预组OD450值0.503±0.0420.654±0.0490.772±0.0410.985±0.046[0039]2、盐酸沙格雷酯杂质Ⅲ对CIK细胞体内外杀瘤活性的影响[0040]体外杀伤试验结果可见，10μM盐酸沙格雷酯杂质Ⅲ干预后的CIK细胞比常规培养的CIK细胞具有更强的杀灭肿瘤细胞活性，干预组杀伤率显著高于对照组；体内杀瘤试验结果可见，10μM盐酸沙格雷酯杂质Ⅲ干预后的CIK细胞比常规培养的CIK细胞具有更强的体内杀瘤活性，干预组肿瘤块的重量和体积均小于对照组。[0041]结果如下表和图2所示。

[0042]

体外杀伤率(％)肿瘤块重量(g)肿瘤块体积(cm3)42.61±5.231.57±0.571.15±0.4270.24±6.410.95±0.510.66±0.34

[0043]实施例2固体分散体的制备

[0044]将盐酸沙格雷酯杂质Ⅲ和PVPK-90按质量比1:5溶于无水乙醇中配置成盐酸沙格雷酯杂质Ⅲ质量浓度为10mg/mL的溶液，常温磁力搅拌4h(100r/min)，于50℃减压旋转蒸发除去溶剂，真空干燥24h，粉碎过5号筛，置于干燥器内保存备用。[0045]设置对比实施例，该实施例中将PVPK-90替换成PVPK-30，其他不变。[0046]分别将上述两种固体分散体置于60℃高温条件下24h，测定高温前后盐酸沙格雷酯杂质Ⅲ降解百分比。结果发现，以PVP K-90为载体时，盐酸沙格雷酯杂质Ⅲ降解率为0.7％，而以PVPK-30为载体时，盐酸沙格雷酯杂质Ⅲ降解率达13.6％。

[0047]本发明提供了盐酸沙格雷酯杂质Ⅲ用于制备增强CIK细胞增殖活性和杀瘤活性的 

对照组干预组

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药物的用途，盐酸沙格雷酯杂质Ⅲ可以用于增强CIK细胞的增殖能力和对肿瘤细胞的杀伤能力，这突破了现有技术对盐酸沙格雷酯杂质Ⅲ的认知水平；本发明还提供了一种盐酸沙格雷酯杂质Ⅲ的药物制剂，该制剂中至少含有PVP K-90，PVP K-90可以用于提高盐酸沙格雷酯杂质Ⅲ的热稳定性，抑制其在高温条件下的降解水平。

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说　明　书　附　图

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图1

图2

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