外源性DNA残留量测定法(qPCR法)

重组抗人表皮生长因子受体人源化单克隆抗体

外源性DNA残留量测定法(qPCR法)

1原理

实时定量PCR（qPCR）扩增分2个阶段，指数增长阶段和之后出现的非指数平台阶段。在指数增长阶段，每个循环PCR产物量大约增加一倍。然而，随着反应的进行，反应体系组成成分的消耗，其中的一种或多种成分限制反应，产物增长速度变慢，反应进入平台期。

反应最初，虽然产物呈指数增长，但是荧光处于背景水平，检测不到荧光增加。但积累了足够的扩增产物，才可检测到的荧光信号，这个循环数叫初始循环数，即CT。CT值主要由扩增反应体系中模板的初始浓度决定的。如果模板初始浓度高，只需要较少的扩增循环就可以积累足够的产物，产生高过背景的荧光信号，因此，反应就有一个小或早出现的CT；相反，如果模板初始浓度低，需要较多的扩增循环才能产生高过背景的荧光信号，反应就有一个大或迟出现的CT。两者之间关系的建立是qPCR用于定量的依据。 2主要仪器

表2 仪器信息表 名 称 实时定量PCR仪 厂 家 Bio-Rad 型 号 CFX Connect 3主要试剂

表3 试剂信息表 名 称 厂 家 规 格 1） Lysis Buffer,2 bottles,50ml/bottle; 2） Binding Solution,1 empty bottle; 3） Wash Buffer Concentrate, 2 bottles, 26 ml/bottle; 4） Elution Buffer; 1 bottle, 25ml; 5） Proteinase K (PK) Buffer, 1 bottle, 50ml; 6） Magnetic Particles, 2 tubes, 1.5 ml/tube; 7） Proteinase K, 2 tubes, 20 mg/ml, 1.25 ml; 8） Yeast tRNA, 2 tubes,10mg/ml,0.5ml; Glycogen, 2 tubes,5mg/ml,1.0ml/tube. 1) DNA Control,1 bottle,40μl; 2) DNA Dilution Buffer(DDB),1 bottle,7ml; 3) 2×Environmental Master Mix, 2 tubes,0.75ml/tube; 4) 10×DNA Resl-Time PCR Assay Mix, 1 tube,300μl; 5) Negative Control, 1 tube,1.0ml. 残留DNA样品制备试剂盒 ABI 残留DNA定量检测试剂盒（CHO） ABI 4溶液配制

4.1 蛋白酶K混合液（新配）

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（qPCR）

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Proteinase K Proteinase K Buffer 1 reaction （100μl/sample） 10μl 60μl 10 reaction （100μl/sample） 100μl 600μl 4.2 裂解混合液（新配）

试 剂 Glycogen（5mg/ml） tRNA（10mg/ml） Lysis Buffer 合 计 体 积（μl） 180 4 7600 7784 4.3 DNA标准品稀释

Tube label SD1 SD2 SD3 SD4 SD5 SD6 NTC Dilution DNA Control 10μl DNA Control+990μl DDB 50μl SD1+450μl DDB 50μl SD2+450μl DDB 50μl SD3+450μl DDB 50μl SD4+450μl DDB 50μl SD5+450μl DDB DDB pg/μl 30000 300 30 3 0.3 0.03 0.003 0 pg/ reaction 300000 3000 300 30 3 0.3 0.03 0 注：DNA标准品溶液4℃放置保存1天，-20℃放置保存1周。 5测定方法 5.1样品处理 5.1.1除蛋白

1）在2ml离心管中加入100μl样品；

2）每100μl的样品中加入70μl的蛋白酶K混合液，混合均匀，56℃水浴

30min；

3）每100μl的样品中加入360μl的裂解液，室温裂解2小时以上。 5.1.2 DNA的纯化

1）磁珠使用前于37℃温浴10min，高速涡旋，彻底悬浮磁珠； 2）每100μl的样品加入30μl的磁珠悬浮液；

3）每100μl的样品加入300μl的Binding Solution，涡旋混合5min；

4）12000r/min离心30sec，将离心管放置于磁力架上，静置5min直至溶液清澈，弃上清；

5）从磁力架上取下离心管，加入300μl的Wash Buffer，涡旋混合5 sec； 6）12000r/min离心30sec，将离心管放置于磁力架上，静置2min，弃上清； 7）重复步骤6）1次，打开离心管的盖子，室温下风干；

8）加入50μl的Elution Buffer，高速涡旋10 sec，70℃处理10min，在温浴过程中，涡旋2~3次；

9）12000r/min离心30sec，将离心管放置于磁力架上，静置2min，将含有洗脱DNA的液体转移到新的1.5ml的离心管中，用于进行qPCR反应。

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（qPCR）

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5.2 PCR反应体系

1）标准品、NTC和样品均做2个复孔； 2）反应母液用量按表4进行计算：

表4 PCR反应体系 Kit Reagents Negative Control 10×DNA Resl-Time PCR Assay Mix 2×Environmental Master Mix DNA template 合 计 Volume for 1 30-μl reaction（μl） 2 3 15 10 30 Volume for 36 30-μl reaction（μl） 72 108 540 N/A 720 5.3 PCR仪运行程序设置 5.3.1 PCR反应体系

1）标准品、NTC和样品均做2个复孔； 2）反应母液用量按表5进行计算：

表5 PCR反应体系 Kit Reagents Negative Control 10×DNA Resl-Time PCR Assay Mix 2×Environmental Master Mix DNA template 合 计 Volume for 1 30-μl reaction（μl） 2 3 15 10 30 Volume for 36 30-μl reaction（μl） 72 108 540 N/A 720 5.2.2 PCR仪运行程序设置

1）荧光基团选择FAM；

2）96孔反应模块设置见下表，样品根据实际数量依次设置：

A B C D E F G H 1 2 3 样品1 样品2 样品3 4 样品1 样品2 样品3 5 6 7 8 9 10 11 12 SD1 SD1 SD2 SD2 SD3 SD3 SD4 SD4 SD5 SD5 SD6 SD6 NTC NTC

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（qPCR）

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3）PCR反应条件设置

步 骤 1 2 3 4 温 度 95℃ 95℃ 60℃ GOTO 2，39循环 时 间（min:sec） 10:00 0:10 0:30 4）运行上述设置的程序。

6接受标准

1）标准曲线：扩增效率（E）：90%~130%；R2≥0.980；斜率（Slope）： -2.7~-3.6。

2）样品数据：2个复孔测定值SQ的CV≤20%。 7结果计算与判断

外源性DNA残留量（pg/ml）=SQ×50，SQ代表测定平均值。

根据检测样品的蛋白质浓度，得出样品中每剂量所残留的外源性DNA量。

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