嗜酸粒细胞过氧化物酶快速染色的研究

第１９卷第５期　２０１０年１Ｏ月　中国组织化学与细胞化学杂志　ＣＨＩＮＥＳＥ　Ｊ０ＵＲＮＡＬ　０Ｆ　ＨＩＳＴｏＣＨＥＭＩＳＴＲＹ　ＡＮＤ　Ｙ　Ｖｏ１．１９．Ｎｏ．５　Ｏｃｔｏｂｅｒ．２０１０　嗜酸粒细胞过氧化物酶快速染色的研究　李福德　王宏梅　（哈尔滨医科大学附属肿瘤医院，哈尔滨１５００８１；　中国医学科学院北京协和医科大学血液学研究所，天津３０００２０）　［摘要］　目的建立嗜酸粒细胞过氧化物酶快速染色方法，完善包括嗜酸粒细胞脱颗粒或中性粒细胞粗颗粒等各种　情况下嗜酸粒细胞准确并快速计数的质量控制。方法随机选取７５例血液病患者的骨髓涂片标本，要求常规瑞一姬染色骨　髓分类嗜酸粒细胞≥３．５　，取材３ｄ内。每份标本中选取两张，分别划人实验组和对照组。实验组标本进行嗜酸粒细胞过　氧化物酶快速染色，对照组标本进行常规瑞一姬染色。分别计数嗜酸粒细胞百分数。结果　实验组嗜酸粒细胞颗粒染成黑　色，对包括中性粒细胞在内的其他细胞染色效果同瑞一姬染色，显微镜下嗜酸粒细胞显示醒目，可快速准确计数。结果与　对照组比较，经ｔ检验，Ｐ＞０．０５，无统计学差异。结论嗜酸粒细胞过氧化物酶快速染色方法比较常规瑞一姬染色具有快　速染色，对嗜酸粒细胞的显示更加醒目的优点，且对包括中性粒细胞在内的其他细胞染色兼有瑞一姬染色的效果。该方法　值得推广用于快速骨髓细胞染色，且适用于包括嗜酸粒细胞形态不典型及中性粒细胞颗粒粗大等各种情况下的嗜酸细胞计　数的质量控制，从而准确有效地服务于临床诊治。　（关键词］　骨髓涂片；　嗜酸粒细胞；　过氧化物酶；　细胞化学；　快速染色　［中图分类号］　Ｒ３２９　（文献标识码］　Ａ　Ｄ０Ｉ：１０．３８７０／ｚｇｚｚｈｘ．２０１０．０５．０１７　Ａ　ＳＴＵＤＹ　ｏＮ　ＥＯＳＩＮｏＰＨＩＬ　ＰＥＲｏＸＩＤＡＳＥ　ＲＡＰＩＤ　ＳＴＡＩＮＩＮＧ　Ｌｉ　Ｆｕｄｅ　．Ｗａｎｇ　Ｈｏｎｇｍｅｉ　（Ｔｕｍｏｒ　Ｈｏｓｐｉｔａｌ　Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｗｉｔｈ　Ｈａｒｂｉｎ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｈａｒｂｉｎ，１５００８１；　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　ｏｆ　Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ，Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｔｉａｎｊｉｎ，３０００２０，Ｃｈｉｎａ）　［Ａｂｓｔｒａｃｔ］０ｂｊｅｅｔｉｖｅ　Ｔｏ　ｅｓｔａｂｌｉｓｈ　ａ　ｒａｐｉｄ　ｅｏｓｉｎｏｐｈｉｌ　ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ　ｓｔａｉｎｉｎｇ　ｍｅｔｈｏｄ　ａｎｄ　ｉｍｐｒｏｖｅ　ｔｈｅ　ｑｕａｌｉｔｙ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｏｆ　ａｃｃｕｒａｔｅｌｙ　ａｎｄ　ｆａｓｔ　ｅｏｓｉｎｏｐｈｉｌ　ｃｏｕｎｔ　ｕｎｄｅｒ　ａｌｌ　ｋｉｎｄｓ　ｏｆ　ｃｉｒｃｕｍｓｔａｎｃｅｓ　ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ　ｔｈｅ　ｓａｔｕｓ　ｏｆ　ｅｏｓｉｎｏｐｈｉｌ　ｄｅｇｒａｎｕｌａｔｉｏｎ　ｏｒ　ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ　ｗｉｔｈ　ｃｏａｒｓｅ　ｐａｒｔｉｃｌｅｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ　７　５　ｐａｔｉｅｎｔｓ　ｗｈｏｓｅ　ｂｏｎｅ　ｍａｒｒｏｗ　ｓｍｅａｒｓ　ｈａｄ≥３．５　ｅｏｓｉｎｏｐｈｉｌｓ　ａｆｔｅｒ　Ｗｒｉｇｈｔ—Ｇｉｅｍｓａ　ｓｔａｉｎｉｎｇ　ａｎｄ　ｗｅｒｅ　ｄｒａｗｎ　ｗｉｔｈｉｎ　３　ｄａｙｓ　ｗｅｒｅ　ｓｅｌｅｃｔｅｄ　．２　ｏｆ　ｔｈｅ　ｂｏｎｅ　ｍａｒｒｏｗ　ｓｍｅａｒｓ　ｏｆ　ａｎｙｏｎｅ’Ｓ　ｗｅｒｅ　ｒａｎｄｏｍｌｙ　ｓｅｌｅｃｔｅｄ　ａｎｄ　ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ　ａｓｓｉｇｎｅｄ　ｔｏ　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎ—　ｔａｌ　ａｎｄ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｇｒｏｕｐｓ．Ｂｏｎｅ　ｍａｒｒｏｗ　ｓｍｅａｒｓ　ｉｎ　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　ｇｒｏｕｐ　ｗａｓ　ｄｏｎｅ　ｗｉｔｈ　ｅｏｓｉｎｏｐｈｉｌ　ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ　ｆａｓｔ　ｓｔａｉｎｉｎｇ　ａｎｄ　ｔｈａｔ　ｉｎ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｇｒｏｕｐ　ｕｎｄｅｒｗｅｎｔ　ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ　Ｗｒｉｇｈｔ——Ｇｉｅｍｓａ　ｓｔａｉｎｉｎｇ．Ｅｏｓｉｎｏｐｈｉｌｓ　ｐｅｒ—　ｃｅｎｔａｇｅ　ｗｅｒｅ　ｃｏｕｎｔｅｄ　ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｒｅｓｕｌｔｓ　Ｉｎ　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　ｇｒｏｕｐ　ｔｈｅ　ｅｏｓｉｎｏｐｈｉｌ　ｇｒａｎｕｌｅｓ　ｗｅｒｅ　ｓｔａｉｎｅｄ　ｂｌａｃｋ，ｓｈｏｗｅｄ　ａ　ｅｙｅ—ｃａｔｃｈｉｎｇ　ｄｉｓｐｌａｙ　ｕｎｄｅｒ　ａ　ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ　ｆｏｒ　ｆａｓｔ　ａｎｄ　ａｃｃｕｒａｔｅ　ｃｏｕｎｔｉｎｇ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｏｔｈｅｒ　ｃｅｌｌｓ　ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ　ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌｓ　ｈａｄ　ｔｈｅ　ｓａｍｅ　ｓｔａｉｎｉｎｇ　ｅｆｆｅｃｔ　ｃｏｍｐａｒｉｎｇ　ｗｉｔｈ　ｔｈａｔ　ｉｎ　ｃｏｎｒｏｌ　ｇｒｏｕｐ．Ｒｅｓｕｌｔｓ　ｃｏｒｎ—　ｐａｒｉｎｇ　ｗｉｔｈ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｇｒｏｕｐ　ｂｙ　ｔ　ｔｅｓｔ　ｈａｄ　ｎｏ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ　ｗｉｔｈ　Ｐ＞０．０５．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ　Ｒａｐｉｄ　ｅｏｓｉｎｏｐｈｉｌ　ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ　ｓｔａｉｎｉｎｇ　ｍｅｔｈｏｄ　ｃｏｍｐａｒｉｎｇ　ｗｉｔｈ　ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ　Ｗｒｉｇｈｔ—Ｇｉｅｍｓａ　ｓｔａｉｎｉｎｇ　ｈａｖｅ　ｔｈｅ　ａｄｖａｎｔａｇｅｓ　ｏｆ　ｆａｓｔ　ｓｔａｉｎｉｎｇ，ｄｉｓｐｌａｙｉｎｇ　ｅｏｓｉｎｏｐｈｉｌｓ　ｍｏｒｅ　ｖｉｓｉｂｌｅ　ａｎｄ　ｓａｍｅ　ｓｔａｉｎｉｎｇ　ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｏｔｈｅｒ　ｃｅｌｌｓ　ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ　ｎｅｕ—　ｔｒｏｐｈｉｌｓ．Ｔｈｉｓ　ｍｅｔｈｏｄ　ｉｓ　ｗｏｒｔｈ　ｂｅｉｎｇ　ｐｒｏｍｏｔｅｄ　ｆｏｒ　ｒａｐｉｄ　ｓｔａｉｎｉｎｇ　ｏｆ　ｂｏｎｅ　ｍａｒｒｏｗ　ｃｅｌｌｓ　ａｎｄ　ｐｒｏｐｅｒ　ｆｏｒ　ｑｕａｌｉ—　ｔｙ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｕｎｄｅｒ　ｖａｒｉｏｕｓ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ　ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ　ａｔｙｐｉｃａｌ　ｆｏｒｍ　ｅｏｓｉｎｏｐｈｉｌｓ　ａｎｄ　ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌｓ　ｗｉｔｈ　ｃｏａｒｓｅ　ｐａｒｔｉ—　ｃｌｅｓ．Ｔｈｅｎ　ａｃｃｕｒａｔｅｌｙ　ａｎｄ　ｅｆｆｅｃｔｉｖｅｌｙ　ｓｅｒｖｅ　ｔｈｅ　ｃｌｉｎｉｃａ１　ｄｉａｇｎｏｓｉｓ　ａｎｄ　ｔｒｅａｔｍｅｎｔ．　（Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ］　Ｂｏｎｅ　ｍａｒｒｏｗ　ｓｍｅａｒ；　Ｅｏｓｉｎｏｐｈｉｌｓ；Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ；　Ｃｅｌｌ　ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ；　Ｒａｐｉｄ　ｓｔａｉｎｉｎｇ　嗜酸性粒细胞在血液病的诊疗中具有一定意　义Ⅲ。在临床血细胞形态学检验工作中，常见嗜酸　中性粒细胞颗粒粗大染色呈杏黄色造成过多计数的　情况。这些情况容易导致嗜酸粒细胞分类错误而影　响病人临床诊治。对此，我们在反复试验探索的初　步工作基础上，于２００９年３月开始研究建立特异　性嗜酸粒细胞过氧化物酶快速染色方法。　性粒细胞形态不典型造成漏计数以及在疾病状态下　（收稿日期］２０１０—０２—１０　［修回日期］２０１０—０４—０１　（作者简介］李福德，男（１９６０年），汉族，主任技师　＊通讯作者（Ｔｏ　ｗｈｏｍ　ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｅｎｃｅ　ｓｈｏｕｌｄ　ｂｅ　ａｄｄｒｅｓｓｅｄ）　第５期　李福德等．嗜酸粒细胞过氧化物酶快速染色的研究　４９９　材料和方法　１．材料　１．１研究对象选取我院２００９年３月至２０１０年　６月间的骨髓穿刺涂片标本，要求常规瑞一姬染色　骨髓分类嗜酸粒细胞≥３．５　，取材３天内。共选　取７５例，每份标本中选取２张骨髓涂片标本，分　别人实验组和对照组。７５例患者中，缺铁性贫血２　例，急性白血病Ｍ４ＥＯ型２例，ＣＭＬ白血病３　例，其他型急性自血病１２例，淋巴瘤２４例，浆细　胞骨髓瘤４例，发热伴淋巴结肿大９例，实体瘤４　例，其他疾病１５例。　１．２试剂瑞氏粉，姬氏粉，甘油，无水甲醇，　３０　过氧化氢，碘化钾，磷酸氢二钠，磷酸二氢　钾。　１．３器材光学显微镜（０ＬＹＭＰＵＳ）ＢＸ５１，　日本。　２．方法　２．１　０．００３　过氧化氢瑞一姬染色液　瑞氏粉１．Ｏｇ放入研钵中，加入姬氏粉０．５ｇ，　加入甘油５ｍｌ连续研磨３分钟，用无水甲醇（北　京化工厂分析纯）５００ｍｌ反复溶解装入棕色试剂瓶　中，再加入３０　过氧化氢５０ｕｌ混均即可；　２．２　０．００９　碘化钾磷酸盐缓冲液（ｐＨ６．６）　碘化钾］８０ｍｇ，磷酸氢二钠０．６５６８ｇ，磷酸二　氢钾１．１８４９ｇ，加水至２００ｍｌ完全溶解；　２．３染色　骨髓涂片平放在染色架上，滴加０．００３　９，５过氧　化氢瑞一姬染色液０．５ｍｌ固定约５秒钟。滴加　０．００９Ｖｏ碘化钾磷酸盐缓冲液１ｍｌ混均，计时２分　钟，自来水冲洗，晾干后显微镜计数有核细胞２００　个，计算阳性细胞百分比。．对照组用常规瑞一～　姬染色　。　２．４对实验组和对照组的嗜酸性粒细胞进行计数　实验组阳性标准为胞浆见黑色颗粒（见图１）；　对照组同常规瑞一姬染色后计数方法。　２．５统计分析配对ｔ检验　统计学软件：ＳＡＳ９．１．３。　结　果　１实验组标本比对照组标本染色时间缩短约１５　分钟。　２光镜下观察，实验组标本中嗜酸性粒细胞颗　粒染成黑色，显示醒目，比对照组标本中嗜酸性粒　细胞易于识别；对包括中性粒细胞在内的其他细胞　染色效果在同对照组。　３嗜酸性粒细胞阳性原始计数相同例数为２７　例，不同者中百分数相差０．５　的有４４例，相差　１　的有２例。经配对ｔ检验，ｔ一０．５３３，Ｐ一　０．５９７，实验组标本嗜酸性细胞阳性率与对照组标　本嗜酸性粒细胞阳性率比较无统计学差异。　讨　论　嗜酸粒细胞过氧化物酶快速染色原理同一般的　碘化钾一过氧化物酶染色＿３］。研究初期，对［Ｈ　ｏ：］、［Ｋ１］、Ｉｎ　］等成分浓度和染色时间诸因素　通过反复大量试验进行优选，建立了显示嗜酸粒细　胞颗粒的方法。我们采用该方法在一年多的时间里　分别对７５例患者的骨髓涂片进行染色，结果完全　重复了这一现象。实验组除阳性细胞外的骨髓细胞　形态学计数其余各项经配对ｔ检验同对照组无显著　差异，证实了该方法染色对嗜酸性粒细胞的针对　性。破碎嗜酸粒细胞游离出的颗粒在实验组亦染成　黑色；嗜酸粒细胞脱颗粒显露出的细胞质染淡蓝　色，说明细胞质中除颗粒以外无过氧化物酶反应，　这些都为该方法的特异性提供佐证。　实验中发现，染色试剂常温放置６个月性质仍　稳定稳定，染色效果良好。这一染色方法的使用对　疾病状态下中性粒细胞粗颗粒和嗜酸粒细胞脱颗粒　等现象进行嗜酸粒细胞快速计数的质量控制具有实　际意义。实验组阳性细胞包括肿瘤性嗜酸粒细胞如　ＣＭＬ，Ｍ４ＥＯ等和正常嗜酸粒细胞如缺铁性贫血　和寄生虫病等，提示该方法适用的广泛性。　嗜酸粒细胞过氧化物酶快速染色兼有瑞一姬染　色效果。见图１，除２个阳性细胞外，其他所有细　胞染色均与对照组瑞一姬染色相似，见图２，染色　指标包括红细胞颜色、中性颗粒及嗜苯胺蓝颗粒、　核仁等。因该染色方法仅需２分钟，所以还能满足　临床诊疗工作中快速细胞染色的需要。　临床对嗜酸粒细胞快速检查的需要见有报　道　］，本方法检查嗜酸粒细胞简便快速准确，突破　性满足这一临床要求。该方法只显示嗜酸粒细胞过　氧化物酶活性的原理尚不清楚，分析原因可能为不　同类细胞颗粒内物质存在和组合状况影响了染色结　果，不除外过氧化物酶存在形式不同，导致对该染　色方法的反应不同。　该方法与传统瑞一姬染色比较嗜酸性粒细胞阳　性率无统计学差异，染色时间明显缩短，光镜下显　５００　中国组织化学与细胞化学杂志　南京，东南大学出版社，２００７：１２４—１２４　第１９卷　示醒目易变，证实了该方法在临床使用的可靠性和　优越性，期待该方法为临床诊治提供方便。　参　考　文　献　［１３　Ｈｏｇａｎ　Ｓ，Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ　Ｈ，Ｍｏｑｂｅｌ　Ｒ，ｅｔ　ａ１．Ｅｏｓｉｎｏｐｈｉｌｓ：　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ　ａｎｄ　Ｒｏｌｅ　ｉｎ　Ｈｅａｌｔｈ　ａｎｄ　Ｄｉｓｅａｓｅ．　Ｃｌｉｎ　Ｅｘｐ　Ａｌｌｅｒｇｙ，２００８。３８（５）：７０９—７５０　［３］陈万新，朱红淋，薛梅，等人．４种碘化钾一过氧化氢　法髓过氧化物酶染色结果比较．中国组织化学和细胞　化学杂志，２００８，１７（５）：４９７—５０１　Ｅ４］林健贤，张平，李永平。等人．ＨＥ和Ｇｉｅｍｓａ染色在　结膜刮片检测嗜酸粒细胞的染色比较，眼科学报，　２００５，２１（２）：７９—８１　［２］叶英妩，王巯三，申子瑜，全国临床检验操作规程，　●　・　１　热　图１箭头指嗜酸细胞Ｘ１０００　图２箭头指嗜酸细胞×１０００　Ｆｉｇ．１　Ａｒｒｏｗ　ｐｏｉｎｔ　ｔｏ　ｔｈｅ　ｅｏｓｉｎｏｐｈｉｌ　ｃｅｌｌｓ．×１　０００　Ｆｉｇ．２　Ａｒｒｏｗ　ｐｏｉｎｔ　ｔｏ　ｔｈｅ　ｅｏｓｉｎｏｐｈｉｌ　ｃｅｌｌｓ．×ｌＯＯＯ