高效液相色谱法测定动物组织中5种磺胺类兽药残留检测方法的探讨

分析与检测ｌ　高效液相色谱法测定动物组织中　５种磺胺类兽药残留检测方法的探讨　磺胺类兽药是畜禽抗感染治疗中的　重要药物．经过各种给药途径进入动物　体内　使用不合理很容易在动物组织中　造成残留。近几年来由于不科学和超量　使用．残留量也随之加大，人们食用磺胺　类药物残留超限量的畜禽产品，会出现　急性或慢性中毒，影响人体的泌尿　免疫　系统，破坏肌肉肾脏和甲状腺等组织　如　诱发人的甲状腺癌等．还会导致人体内　很多细菌对其产生耐药性。对磺胺类药　物残留的检测原理主要是动物组织中磺　胺类药物经乙腈振荡提取后　用碱性氧　化￣Ｂ／Ｊ＼柱净化，注入高效液相色谱仪反　向色谱系统中进行分离，用紫外检测器　检测　与标准样品峰面积进行比较　外标　法计算磺胺类药物的含量。本文以猪肉　样品为例．谈谈有关磺胺残留检测的一　些问题。　材料与方法　仪器与试剂　安捷伦１　１　ＯＯ液相色谱仪一配紫　外．Ｒ－２０１旋转蒸发仪，Ｖｘ一２涡旋振荡　器，３—３Ｏｋ高速冷冻离心机，固相萃取　装置，碱性氧化￣ＳＰＥ／Ｊ＼柱，乙腈（色谱　级）．甲醇（色谱级）．冰乙酸（分析纯），　正己烷（分析纯），无水硫酸钠（分析　纯）．ＳＭＭ．ＳＭ２．ＳＭＺ，ＳＤＭ．ＳＱ标准品　纯度＞９９　７％（中国兽药监察所提供）。　样品前处理　试料制备与保存　从全部猪肉样品中取出有代表性猪　肉样品约１　ｋｇ，用匀浆机充分搅碎，均分　成２份，分别装入洁净容器内，密封成为　试样，标明标记　于－１　８￣Ｃ冷冻保存（临用　前解冻并恢复至室温）　提取溶剂、分离、净化方式等　主要前处理过程　称入样品５　Ｏｇ（精确至０　ＯＯＯ１ｇ）　于具塞离心管中，加入５ｇ无水硫酸钠，　加入１　５ｍＬ乙腈匀浆后　于涡旋震荡器　上４０ＯＯ　ｒ／ｍｉｎ振荡５ｍｌｎ．５０００　ｒ／ｍｉｎ离　心５ｍｌｎ，上清液全部转移至预先加入　２ＯｍＬ正已烷的离心管中．试料中再加　入１　５ｍＬ乙腈重复提取一次，离心后的　上清液一同转移至离心管中，振摇　静　置分层。取下层液．加入正丙醇５ｍＬ．　５０。Ｃ减压至近干。　口刘海琴鹤壁市畜产品质量监测检验中心　碱性氧化铝ｓＰＥ柱临用前用９５％乙　腈预洗，浓缩物用９５％乙腈３ｍＬ溶解后过　柱；再加９５％乙腈５ｍＬ洗涤鸡心瓶并将溶　液过柱、挤干．弃去过柱液　用７０％乙腈　１０ｍＬ洗脱，洗脱液收集到鸡心瓶中，挤　干．洗脱液加入５ｍＬｚＴ＿丙醇，５０。Ｃ减压浓　缩至干，浓缩物用２　０ｍＬ流动相溶解，用　微孔滤膜过滤　收集至进样小瓶中，上机　测定。　仪器设置　色谱条件：色谱柱：Ｃ　１　８柱，　２５０ｍｍｘ４．６ｍｍＩｄ；流动相：乙腈：甲醇：　水：乙酸（２：２：９：０　２）　流动相流速：　１　ＯｍＬ／ｍｉｎ　检测波长：２７０ｎｍ　进样量：　２０　Ｌ样品一式两份。　色谱分析：配制好的标准溶液与净　化后的样品分别进样　以保留时间定性　以样品溶液峰面积与标准溶液面积比较　外标法定量。　结果　定性：样品中未知组分的保留时间　（Ｒｔ）分别与标样的保留时间（Ｒｔ）相比　较，如果样品中某组分的两组保留时间　与标准中某一药物的两组保留时间一致　川２０１４　０　Ｆｌ０∞ｓ—Ｆｆｒｒ４３　即可认定为该药物。　有的柱子活化时还没有上样就堵，或者在　磺胺二甲氧嘧啶．磺胺喹啉）所示：磺胺　计算：样品中被测兽药残留量以质　上样的过程中堵得厉害　１～３ｍｌｎ还没有　二甲基嘧啶的出峰时间是５　７６２左右，磺　量分数Ｗ计　单位以毫克每千克（ｍｇ／ｋｇ）　流１滴，这样情况下，应该将其丢弃　重新　胺间甲氧啶的出峰时间是７　５５３左右，磺　做样。　胺甲唑的出峰时间是８　６９０左右，磺胺　表示，按以下公式计算。　ｗ：　兰　／Ｉｓ　Ｘ　Ｍ　×１０００　样品在提取过程中，５０。Ｃ减压干燥　二甲氧嘧啶的出峰时间是１６　７７６左右，　室一定注意负压不能太高，否则　容易造　磺胺喹啉的出峰时间是１８　００５左右。图　成药物随着蒸气流失　会使试样处理液　１是低浓度０　２　ｇ／ｍＬ的色谱图，图２是　（ｗ一试样中磺胺类药物残留量，单位为　ｍｇ／ｋｇ；Ａ－试样中磺胺类药物的峰面积；　ＣＳ－标准工作工作液的浓度　ｇ／ｍＬ；Ａｓ－　中磺胺浓度降低，浓度越低信号越弱　标准工作溶液中磺胺类药物的峰面积；Ｖ一　回收率也会相应降低。　试样定容体积（ｍＬ）；Ｍ一试样的质量（ｇ）；　计算结果保留５位有效－Ａ￣－。）　阳性样品回收率比较实验：在　５　Ｏｇ猪肉样品中分别添加５　ｇ／ｍＬ磺　结果与讨论　胺类药物混标溶液１００　Ｌ　５００　Ｌ按样　样品加入乙腈后提取时间要充分　品前处理步骤处理和测定，浓度相当　要将样品中的磺胺类药物溶解在乙腈试　于含０．１ｍｇ／ｋｇ　０　５ｍｇ／ｋｇ的磺胺类药　剂中．且样品之间的提取时间尽可能一　物，测定结果显示　猪肉中的回收率在　致　前者为提高回收率　后者为提高样　９０　３６％～９６　５０％范围内　标准偏差在　品之间的精密度，样品提取液上柱（ＳＰＥ　０　５８％～０　９５％范围之间，回收率高　且　柱）时　一定控制溶液流速，最好不大于　相同浓度下回收率稳定性好，低浓度的　１Ｏ滴／ｍｌｎ　如果流速过快．样品中的磺胺　添加要普遍高于高浓度的添加。　类药物不能够完全吸附在ＳＰＥ萃取柱　从　如图１、２（图中１～５分别代表磺胺二　而造成药物流失萃取柱的质量最关键　甲基嘧啶，磺胺间甲氧嘧啶　磺胺甲唑，　Ｖ．＿Ｄ●＾．＂■－■．ｑ■棚●－＿　ｌ　Ｉ　：．　　：：　耋　芝　，　Ｌ　０ｈ一■　．　Ｊ　・　量　图ｌ　５种磺胺标准品峰谱图（０．２　ｇ／ｍ１）　’’…　～　…一’　＾　ｕｊ。　ｉ　０一　Ｂ　‘・　２－　Ｏ　　ｌ，　ｉ　ｔ　，；ｔ　・　・　‘　图２　５种磺胺标准品峰谱图（１．０　ｇ／ｍ］）　４４食品安全导　ＩＪ　２０１４年７月　高浓度１　０ｕｇ／ｍＬ的色谱图　由图可知，　低浓度标准品的峰谱图（图１）受试剂峰　（杂峰）的干扰大　高浓度标准品的峰　谱图（图２）则受试剂峰的干扰较小。在　做样品过程种，由于样品的药物含量是　未知的，需要配制由低到高梯度的标　准品浓度　以满足不同含量不同的样　品的计算　可以根据样品含量的多少　选择相应的浓度点进行单点校正，或　者绘制标准曲线，通过在曲线图上查　找，得到样品相应的浓度。多点校正一　般情况下确定（５～７个点），浓度范围是　０　１－－２０　０　ｇ／ｍＬ之间。　结论　实验表明　猪肉经乙腈先后两次得　以充分提取　加入正己烷脱脂后浓缩、　净化后再浓缩，用流动相定容，采用高　效液相色谱法ｃ１　８色谱柱和紫外检测器　测定，一次进行５种磺胺类兽药残留测　定。此方法操作简单，单样检测时间约　３０ｍｉｎ，样品的提取也比较简单，样品加　标回收率在９０　３６％－９６　５０％之间　标准　偏差在０　５８％～Ｏ　９５％之问　适合动物组　织中５种磺胺类药物的大批量检测。通过　多年来经过对各类动物组织检测的结果　表明，该方法主要具有回收率高的特点　解决了药物残留提取不完全的问题，满　足市级检测单位对动物组织中５种磺胺　类兽药残留日常检测需要。