FISH以及免疫荧光的实验步骤
FISH
一、当已知某个基因定位在细胞核中,而要知道它具体定位在细胞核的什么
位置(或者染色体的具体位置)则需要制备中期相细胞。因为只有中期相的染色体是最利于观察的。具体操作如下:
染色体FISH以及免疫荧光
I、细胞处理
1、在头一天晚上铺板6cm板(到第二天下午开始做实验,这时的细胞是生长活
性比较旺盛的),在实验之前3个小时加秋水仙素(使得终浓度为0.5ug/ml)(短时程高浓度秋水仙素使大量细胞处于中期相)
2、用胰酶消化细胞,然后用6ml 75mM KCl重悬细胞(低渗溶液,使细胞充分
吸水膨胀,但是又不会胀破,最好现配现用,用前37℃预热),37℃水浴锅30min。(这一步非常关键,KCl的用量是适细胞量来加的,对于6cm板的细胞一般加6ml,不过一般一个6cm板的细胞就够滴很多个片子了,一般在低渗的过程中是不会有细胞沉淀的,否则就是低渗液太少了,如果低渗液加的太少细胞膜无法打开,则滴片效果大大降低)
3、加入1ml固定液,200g 5min。
4、用5ml固定液(甲醇:冰醋酸=3:1)重悬细胞(固定),室温30min,期间混
匀一次细胞。
5、重复步骤4一次
6、200g 5min,用500ul固定液重悬细胞。
II、探针制备
1、T载质粒构建
2、质粒酶切,如果用T7 promoter转录就用NdeI酶切,如果用Sp6 promoter转
录就用sacII酶切。
3、酶切产物直接回收。以这个产物为模板,按照Thermo T7转录试剂盒转录出
RNA
4、RNA纯化(加入1/10的3M醋酸钠,2倍体积的无水乙醇)-80℃20min
5、12000rpm 10min,去上清,加入1ml 75%的乙醇。
6、7500rpm 5min,去上清,干燥,用适量DEPC水溶解。
7、取15ugRNA(加入1/10的3M醋酸钠,2倍体积的无水乙醇)-80℃20min
8、12000rpm 10min,去上清,加入1ml 75%的乙醇。
9、7500rpm 5min,去上清,干燥,用20ul labling buffer溶解。
10、95℃5min ,立即冰上冷却5min
11、加入5ul UlS染料(一旦开始加入染料之后,所有操作都应该避光)
12、90℃10min,立即冰上冷却5min。(加入1/10的3M醋酸钠,2倍体积的无
水乙醇)-80℃20min
13、12000rpm 10min,去上清,加入1ml 75%的乙醇。
14、7500rpm 5min,去上清,干燥,用20ul~30ul DEPC水溶解。
III、铺片
1、先将载玻片放在黄色玻片盒里,然后放进-80℃冰箱冷却。(超低温可以使得
染色体充分的炸开)
2、将预冷的玻片45度放在地上,然后从高空滴下细胞(50ul 每滴)到玻片上。
(吸细胞的枪头用剪刀剪掉前端)
3、然后迅速用吹风机吹干,并在酒精灯上过三下(使细胞更好的贴附在玻片上)
然后放进无水乙醇中5min,再放进2*SSC 5min,(不能放进2*SSC 5min,再放进无水乙醇中5min,因为在杂交过程中酒精是大忌,它会严重影响杂交效果)然后迅速用吹风机吹干。
4、取15ul探针与15ul杂交液(探针:杂交液=1:1,在吸杂交液的时候,枪头用
剪刀剪掉前端,慢慢的吸出,杂交液很黏)1:1混合,然后分三滴滴在玻片上。
盖上盖玻片。
5、将一个锡箔纸放在金属浴上(使受热均匀),然后玻片放在锡箔纸上,80℃
10min。(变性)
6、事先将黑盒子洗干净,然后配置湿液(4*SSC:甲酰胺=1:1),将其倒入黑盒
中37℃培养箱中预热。
7、将第五步的玻片放入黒盒中,37℃杂交过夜。(如果背景过高,可以将杂交温
度提高到42℃)
8、将盖玻片用小刀揭掉,在2*SSC中洗一次,5min(为了降低背景,洗掉杂信
号,可以将洗涤液即2*SSC可以45摄氏度预热),不要过多洗涤,不然会将染色体洗掉
9、敷一抗(抗体:1%BSA=1:200)每个片子用150ul即可覆盖整个片子。然后
用封口膜覆盖整个片子。放在黑盒子里4℃24h
10、用镊子撕掉封口膜,2*SSC中洗三次,每次5min。敷二抗(抗体:
1%BSA=1:100)每个片子用150ul即可覆盖整个片子。然后用封口膜覆盖整个片子。放在黑盒子里4℃12h。
11、2*SSC中洗两次,每次5min。吸干之后加入DAPI,5min,然后加入2*SSC,
立即吸干,再加入2*SSC洗5min,吸干并吹干,然后制片。显微镜观察。二、如果只是鉴定某个基因是定位在细胞核还是细胞质,则将细胞用胰酶消化离心之后用5ml 1*PBS重悬,然后慢慢滴入1ml固定液(预固定),立即200g 5min,用5ml固定液重悬细胞(固定),室温30min,期间混匀一次细胞。200g 5min,用5ml固定液重悬细胞(固定),室温30min,期间混匀一次细胞。200g 5min,用500ul固定液重悬细胞,后面步骤同上。在后面铺片的时候是涂片而不是滴片,即将细胞用枪头涂在玻片上(玻片不用冷却),然后迅速吹干,并在酒精灯上过三下。
细胞免疫荧光
1、双阻断法爬片制备后期相细胞(终浓度为5mM胸腺嘧啶处理16h,吸去旧培
液,用1*PBS洗4次,加入新培液,9h后,加入胸腺嘧啶使终浓度为5mM,处理16h,吸去旧培液,用1*PBS洗4次,加入新培液,9h后固定)
2、将片子挖出,放入固定液中固定5min
3、1*TBST洗3次*5min
4、0.1% TritonX-100/TBS 处理5min(破细胞膜,使细胞质中可溶性的蛋白释放
出来,并且洗掉一些细胞质中的杂蛋白)
5、0.1% Tween20/TBS洗2次*5min
6、1%BSA(称1g BSA溶解于100ml TBST中)室温30min~1h
7、将片子挖出,然后将多余的液体吸干,加入一抗(一抗:1%BSA=1:100稀释)
4℃2h,再室温2h
8、0.1% Tween20/TBS洗3次*5min
9、加入二抗(二抗:1%BSA=1:100稀释,避光,因为二抗有荧光基团),4℃1h,
再室温1h
10、0.1%Tween20/TBS洗3次*5min
11、DAPI然5min
12、0.1%Tween20/TBS洗2次*5min
13、吹干,制片,镜检,观察。
(TritonX-100与Tween20都是属于去污剂,用于破坏细胞膜,但是TritonX-100比Tween20的作用强)
因篇幅问题不能全部显示,请点此查看更多更全内容