近江牡蛎糖胺聚糖的免疫调节活性研究

Modern Food Science and Technology 2014, Vol.30, No.12

近江牡蛎糖胺聚糖的免疫调节活性研究

胡雪琼，吴红棉，范秀萍，刘倩

（广东省水产品加工与安全重点实验室，广东普通高等学校水产品深加工重点实验室，国家贝类加工技术研发分

中心(湛江)，广东海洋大学食品科技学院，广东湛江 524088）

摘要：以近江牡蛎全脏器为原料提取近江牡蛎糖胺聚糖，对其理化性质和免疫调节活性进行研究。采用柱层析法分离纯化近江牡蛎糖胺聚糖得到纯化级分；用高效液相色谱（HPLC）、红外光谱（IR）分析其理化性质；采用小鼠体内注射环磷酰胺（CTX）法建立免疫抑制动物模型，测试其对小鼠的非特异性免疫、体液免疫的影响；采用噻唑蓝（MTT）法检测细胞免疫和自然杀伤细胞（NK细胞）活性；采用ELISA法检测肿瘤坏死因子TNF-α、干扰素IFN-γ、小鼠白细胞介素IL-2的含量；Griess法测定NO含量。结果表明近江牡蛎糖胺聚糖纯化级分CGIa、CGIIa是由糖醛酸、氨基葡萄糖按一定比例构成，含有硫酸基，相对分子量分别为5.17×105 Da、2.64×105 Da，IR分析显示，CGIa和CGIIa都具有糖胺聚糖的特征吸收。牡蛎糖胺聚糖对正常小鼠免疫器官指数、抗体生成数和血清溶血素、细胞免疫、单核巨噬细胞、NK细胞杀伤活性的影响均为阳性，表明其具有免疫增强功能。CGIa和CGIIa能促进正常小鼠免疫细胞分泌TNF-α、IFN-γ、IL-2和NO细胞因子。免疫功能的增强可能是通过促进细胞因子的分泌实现的。 关键词：近江牡蛎；糖胺聚糖；理化性质；细胞因子；免疫调节作用

文章篇号：1673-9078(2014)12-16-24 DOI: 10.13982/j.mfst.1673-9078.2014.12.004 Immunomodulatory Activity of Glycosaminoglycans from Jinjiang Oyster Crassostrea rivularis HU Xue-qiong, WU Hong-mian, FAN Xiu-ping, LIU Qian (Guangdong Provincial Key Laboratory of Aquatic Products Processing and Safety, Key Laboratory of Advanced Processing of Aquatic Products of Guangdong Higher Education Institution, National Research and Development Branch Center for Shellfish Processing( Zhanjiang), College of Food Science and Technology, Guangdong Ocean University, Zhanjiang 524088, China) Abstract: Glycosaminoglycans were extracted from the jinjiang oyster, Crassostrea rivularis, and their physicochemical properties and immunomodulatory activities were studied. Column chromatography was used to obtain a purified fraction of glycosaminoglycans, while high-performance liquid chromatography (HPLC) and infrared spectroscopy (IR) were used to study their physicochemical properties. An immunosuppressed animal model was established by injecting cyclophosphamide (CTX) in mice and the effects of Jinjiang oyster Crassostrea rivularis-derived glycosaminoglycans on the nonspecific immunity and humoral immunity of mice were studied. The activity of immune cells and natural killer (NK) cells was evaluated by the MTT assay. Tumor necrosis factor (TNF)-α, interferon (IFN)-γ, and interleukin (IL)-2 levels in mice were measured by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). The level of nitric oxide (NO) was determined by Griess assay. The results showed that CGIa and CGIIa from the purified fraction of glycosaminoglycans consisted of uronic acid and glucosamine in a certain proportion, with relative molecular weights of 5.17 × 105 and 2.64 × 105 Da, respectively, in addition to sulfate groups. IR analysis showed that CGIa and CGIIa showed characteristic IR absorption profiles of glycosaminoglycans. The results of tests for glycosaminoglycans effects on the immune organ index, antibody production number, serum hemolysin level, cellular immunity, mononuclear macrophage, killing activity of NK cells in normal mice, were all positive, indicating that Jinjiang oyster Crassostrea rivularis glycosaminoglycans enhances immune function. CGIa and CGIIa also stimulated immune cells in normal mice to secrete cytokines including TNF-α, IFN-γ, IL-2, and NO. Enhanced immune function may be achieved by promoting the secretion of cytokines.

Key words: jinjiang oyster Crassostrea rivularis; glycosaminoglycan; physicochemical properties; cytokine; immunomodulatory effect

收稿日期：2014-04-28

项目来源：广东省海洋渔业科技推广专项(A201008I02)

作者简介：胡雪琼（1970-），女，高级实验师，研究方向为农海产品深加工；通讯作者：吴红棉（1953-），男，硕士，教授，研究方向为海洋生物活性物质

16

现代食品科技 Modern Food Science and Technology 2014, Vol.30, No.12

糖胺聚糖（glycosaminoglycan, GAG），又称酸性粘多糖或氨基多糖，是动物体内存在的特征性多糖类化合物，是体内蛋白聚糖的糖链组成部分[1]。糖胺聚糖在抗癌、增强免疫功能、抗氧化、抗血栓形成等方面都呈现出了较强的生物活性[2~5]。Shibeta等[6]发现墨角藻糖胺聚糖(Fucoidans)能激活TNF-α的分泌和增加巨噬细胞、多形核白细胞过氧化物酶的含量从而可以拮抗胃癌。Umezawa等研究表明一种海洋微生物Flovobacteriumw lig inosum能产生一种胞外多糖，称为Marinactan，也具有增强免疫活性，促进体液免疫和细胞免疫，能抑制多种动物移植肿瘤，已用于临床

[7]

盒、小鼠IFN-γ(小鼠干扰素-γ)试剂盒、小鼠TNF-α(小鼠肿瘤坏死因子-α)试剂盒，博士德生物工程有限公司；绵羊红细胞（SRBC），广州南方医院；

补体制备：采集豚鼠血，分离出血清（5只豚鼠血清混合），将1 mL压积SRBC加入到5 mL豚鼠血清中，放4 ℃冰箱30 min，经常振荡，离心取上清，分装，-70 ℃保存，用时以生理盐水按1:10稀释；

K562肿瘤细胞，广东海洋大学海洋药物研究所提供；SPF级KM小鼠（合格证号：SCXK(湘)2009-0012），湖南省长沙市天勤生物技术有限公司提供。

MK-C300N型高速组织捣碎机，飞利浦公司；AUW-120型电子分析天平，日本SHIMADZU公司；MiniPellicon超滤系统，美国MiniPellicon科技有限公司；UV-8000型紫外可见分光光度计，上海元析仪器有限公司；岛津LC-20AT高效液相色谱仪，日本SHIMADZU公司；FTS-175C红外光谱仪，Bio-Rad Win公司；ELx800型全波段酶标仪，美国伯爵仪器有限公司；RCO3000T-5-VBC型二氧化碳培养箱，Thermo Electron Corporation；CKX41型倒置显微镜，奥林巴斯OPTICAL公司。

。

近江牡蛎（Crassostrea Rivularis），牡蛎科或燕蛤

科双壳类软体动物，分布于温带和热带各大洋沿岸水域，是我国四大养殖贝类之一，在广东、广西、福建、浙江、台湾等沿海地区都有大量人工养殖。其肉味鲜美，营养丰富，有“海中牛奶”之称，是我国首批列为药食同源的保健疗效食品之一。近年来人们越来越注重其精、深加工的同时，发现近江牡蛎脏器利用率不高，国内近江牡蛎主要以鲜食和制成干肉制品为主，少量加工成蚝油，或其它调味品。牡蛎除食用外，作为治病强身的海洋药物正以其独特的高效作用，越来越令人刮目相看。本研究团队以近江牡蛎全脏器为原料，从中提取纯化出糖胺聚糖（以下简称为牡蛎糖胺聚糖），实验证明牡蛎糖胺聚糖具有抗肿瘤活性[8~9]，其抗肿瘤机理可能与增强免疫功能有关。因此本文为了进一步探讨其作用，对粗提物提取纯化出糖胺聚糖（以下简称为牡蛎糖胺聚糖），在对其理化性质进行测定的基础上，进一步对其免疫调节活性进行研究，为牡蛎的开发利用提供科学依据。

1.2 实验方法 1.2.1 近江牡蛎糖胺聚糖样品制备

牡蛎全脏器经双酶酶解[9]、醇沉、脱色和等电点除蛋白和超滤脱盐浓缩，得到精制品CG，经DEAE-52

纤维素柱以流速10 mL/h、进样量5.0 mL、进样浓度20 mg/mL、洗脱液为pH 6.0的0.5 M NaAc缓冲液和1.5 M NaCl的条件进行层析得级分CGI、CGII，再经Sephadex G-200葡聚糖凝胶层析得级分CGIa、CGIIa。

1.2.2 牡蛎糖胺聚糖理化性质分析

总糖含量的测定采用苯酚-硫酸法；总糖胺聚糖含量的测定采用阿利新蓝比色法；蛋白含量的测定采用考马斯亮蓝；糖醛酸含量的测定采用硫酸-咔唑法；硫酸基含量的测定采用明胶-氯化钡沉淀法；氨基己糖和氨基半乳糖含量测定采用Wanger比色法；近江牡蛎糖胺聚糖采用两个极分红外光谱检测采用-KBr压片法；糖胺聚糖的纯度及相对分子质量采用高效液相色谱法。

1 材料与方法 1.1 材料与仪器

近江牡蛎（全脏器），湛江市东风市场，全脏器冷冻备用；标准葡聚糖Dextran、盐酸氨基半乳糖、RPMI1640培养液、噻唑蓝（MTT），Sigma公司；葡萄糖、半乳糖、葡萄糖醛酸，国药集团化学试剂有限公司；DEAE-52纤维素、Sephadex G-200、阿利新蓝8GX，Whatman进口分装；咔唑、小牛血清、刀豆蛋白A（ConA），二甲基亚砜（DMSO），上海化学试剂公司；L-半胱氨酸盐酸盐、肝素钠、台盼蓝，上海化学试剂公司；考马斯亮蓝G-250购于上海华舜生物工程有限公司；注射用环磷酰胺（CTX），江苏恒瑞医药股份有限公司；小鼠IL-2(小鼠白细胞介素-2)试剂

1.2.3 牡蛎糖胺聚糖对正常小鼠和免疫抑制小

鼠免疫器官指数及廓清指数影响的测试

1.2.3.1 小鼠免疫器官指数的测定

参考文献[10]。取16~18 g KM小鼠随机分组，每组8只，雌雄各半。实验设空白对照组（生理盐水），CG剂量组（25、50、100 mg/kg），CTX免疫抑制组（30 mg/kg），CG治疗组（CG+CTX）（25、50、100

17

现代食品科技 Modern Food Science and Technology 2014, Vol.30, No.12

mg/kg）。

CTX通过腹腔注射方式给药，CG经灌胃给予，周期7 d，停药24 h后小鼠颈椎脱臼处死，解剖取肝脏、胸腺和脾脏并称重，其中小鼠胸腺指数和脾指数的计算：

胸腺指数胸腺重1000/体重 （1） 脾指数脾脏重1000/体重 （2）

1.2.3.2 碳粒廓清试验

参考文献[11]，小鼠免疫模型同免疫器官指数实验。停药24 h后，于小鼠尾静脉注射印度墨汁（0.1 mL/10 g体重），注入墨汁2 min、10 min后，分别从眼内眦静脉从取血20 µL，立即加入到2 mL 0.1% Na2CO3溶液中。以0.1% Na2CO3作空白，于在波长600 nm处测OD值，计算小鼠碳粒廓清指数。

廓清指数(logOD1logOD2)/(T2T1) （3）

注：OD1=2 min时的吸光度值，T1=2 min；OD2=10 min时的吸光度值，T2=10 min。

体、生理盐水各0.5 mL，空白对照管用生理盐水代替血清的，混匀后置于饱和湿度、37 ℃、5% CO2的细胞培养箱中培养1 h，3000 r/min离心5 min，取上清

液在波长570 nm处测OD值。

HCIgM样品OD值稀释倍数 （5）1.2.5.2 抗体生成细胞数测定

SRBC定量溶血测定法(QHs) [13]，小鼠免疫方法同1.2.5.1。免疫后6 d无菌取脾，操作方法同1.2.4.1。用生理盐水把脾细胞制成5×106个/mL脾细胞悬液。取无菌试管若干，依次加入脾细胞悬液、0.2% SRBC、10%豚鼠血清各0.5 mL，混合均匀。设置不加补体空白对照组。在37 ℃水浴中保温1 h，3000 r/min离心5 min。取上清液在波长413 nm处测OD值。

1.2.6 MTT法检测细胞免疫和NK细胞活性

1.2.6.1 牡蛎糖胺聚糖对小鼠腹腔巨噬细胞免疫功能影响的测定

（1）小鼠腹腔巨噬细胞的制备 根据参考文献[11]的方法进行制备。

（2）小鼠腹腔巨噬细胞吞噬中性红实验根据参考文献[14]稍加改进：将96孔培养板中制得的巨噬细胞单层每孔加入100 μL的RPMI1640培养液，分别加入CG、CGIa、CGIIa样品各20 μL，使样品的终浓度分别达到10 μg/mL、25 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL。PBS作空白对照。在饱和湿度、37 ℃、5% CO2的细胞培养箱中连续培养22 h，每孔加入中性红生理盐水溶液，使终浓度达到1 mg/mL，再继续培养30 min，吸取上清液，用PBS洗涤细胞3次，每孔加入细胞溶解液（乙酸:无水乙醇=1:1）100 μL，室温2 h后测其在波长540 nm处的OD值。各组比较时将光密度值按下式转化为吞噬率：

吞噬率/%OD样品/OD对照100% （6）1.2.6.2 牡蛎糖胺聚糖对NK细胞活性影响的检测

参考文献[15~17]，靶细胞的制备：复苏和培养K562肿瘤细胞，实验前24 h将细胞传代，用RPMI1640培养液调整细胞浓度为1×105个/mL，用台盼兰计数活细胞比例在95%以上。效应细胞的制备：参照1.2.4.1制备的小鼠脾淋巴细胞，用RPMI1640培养液调整为5×106个/mL，用台盼兰计数活细胞比例在95%以上。细胞毒试验：在96孔细胞培养板上分别设置：效应细胞孔、靶细胞孔、效靶细胞孔三组，每孔分别加入100 μL相应的细胞悬液，效靶细胞比例为50:1，每孔总体积为200 μL。在实验孔中加入受试样品CG、CGIa、CGIIa各10 μL，各样品均设定4个剂量（10 μg/mL、

1.2.4 牡蛎糖胺聚糖对小鼠脾细胞增值影响的测定

1.2.4.1 脾细胞悬液的制备

根据参考文献[12]的方法制备。

1.2.4.2 牡蛎糖胺聚糖对小鼠脾细胞增值影响的测定

将脾细胞悬液加96孔培养板中，每孔100 μL。同时加入CG、CGIa、CGIIa各20 μL，使其终浓度分别为10、25、50、100 μg/mL，并设PBS对照组（即每孔加入20 μLPBS）。对照组和每个浓度的样品组均设4复孔。37 ℃，5% CO2培养44 h后，加入MTT 20 μL（5 mg/mL），培养4 h后每孔吸出100 μL上清液，加入100 μL DMSO，振荡30 min，在波长570 nm处测OD值，由公式（4）计算刺激指数。

（4） 刺激指数（SI）实验孔平均OD值/对照孔平均OD值 1.2.4.3 牡蛎糖胺聚糖协同ConA对小鼠脾细胞增值影响的测试 每孔同时加入ConA溶液10 μL使终浓度达到5 μg/mL，其他步骤按1.2.4.2。

1.2.5 体液免疫功能测试

1.2.5.1 血清溶血素含量的测定

血清溶血素的分光光度法[13]测定。选取16~18 g KM小鼠随机分为8组，每组8只，雌雄各半。实验设空白对照组（生理盐水），CG剂量组（25 、50、100 mg/kg），CTX免疫抑制组（30 mg/kg），CG治疗组（CG+CTX）（25、50、100 mg/kg）。CG、CTX均灌胃给予。小鼠致敏后6 d摘眼球取血，室温中待血液凝固分离出血清后，对分离的血清做800倍稀释。取无菌试管一次加入稀释后的血清、0.4% SRBC、补

18

现代食品科技 Modern Food Science and Technology 2014, Vol.30, No.12

25 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL），每个剂量做4个复孔，将培养板置于饱和湿度、37 ℃、5% CO2的细胞培养箱中培养24 h，按照MTT比色法测定570 nm波长下各孔的OD值，计算NK细胞杀伤活性。

（7） NK细胞杀伤活性[1(OD效靶细胞-OD效应细胞)/OD靶细胞]100%

CGIa和CGIIa。

1.2.7 牡蛎糖胺聚糖对正常小鼠免疫细胞分泌

细胞因子影响的测定

参考文献[15~17]用RPMI1640培养液将CGIa、CGIIa分别配置成高中低三个浓度，无菌过滤后在96孔板中每孔加入100 μL，使终浓度分别为100 μg/mL、50 μg/mL、25 μg/mL；正常对照组每孔加入RPMI1640培养液100 μL；LPS阳性对照组每孔加入RPMI1640培养液配置的LPS 100 μL，终浓度为10 μg/mL；ConA阳性对照组每孔加入RPMI1640培养液配置的ConA100 μL，终浓度为4 μg/mL。在此基础上，按照1.2.6.1或者1.2.4.1准备的细胞，每孔加入小鼠腹腔巨噬细胞或者小鼠脾淋巴细胞悬液100 μL。测定小鼠分泌IL-2时，用ConA做阳性对照；测定小鼠腹腔巨噬细胞分泌TNF-α时，以及测定小鼠脾淋巴细胞分泌TNF-α、IFN-γ时，用LPS做阳性对照，每组设置4个复孔，将培养板置于饱和湿度、37 ℃、5% CO2的细胞培养箱中，根据需要培养相应的时间。测定脾细胞分泌TNF-α、IFN-γ、IL-2时，培养48 h后吸取上清液50 μL用于相应的测定；测腹腔巨噬细胞分泌TNF-α时，培养10 h后吸取上清液50 μL用于测定，TNF-α、IFN-γ和IL-2的测定步骤严格按照试剂盒说明书操作。测定腹腔巨噬细胞分泌NO时，培养22 h后吸取上清液50 μL加入等体积的Griess试剂，室温下反应10 min后在波长540 nm处测OD值。 图1 牡蛎糖胺聚糖DEAE-52纤维素离子交换柱层析分离色谱图 Fig.1 Chromatogram of DEAE-52-cellulose ion exchange chromatography of CG 图2 牡蛎糖胺聚糖CGI Sephadex G-200柱层析纯化结果 Fig.2 Results of CGI purification using Sephadex G-200 column chromatography 1.3 统计分析 实验数据以X±S表示，应用JMP7.0统计软件进行方差分析，p<0.05有统计学意义。 2 结果与分析 2.1 牡蛎糖胺聚糖柱层析纯化结果 牡蛎糖胺聚糖经酶解、醇沉后得级分CG，CG再经DEAE-52纤维素柱和Sephadex G-200葡聚糖凝胶柱层析，所得结果如图1、图2和图3所示。

由图1可以看出，CG经过DEAE-52离子交换柱后得到两个重要的峰，分别为CGI和CGII。两个峰相对较为狭窄且对称，说明纯化条件选择适当，纯化效果较好。由图2和3可以看出，CGI和CGII过Sephadex G-200柱后均得到了单一、对称的洗脱峰

图3 牡蛎糖胺聚糖CGII Sephadex G-200柱层析纯化结果 Fig.3 Results of CGII purification using Sephadex G-200 column chromatography 2.2 牡蛎糖胺聚糖组成分析结果

牡蛎糖胺聚糖分离纯化后所得级分CG、CGIa和CGIIa的化学组成分析结构如表1所示。从表1中可看出，分离纯化后的两级分单糖组成差别不大，CGIa是由糖醛酸:氨基葡萄糖=1:1.38的比例构成，硫酸基含量为20.62%；CGIIa是由糖醛酸:氨基葡萄糖=1:1.58的比例构成，硫酸基含量为18.49%。

19

现代食品科技 Modern Food Science and Technology 表1 牡蛎糖胺聚糖化学组成（%）

Table 1 Chemical composition of the purified polysaccharide

2014, Vol.30, No.12

样品 CG CGIa CGIIa

总糖 31.35 51.23 47.64

糖胺聚糖 43.17 65.76 68.78

总蛋白 21.87 8.11 9.66

硫酸基 8.53 20.62 18.49

糖醛酸 7.86 20.04 16.78

氨基半乳糖

6.22 7.31 9.34

氨基葡萄糖 氨基己糖 17.98 27.65 26.47

30.13 36.36 38.58

2.3 牡蛎糖胺聚糖结构分析

牡蛎糖胺聚糖经DEAE-52纤维素柱和Sephadex G-200葡聚糖凝胶柱层析后所得级分CGIa和CGIIa的红外光谱分析结果如图4所示。

键。

图5 CGIa、CGIIa的HPLC图谱

Fig.5 HPLC chromatograms of CGIa and CGIIa 注：a：CGIa；b：CGIIa。

图4 CGIa、CGIIa的红外光谱图 Fig.4 IR spectra of CGIa and CGIIa 注：a：CGIa；b：CGIIa。

从图5可以看出，经过DEAE-52纤维素柱和Sephadex G-200凝胶柱纯化后的多糖组分CGIa、CGIIa，分别经高效液相色谱分离得到单一对称峰且峰型较窄，说明实验所得级分CGI和CGII纯度较高。标准曲线求得CGIa和CGIIa的相对分子质量为5.17×105 Da和2.64×105 Da。

CGIa的红外吸收光谱如图4，谱图分析[18~19]如下：在3280.88 cm-1左右处具有强宽吸收峰，说明有糖类-OH；2803.20 cm-1左右有吸收峰，说明有糖类饱和C-H键。在1654.21 cm-1和1564.52 cm-1处有吸收，说明有乙酰氨基（-NH2COCH3）存在；在1411.75 cm-1、1240.53 cm-1、850.97 cm-1处有吸收，说明有-COO-、-O-SO3-和C-O-S存在，且在氨基己糖上的C4有硫酸酯键。1152.85 cm-1、1079.33 cm-1、1023.80 cm-1处为吡喃糖环的醚键C-O-C和-OH的特征吸收；在950-1250 cm-1的强吸收，说明多糖的单糖组成是吡喃单体。综上，C-H键、-NH2COCH3、-COO-、-O-SO3-、C-O-S、C-O-C和-OH是糖的特征基团，因此CGIa是糖胺聚糖。同理，CGIIa也是糖胺聚糖，且50.19 cm-1处的吸收峰说明存在α糖苷

20

2.4 牡蛎糖胺聚糖对小鼠免疫器官指数和廓清指数的影响

牡蛎糖胺聚糖对小鼠的脾指数、胸腺指数、廓清

指数的影响结果如表2所示。

由表2可见，与对照组（Control）相比，CG组的脾指数、胸腺指数和廓清指数显著提高，说明CG能够增强正常小鼠的免疫器官指数及廓清指数；环磷酰胺组（CTX组）的脾指数、胸腺指数和廓清指数降低，说明CTX对正常小鼠的免疫器官有一定程度的

现代食品科技 Modern Food Science and Technology 2014, Vol.30, No.12

损伤，能抑制正常小鼠腹腔巨噬细胞的廓清指数增加。与CTX组相比，CG+CTX组的脾指数和胸腺指数显著增高，说明CG对CTX引起器官免疫损伤有一定的

修复作用；CG+CTX组的廓清指数均有所降低，说明CG对CTX引起的抑制作用不明显。

表2 CG对小鼠脾指数、胸腺指数、廓清指数的影响（X±S，n=8）

Table 2 Effect of CG on spleen, thymus and clearance indexes in mice induced by CTX in vivo (X±S, n=8)

组别 Control CG 剂量/(mg/kg)

25 50 100 CTX CG+CTX 30 25+30 50+30 100+30 脾指数 2.73±0.69 2.75±0.58 3.01±0.31＊ 3.04±0.47＊ 2.27±0.23＊＊ 2.31±0.18＊＊胸腺指数 1.23±0.04 1.41±0.18＊＊ 1.46±0.07＊＊ 1.53±0.35＊＊ 0.99±0.39＊ 1.05±0.27 1.17±0.36△△ 1.16±0.44△△ ＊廓清指数 0.019±0.011 0.027±0.016＊ 0.029±0.008＊ 0.020±0.002 0.017±0.002 0.014±0.003 0.014±0.002 0.015±0.001 2.36±0.23＊＊△ ＊2.42±0.45△△ 注：＊P﹤0.05，＊＊P﹤0.01 vs Control；与空白组相比显著差异，极显著差异；△P﹤0.05，△△P﹤0.01 vs CTX group；与CTX组相比显著差异，极显著差异。 2.5 牡蛎糖胺聚糖对小鼠脾细胞增值的影响 牡蛎糖胺聚糖对小鼠淋巴细胞增殖的影响的试验结果如表3所示。 表3 牡蛎糖胺聚糖对小鼠脾淋巴细胞增殖的影响（X±S，n=4） Table 3 Effect of CG on serum hemolysin level and the number of antibody-producing cells in mice (X±S，n=8) 组别 Control 剂量 /(μg/mL) 5 10 CG 25 50 100 10 CGIa 25 50 100 10 CGIIa 25 50 100 吸光度值 OD570 0.122±0.002 0.125±0.013 0.129±0.017 0.152±0.009＊＊ 0.136±0.015＊ 0.145±0.007＊ 0.176±0.017＊＊ 0.159±0.011＊＊刺激指数 (SI) 1.00 1.02 1.04 1.25 1.11 1.19 1.44 1.30 1.25 1.12 1.18 1.25 1.23 C吸光度值 ConA (OD570) 0.122±0.003 0.169±0.003＊＊ 0.178±0.005＊＊ 0.189±0.012＊＊ 0.186±0.001＊＊ 0.145±0.006＊＊ 0.186±0.013＊＊ 0.178±0.011＊＊刺激指数 ConA (SI) 1.00 1.38 1.46 1.55 1.52 1.19 1.63 1.46 1.41 1.12 1.19 1.48 1.29 0.153±0.006＊＊ 0.137±0.002＊ 0.144±0.005＊ 0.152±0.014＊＊ 0.151±0.007＊＊ 0.172±0.009＊＊ 0.138±0.002＊＊ 0.147±0.003＊＊ 0.181±0.007＊＊ 0.157±0.001＊＊ 注：＊P﹤0.05，＊＊P﹤0.01 vs Control；与空白组相比显著差异，极显著差异。 由表3可知：与对照组相比，牡蛎糖胺聚糖直接作用于小鼠淋巴细胞时，对细胞增殖有一定的增强作用，其中浓度为25 μg/mL的CGIa刺激系数最高，达到1.44；牡蛎糖胺聚糖协同作用与直接作用具有相同趋势，且相同浓度下牡蛎糖胺聚糖协同ConA的增殖能力较强，当浓度为25 μg/mL的CGIa刺激指数达到最高，为1.63。脾细胞增殖是由有丝分裂原诱导的，因此牡蛎糖胺聚糖具有有丝分裂原样作用。

响 牡蛎糖胺聚糖对小鼠的血清溶血素含量和抗体生成数的影响的试验结果如表4所示。

血清溶血素含量与抗体生成细胞数是反应体液免疫功能的重要指标。由表4可见，与Control组相比，CG组的血清溶血素含量与抗体生成细胞数显著提高，说明CG能够增强正常小鼠的体液免疫；环磷酰胺组（CTX）组的血清溶血素含量降低，说明CTX

21

2.6 牡蛎糖胺聚糖对小鼠体液免疫功能的影

现代食品科技 Modern Food Science and Technology 2014, Vol.30, No.12

对正常小鼠的体液免疫有损伤。与CTX组相比，CG+CTX组的血清溶血素含量显著增高，说明CG对

CTX引起的体液免疫损伤有一定的修复作用。

表4 CG对小鼠血清溶血素含量及抗体生成细胞数的影响（X±S，n=8）

Table 4 Effect of CG on serum hemolysin level and the number of antibody-producing cells in mice (X±S，n=8)

组别 Control

剂量/(mg/kg)

25

CG CTX CG+CTX 50 100 30 25+30 50+30 100+30 HClgM 32.80±1.023 35.20±1.025 40.80±2.030＊ 47.20±4.034＊ 31.20±2.013 35.20±1.027△ 38.40±2.023＊△QHS 0.031±0.012 0.054±0.014＊＊ 0.065±0.008＊＊ 0.073±0.016＊＊ 0.138±0.013＊＊＊ 0.104±0.005＊＊＊△△ 0.116±0.007＊＊＊△△△ 45.60±1.012＊＊△△ 0.097±0.001＊＊＊△△ 注：＊P﹤0.05，＊＊P﹤0.01 vs Control；与空白组相比显著差异，极显著差异；△P﹤0.05，△△P﹤0.01 vs CTX group；与CTX组相比显著差异，极显著差异。 2.7 牡蛎糖胺聚糖对小鼠腹腔巨噬细胞免疫功能及NK细胞活性的影响 牡蛎糖胺聚糖对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬中性红能力及NK细胞杀伤活性的试验结果如图6、图7所示。

图7 蛎糖胺聚糖对小鼠NK细胞活性的影响（X±S，n=4） Fig.7 Effect of CG, CGIa, and CGIIa on the cytotoxicity of NK cells (X±S，n=4) 2.8 牡蛎糖胺聚糖对小鼠免疫细胞分泌细胞因子的影响 牡蛎糖胺聚糖对小鼠脾脏细胞分泌因子影响的试验结果如表5、表6、表7所示。 表5显示，与空白组比较，CGIa和CGIIa的低中高浓度均能极显著地促进小鼠脾淋巴细胞分泌细胞因子TNF-α、IFN-γ，并且存在一定的量效关系。CGIa和CGIIa的各剂量组促TNF-α分泌能力高于阳性对照细菌脂多糖组（LPS），而只有CGIa和CGIIa的高剂量组促IFN-γ分泌能力远远高于LPS组，分别达到586.842±41.749pg/mg和651.579±36.585pg/mg。

由表6可知，与空白对照组相比，CGIa和CGIIa的低中高浓度均能显著地促进小鼠脾淋巴细胞分泌细胞因子IL-2，且存在量效关系。只有CGIIa的高剂量组与阳性对照刀豆蛋白组（ConA）的促进效果相近。

图6 牡蛎糖胺聚糖对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬中性红能力的影响（X±S，n=4） Fig.6 Effect of CG, CGIa, and CGIIa on phagocytic activity of mouse peritoneal macrophages against neutral red in vitro (X±S，n=4) 由图6、图7知：各个剂量组均能增强小鼠腹腔巨噬细胞吞噬中性红的能力，且具有一定的量效关系。在相同的剂量条件下，CGIIa对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬中性红的能力强于CGIa，其中50 μg/mL的CGIIa作用效果最好。

受试样品CG、CGIa、CGIIa的四个剂量组均能显著或极显著地增强NK细胞的活性，且存在一定的剂效关系；其中，100 μg/mL的CGIa增强效果最高，达到39.09%。

22

现代食品科技 Modern Food Science and Technology 2014, Vol.30, No.12 表5 牡蛎糖胺聚糖对正常小鼠脾脏细胞分泌细胞因子TNF-α、IFN-γ的影响（X±S，n=4） Table 5 Effect of CGIa and CGIIa on the secretion of TNF-α and IFN-γ by normal mouse spleen cells in vitro (X±S, n=4)

组别 Control LPS CGIa

剂量/(μg/mL)

10 25 50 100 25 CGIIa ＊＊＊脾脏TNF-α水平/(pg/mg)

38.235±5.392 75.294±11.236＊＊ 75. 882±7.851＊＊ 102.353±17.198＊＊ 287.059±21.753＊＊ 78.824±6.735＊＊ 105.882±9.419＊＊ 282.941±15.516＊＊ 腹腔巨噬TNF-α水平/(pg/mg)

543.529±26.851 665.294±25.996＊ 783.235±31.354＊＊ 884.118±22.117＊＊ 903.529±14.918＊＊ 741.765±33.229＊＊ 898.235±26.771＊＊ 912.941±36.842＊＊ IFN-γ水平/(pg/mg) 202.633±35.697 412.632±26.322＊＊ 344.737±58.395＊＊ 399.474±35.668＊＊ 586.842±41.749＊＊ 360.000±19.653＊＊ 428.421±33.974＊＊ 651.579±36.585＊＊ 50 100 注：P﹤0.05，P﹤0.01 vs Control；与空白组相比极显著差异，极显著差异。 表6 近江牡蛎糖胺聚糖对正常小鼠脾脏细胞分泌细胞因子IL-2的影响（X±S，n=4） Table 6 Effect of CGIa and CGIIa on the secretion of IL-2 by normal mouse spleen cells in vitro（组别 Control ConA 剂量/(μg/mL) 10 25 CGIa 50 100 25 CGIIa 50 100 差异，极显著差异。 表7 近江牡蛎糖胺聚糖对正常小鼠脾脏细胞分泌细胞因子NO的影响（的能力，且存在一定的量效关系。相同剂量条件下，CGIIa的促进效果高于CGIa，且50 μg/mL的CGIIa剂量组促进效果最好。 X±S，n=4） IL-2水平/(pg/mg) 0.513±0.097 2.820±0.237＊＊ 0.769±0.162＊ 1.026±0.173＊＊3 结论 3.1 近江牡蛎全脏器经酶解、醇沉等后得牡蛎糖胺聚糖粗品（CG），CG经两次柱层析后得级分CGIa与CGIIa，为单一峰。CGIa与CGIIa与糖醛酸和氨基葡萄糖构成，均含有硫酸基（20%左右），相对分子量分别为5.17×105 Da、2.64×105 Da。IR检测结果表明CGIa与CGIIa为糖胺聚糖。 3.2 牡蛎糖胺聚糖可提高正常小鼠的脾指数和胸腺指数，并对CTX引起的免疫器官损伤有一定的修复作用；可增强小鼠脾细胞的增殖能力，协同ConA时，增强效果更为显著，其中浓度为25 μg/mL的CGIa协同ConA作用时，刺激指数最高（1.63）；可提高正常小鼠的血清溶血素含量和抗体生成细胞数，且对CTX引起的体液免疫损伤有一定的修复作用；可提高正常小鼠腹腔巨噬细胞吞噬中性红能力和廓清指数，其中50 μg/mL的CGIIa吞噬中性红能力最强，可达160.6%；可增强正常小鼠NK细胞活性，100 μg/mL的CGIa增强效果最高，可达39.09%；可促进正常小鼠免疫细胞分泌TNF-α、IFN-γ、IL-2和NO细胞因子。 2.038±0.155＊＊ 0.796±0.031＊ 1.282±0.181＊＊ 2.821±0.226＊＊ 注：＊P﹤0.05，＊＊P﹤0.01 vs Control；与空白组相比显著X±S，n=4） Table 7 Effect of CGIa and CGIIa on the secretion of NO by normal mouse spleen cells in vitro (组别 Control 剂量/(μg/mL) 10 CGIa 25 50 100 10

CGIIa

25

50 100

X±S, n=4) NO含量/(μmol/L) 0.726±0.065 1.118±0.066＊ 1.576±0.073＊ 2.165±0.456＊＊ 2.623±0.945＊＊ 提示牡蛎糖胺聚糖具有免疫增强功能，并对CTX造成的免疫损伤有一定的修复作用。 2.099±0.767＊＊ 2.753±0.234＊＊ 3.799±0.567＊＊ 3.604±0.176

＊＊

参考文献

[1] 沈鸣,陈建伟.氨基多糖的药理研究进展[J].上海医药,2001,

22(6):268-270

SHEN Ming, CHEN Jian-wei. Advances in the pharmacological study on aminopolysaccharides [J]. Shanghai Medical and Pharmaceutical Journal, Shanghai Medical and Pharmaceutical Journal, 2001, 22(6): 268-270

23

注：＊P﹤0.05，＊＊P﹤0.01 vs Control；与空白组相比显著差异，极显著差异。

由表7，与空白对照组相比，CGIa和CGIIa的所选剂量组均能在体外促进小鼠腹腔巨噬细胞产生NO

现代食品科技 Modern Food Science and Technology 2014, Vol.30, No.12

[2] PAN J, QIAN Y, Weiser P, et al. Glycosaminoglycans and

activated contact system in cancer patient plasmas [J]. Progress in Molecular Biology and Translational Science, 2010, 93: 473-495

[3] CUI Q, WANG H, YUAN C. The preliminary study on the

antithrombotic mechanism of glycosaminoglycan from mactra veneriformis [J]. Blood Coagulation & Fibrinolysis, 2014, 25(1): 11-18

[4] HenrotinY, Lambert C, Richette P. Importance of synovitis in

osteoarthritis: evidence for the use of glycosaminoglycans against synovial inflammation review article [J]. Seminars in Arthritis and Rheumatism, 2014, 43(5): 579-587

[5] Takaya Y, Uchisawa H, Matsue H, et al. An investigation of

the antitumor peptidoglycan fraction from squid ink [J]. Biol. Pharm. Bull., 2004, 17(6): 846-849

[6] Shibata H, Kimura-Takagi I, Nagaoka M. et al. Properties of

fucoidan from Cladosiphon okamuranus tokida in gastric mucosal protection [J].Bio. Factors, 2000, 11(4): 235-245 [7] Umezawa H, Okami Y, Kurazawa S, et al. Marinactan,

antitumor polysaccharide produced by marine bacteria [J]. The Journal of Antibiotics, 1983, 5: 471-477

[8] 胡雪琼,吴红棉,刘芷筠,等.近江牡蛎糖胺聚糖的酶解提取

及其抗肿瘤活性研究[J].食品研究与开发,2009,30(7):3-6 HU Xue-qiong, WU Hong-mian, LIU Zhi-jun, et al. Study of enzymatic preparation of glycosaminoglycan with anti-tumor activity from crassostrea rivularis crould [J]. Food Research and Development, 2009, 30(7): 3-6 [9] 吴红棉,范秀萍,胡雪琼,等.近江牡蛎糖胺聚糖体内外抗肿瘤活性的研究[J].现代食品科技,2014,30(6):18-23 WU Hong-mian, FAN Xiu-ping, HU Xue-qiong, et al. Antitumor activity of glycosaminoglycan from crassostrea rivulari [J]. Modern Food Science and Technology, 2014, 30(6): 18-23 [10] 程安玮,金征宇,万发春.甘草多糖对小鼠腹腔巨噬细胞的激活作用[J].食品科学,2007,28(12):431-435 CHENG An-wei, JIN Zheng-yu, WAN Fa-chun. Activation effects of glycyrrhiza polysaccharideon mouse peritoneal macrophages [J]. Food Science, 2007, 28(12): 431-435 [11] 郑建仙.功能性食品[M].第三版,北京:中国轻工业出版

社,1999

ZHENG Jian-xian. Functional foods [M]. Third Edition, Beijing: China Light Industry Press, 1999: 105-106, 126-127 [12] Shindo T, Ikeda U, Ohkawa F, et al. Nitric oxide synthesis in

caricac myocityes fibroblates by inflammatory CTXtokines [J]. Cardiorasec Res., 1995, 29(6): 813-819

[13] 徐淑云.药理学实验方法学(第3版)[M].北京:人民卫生出

版社,2002

XU Shu-yun. Methodology of pharmacology experiment (Third Edition). Beijing: People's Medical Publishing House, 2002: 1433-1436

[14] 杨铁红.当归多糖的分离纯化与免疫条件作用及其机理研究[D].西安:第四军医大学,2003 YANG Tie-hong. Purification and immunomodulating activities of polysaccharide from angelieasinensis [D]. XiAn: The Fourth Military Medical University, 2003 [15] 张凤,杨桂文.绿茶提取物及表没食子儿茶素没食子酸酯对免疫细胞的作用研究[J].时珍国医国药,2009,20(5): 1094- 1095

ZHANG Feng, YANG Gui-wen. Study on the effects of green tea extract and egcg on immune cells [J]. Lishizhen Medicine and Materia Medica Research, 2009, 20(5): 1094-1095 [16] 高慧灵.木蹄层孔菌多糖免疫调节作用的实验研究[D].广

州:南方医科大学,2009

GAO Hui-lin. Experimental study of the immunomodulatory effects of fomes fomentarius polysaccharides [D]. GuangZhou: Southern Medical University, 2009

[17] ZHOU G F, SHENG W X, YAO W H, et al. Effect of low

molecular λ~carrageenan from Chondrus ocellatus on antitumor H~22 activity of 5~Fu [J]. Pharmacological Research, 2006, 53(2): 129-134

[18] Rieppo L, Saarakkala S, Närhi T, et al. Application of second

derivative spectroscopy for increasing molecular specificity of fourier transform infrared spectroscopic imaging of articular cartilage [J]. Osteoarthritis and Cartilage, 2012, 20(5): 451-459 [19] Maria

OL,

Karl

O.

Sulfate

composition

of

glycosaminoglycans determined by infrared spectroscopy [J]. 1991, 192(1): 193-196

24