3' Rapid Amplification of cDNA Ends (RACE) PCR
This technique is used to obtain the 3'end of a cDNA, it requires some sequence information internal to the mRNA under study. The sequence information obtained from this technique can be utilised to obtain full length cDNA clones using the 5'RACE technique.
The method I've used is loosely based on that given in 'PCR protocols: A guide to methods and applications', Academic Press Inc.
The protocol given uses SuperScript II reverse transcriptase (Life Technologies) and Taq polymerase from Boehringer Mannheim. You will need to adjust the reagents according to the enzymes you use. Reagents:
Sterile water (high purity, RNase-free)
5 x SuperScript RTase buffer (Life Technologies) 100mM DTT 2.5mM dNTPs
RNase inhibitor (Pharmacia)
SuperScript RTase (Life Technologies)
10 x PCR buffer (Boehringer Mannheim, contains 15mM MgCl2 ) 500mM dNTPs Mineral oil
RNA : Both total and polyA RNA are suitable for this technique. I recently compared the two and found the polyA RNA reaction to have the edge, but only just. I do recommend using polyA RNA for 5'RACE though. Primers:-
T17 Adapter primer (T17AP): GACTCGAGTCGACATCGATTTTTTTTTTTTTTTTT Adapter primer (AP): GACTCGAGTCGACATCG
Gene specific primer: Designed from known sequence, ideally it should an 18-22-mer with an annealing temperature of around 56℃, where a G/C = 4℃ and an A/T = 2℃.
cDNA 3’末端的快速扩增（3’-RACE）
反转录：
1、转移1pg至100ng的poly(A)+RNA或1ug总RNA到一只新的离心管。用水调整体积至9ul。将RNA样品在75℃变性5min，将离心管插入冰中冷却。 2、向这种含有已变性的RNA样品的离心管内一次加入如下试剂：
5×扩增缓冲液 10ul 20mmol/L4种d NTP混合液（ph8.0） 1.5ul 10umol/L（dT）17-接头引物（80pmol） 8ul 约20单位/ul胎盘Rnase抑制剂 1ul 100-200单位/ul反转录酶 1ul H2O补足至 50ul
反应管温育在37℃反应60min，设置3支阴性对照管。在一支对照管中加入合成第一链c DNA反应所需要的所有试剂，但不加模板RNA；第2支对照管加入除了反转录酶外的所有试剂；第三支对照管加入除了引物外的所有试剂。这些对照管进行所
有后续的实验步骤。设置这些对照管能保证cDNA产物不是由于污染或由RNA的自身引导所致。
3、用TE(PH7.6)将反转录产物（cDNA）稀释至终体积为1ml。 扩增：
4、按以下次序，将各成分加入在一直0.5ml灭菌离心管、扩增管或灭菌微量滴定板的孔内，建立PCR系列反应管：
已稀释cDNA 0-20ul 10×扩增缓冲液 5ul 20mmol/L4种 dNTP混合液 5ul 10umol/L（dT）17-接头引物（16pmol） 1.6ul 10umol/L接头引物（32pmol） 3.2ul 10umol/L基因特异性正义寡聚核苷酸引物（32pmol） 3.2ul 1-2单位热稳定DNA聚合酶 1ul H2O补足至 50ul
5、如果PCR仪没有配置加热盖，在反应混合液的上层应加一滴矿物油,防止样品在PCR反应多个加热与冷却的循环过程中蒸发。如果应该热启动PCR程序，在反应混合液的上层加一层石蜡油。放置离心管或微量滴定板在PCR仪上。
按以下方法进行PCR扩增。典型的程序有变性、复性和聚合；相应的循环条件与温度列表如下：
循环数 首轮循环 后续循环（20个） 末轮循环 变性 复性 聚合 94℃ 5min 50-58℃ 5min 72℃ 40min 94℃ 40s 94℃ 40s 50-58℃ 1min 50-58℃ 1min 72℃ 3min 72℃ 15min 6、抽提每种扩增样品5-10ul，用琼脂凝胶电泳或聚丙烯酰胺凝胶电泳来分析扩增结果，用DNA marker来判断片段的大小。凝胶一般用EB或SYBR 金颗粒染色后来观察扩增的量与片段大小。 7、若用矿物油覆盖在微量离心管内样品液体的上层，反应结果后可用150ul氯仿抽提去除。 8、从扩增的DNA产物中分离掉残余的热稳定DNA聚合酶和dNTP。
cDNA 5’末端的快速扩增（5’-RACE）
方法： 反转录：
1、转移1pg至100ng的poly(A)+RNA或1ug总RNA到一只新的离心管。用水调整体积至9ul。将RNA样品在75℃变性5min，将离心管插入冰中冷却。 2、 向这种含有已变性的RNA样品的离心管内一次加入如下试剂： 5×扩增缓冲液 4ul 20mmol/L4种d NTP混合液（ph8.0） 1ul 10umol/L基因特异性反义引物1 4ul 约20单位/ul胎盘Rnase抑制剂 1ul 50mmol/L MgCl2 1ul 100-200单位/ul反转录酶 1ul H2O补足至 20ul
反应管温育在37℃反应60min，设置3支阴性对照管。在一支对照管中加入合成第一链c DNA反应所需要的所有试剂，但不加模板RNA；第2支对照管加入除了反转录酶外的所有试剂；第三支对照管加入除了引物外的所有试剂。这些对照管进行所有后续的实验步骤。设置这些对照管能保证cDNA产物不是由于污染或由RNA的自身引导所致。 反转录产物的纯化：
3、去除过剩的寡核苷酸或随机六核苷酸引物可用水将反应液终体积稀释至2ml，然后用Centicon-100微量浓缩器。离心转速为500-1100g（2000-3000r/min，用Sorvall SS34 转头），温度在4℃和25℃之间离心20min。重复用水稀释步骤和离心步骤。转移潴留的液体到一支新的0.5ml离心管，用旋转真空抽干机使体积浓缩至10ul。 4、加入10ul体积的如下试剂至反转录cDNA样品中：
5×末端转移酶缓冲液 4ul 1mmol/L dATP 4ul
末端转移酶 10-25单位 反应管孵育在37℃水浴中反应15min。
5、 在80℃放置3min使末端转移酶灭活。使带有dA尾的cDNA样品用TE ph7.6稀释至终体积1ml 扩增：
6、按以下次序，将各成分加入在一直0.5ml灭菌离心管、扩增管或灭菌微量滴定板的孔内，建立PCR系列反应管：
已稀释cDNA 0-20ul 10×扩增缓冲液 5ul
20mmol/L4种 dNTP混合液 5ul 10umol/L（dT）17-接头引物（16pmol） 1.6ul 10umol/L接头引物（32pmol） 3.2ul 10umol/L基因特异性引物2（32pmol） 3.2ul 1-2单位热稳定DNA聚合酶 1ul H2O补足至 50ul
7、如果PCR仪没有配置加热盖，在反应混合液的上层应加一滴矿物油,防止样品在PCR反应多个加热与冷却的循环过程中蒸发。如果应该热启动PCR程序，在反应混合液的上层加一层石蜡油。放置离心管或微量滴定板在PCR仪上。 8、 按以下方法进行PCR扩增。典型的程序有变性、复性和聚合；相应的循环条件与温度列表如下：
循环数 首轮循环 后续循环（30个） 末轮循环 变性 94℃ 5min 94℃ 40s 94℃ 40s 复性 50-58℃ 5min 50-58℃ 1min 50-58℃ 1min 聚合 72℃ 40min 72℃ 3min 72℃ 15min 9、 抽提每种扩增样品5-10ul，用琼脂凝胶电泳或聚丙烯酰胺凝胶电泳来分析扩增结果，用DNA marker来判断片段的大小。凝胶一般用EB或SYBR 金颗粒染色后来观察扩增的量与片段大小。 10、若用矿物油覆盖在微量离心管内样品液体的上层，反应结果后可用150ul氯仿抽提去除。 11、从扩增的DNA产物中分离掉残余的热稳定DNA聚合酶和dNTP。
RACE技术-cDNA的获得
通过部分或全部测序鉴定了RACE产物后，可以通过两种选择获得全长的cDNA。通过PCR和克隆的方法。 通过PCR的方法获得全长cDNA：
1、扩增长的cDNA需要较长的延伸时间，但是如果延伸的时间过长，可以产生拖带，所以要慎重的设计引物。
2、根据从5„和3„RACE产物获得序列信息设计5‟和3„GSP引物。这些引物应该来自cDNA的3‟或者5„的末端，应该是23－28nt长。不应该在引物的末端加上限制性位点，这样会导致高背景。在某些时候可以设计3‟和5„的嵌套引物。但是还是应该先利用一对引物进行PCR反应。 3、进行如下的热循环：
94度30秒
25个循环：
（1）94度5秒
（2）72度2－15分钟
4、延伸的时间应该等于预期的cDNA长度加上2分钟。例如：预期得到6kb的条带，用6＋2＝8分钟的延伸时间。注意：如果没有条带或者条带弱，增加5个循环；或者优化PCR的条件。 5、在1.2%的琼脂糖凝胶上分析5μl的样品。通常情况下，可以见到一条单一带，如果这样，利用胶来纯化全长的cDNA。 6、制备1.2%的TAEbuffer制备琼脂糖凝胶。不使用TBEbuffer，TBE的胶很难制备全长的cDNA。 7、将剩下的45μl反应物点样，选用适当的marker。
8、利用长波紫外观察cDNA（≧300nm）切下全长的cDNA。注意：应该尽量减少紫外对cDNA的照射。
9、利用胶回收试剂盒回收cDNA。此试剂盒适合回收2.5kb以下的RACE产物；对于长的片段，可以通过电洗脱获得好的结果。如果你选择使用其他的纯化方法，最后用Tricine－EDTAbuffer30μl重新悬浮DNA样品。 10、将全长的cDNA克隆到T/A型的PCR克隆载体中。 通过克隆产生全长的cDNA：
1、如果你已经获得了含有重叠部分的5„和3‟RACE产物，同时在cDNA的重叠部分含有一个酶切位点的话，通过克隆技术可以获得全长的cDNA。
2、利用酶切获得的3„和5‟扩增产物，并且利用T4DNA连接酶将它们连接起来。利用接头和cDNA合成引物中的内切酶将最终的全长cDNA克隆到载体中。 3、在哺乳动物基因组中，NOT1和Srf1酶切非常稀少，大约106bp才出现一次，因此在绝大多数的cDNA中是不出现的。
RACE的扩增原理图
RACE技术-引物设计
基因特异性引物（GSPs）条件是： 1、23－28nt 2、50－70％GC
3、Tm值≥65度，Tm值≥70度可以获得好的结果需要实验者根据已有的基因序列设计5„和3„RACE反应的基因特异性引物（GSP1和GSP2).由于两个引物的存在，PCR的产物是特异性的。 4、cDNA的合成起始于polyA+RNA。如果使用其它的基因组DNA或总RNA，背景会很高。 5、RACEPCR的效率还取决于总的mRNA中目的mRNA的量和不同的引物有不同的退火和延伸温度。 6、在进行5„和3‟RACEPCR的时候应该使用热启动。
7、重叠引物的设计会对全长的产生有帮助。另外，重叠的引物可以为PCR反应提供一个对照。并不是绝对的要利用设计的引物产生重叠片段。 8、引物GSP中的GC含量要在50－70％之间。这样可以使用降落PCR。避免使用自身互补性的引物序列，否则会产生回折和形成分子内氢键。另外，避免使用与AP1互补的引物，尤其是在3„末端。 9、如果要用重叠片段来检测设计的引物，GSp1和GSp2之间至少是100－200碱基。只有这样才可以用扩增的产物来鉴定设计的引物是否正确。 10、降落PCR可以明显的增加RACEPCR产物的特异性。在最开始的循环中，退火温度高于AP1引物的Tm值，可以增加对特异性条带的扩增。随后的退火和延伸的温度降回到AP1的温度，可以进行随后的PCR循环。 11、验证基因特异性引物的对照：
单个引物的阴性对照：只用一个引物GSP来进行阴性对照。这样不应该产生任何的条带。如果可以看到明显的产物，应该改变循环的参数，或重新设计原始引物。 利用两个GSPS进行阳性对照：（只有两个GSP可以产生重叠的时候才可以采用此步。）为了确定RNA样品中目的基因确实表达，利用两个GSP和接头连接的 cDNA来产生阳性对照。可以产生两个引物之间的重叠大小的片段。如果没有这个片段，应该重复cDNA的合成，或者从一个不同的组织或细胞来源进行cDNA的合成。 12、制备和抽提polyA+RNA不要使用DEPC处理过的水。纯化完mRNA之后，利用琼脂糖凝胶电泳检测mRNA的质量。哺乳动物的mRNA样品是0.5－12kb的拖带，在其中有4.5和1.9kb的rRNA的条带。非哺乳动物的mRNA应略小。
RACE技术的分类和发展史
RACE(rapid-amplificationofcDNAends)是通过PCR进行cDNA末端快速克隆的技术，通过PCR技术实现的，无须建立cDNA文库，可以在很短的时间内获得有利用价值的信息。RACE是基于PCR技术基础上由已知的一段cDNA片段，通过往两端延伸扩增从而获得完整的3'端和5'端的方法。
RACE的扩增原理图
RACE技术-主要分类： 一般分5-和3-RACE两种。
3-RACE较简单，首先将mRNA或总RNA用PolyT引物反转录，根据一般基因具有polyA尾巴的特点，选用特异引物(根据已知序列设计)和PolyT引物PCR即可。大多实验者反映一次PCR可以搞定。
5-RACE相对较难，目前流行几种5-RACE。其一为加接头(传统)，根据接头引物和自己设计特异引物PCR，可以设计巢式PCR二次扩增。另外，有利用反向PCR技术，连接成环在PCR。还有，GENE公司一种smartRACEPCR，利用反转酶末断加C特点,直接加上多G接头，转换模板而无需用连接酶加接头。 RACE技术-发展历史：
RACE技术
经典的RACE技术是由Frohman等(1988)发明的一项技术，主要通过RT-PCR技术由已知部分cDNA序列来得到完整的cDNA5‟和3‟端，包括单边PCR和锚定PCR。该技术提出以来经过不断发展和完善，克服了早期技术步骤多、时间长、特异性差的缺点(Frohman等，1995：Schaefer，l995：Chen，1998：Bespalova等，1998：Matz等1999)。对传统RACE技术的改进主要是引物设计及RT-PCR技术的改进：改进之一是利用锁定引物((lockdockingprimer)合成第一链cDNA,即在oligo(dT)引物的3′端引入 两个简并的核苷酸【5′-Oligo(dT)16_30MN-3′,M=A/G/C;N=A/G/C/T】，使引物定位在poly(A)尾的起始点，从而 消除了在合成第一条cDNA链时oligo(dT)与poly(A)尾的任何部位的结合所带来的影响；改进之二是在5„端加尾时，采用poly(C)，而不是poly(A)；改进之三是采用RNaseH一莫洛尼氏鼠白血病毒(MMLV)反转录酶或选择嗜热DNA聚合酶可能在高温h(60度-70度)有效地逆转录mRNA，从而消除了5„端由于高CC含量导致的mRNA二级结构对逆转录的影响；改进 之四是采用热启动PCR(hotstartPCR)技术和降落PCR(touchdownPCR)提高PCR反应的特异性。
随着RACE技术日益完善，目前己有商业化RACE技术产品推出，如CLONTECH的MarathoTM技术和SMARTTMRACE技术术。邢桂春等(2001)先后使用上述两种试剂盒进行RACE反应，结果发现使用MarathonTM所得到的片断总是比采用
SMARTsup]TMRACE试剂盒到所得到的片断短。其原因在于 MarathonTM技术反转录反应往往不能真正达到mRNA的5‟末端。所以认为，进行RACE反应应当优选SMARTTMRACE试剂盒。
RACE PCR简介
基因特异性引物（GSPs）条件是： 1、23－28nt 2、50－70％GC
3、Tm值≥65度，Tm值≥70度可以获得好的结果需要实验者根据已有的基因序列设计5„和3„RACE反应的基因特异性引物（GSP1和GSP2).由于两个引物的存在，PCR的产物是特异性的。 4、cDNA的合成起始于polyA+RNA。如果使用其它的基因组DNA或总RNA，背景会很高。 5、RACEPCR的效率还取决于总的mRNA中目的mRNA的量和不同的引物有不同的退火和延伸温度。 6、在进行5„和3‟RACEPCR的时候应该使用热启动。
7、重叠引物的设计会对全长的产生有帮助。另外，重叠的引物可以为PCR反应提供一个对照。并不是绝对的要利用设计的引物产生重叠片段。 8、引物GSP中的GC含量要在50－70％之间。这样可以使用降落PCR。避免使用自身互补性的引物序列，否则会产生回折和形成分子内氢键。另外，避免使用与AP1互补的引物，尤其是在3„末端。 9、如果要用重叠片段来检测设计的引物，GSp1和GSp2之间至少是100－200碱基。只有这样才可以用扩增的产物来鉴定设计的引物是否正确。 10、降落PCR可以明显的增加RACEPCR产物的特异性。在最开始的循环中，退火温度高于AP1引物的Tm值，可以增加对特异性条带的扩增。随后的退火和延伸的温度降回到AP1的温度，可以进行随后的PCR循环。 11、验证基因特异性引物的对照：
单个引物的阴性对照：只用一个引物GSP来进行阴性对照。这样不应该产生任何的条带。如果可以看到明显的产物，应该改变循环的参数，或重新设计原始引物。 利用两个GSPS进行阳性对照：（只有两个GSP可以产生重叠的时候才可以采用此步。）为了确定RNA样品中目的基因确实表达，利用两个GSP和接头连接的 cDNA来产生阳性对照。可以产生两个引物之间的重叠大小的片段。如果没有这个片段，应该重复cDNA的合成，或者从一个不同的组织或细胞来源进行cDNA的合成。 12、制备和抽提polyA+RNA不要使用DEPC处理过的水。纯化完mRNA之后，利用琼脂糖凝胶电泳检测mRNA的质量。哺乳动物的mRNA样品是0.5－12kb的拖带，在其中有4.5和1.9kb的rRNA的条带。非哺乳动物的mRNA应略小。
RACE技术的分类和发展史
RACE(rapid-amplificationofcDNAends)是通过PCR进行cDNA末端快速克隆的技术，通过PCR技术实现的，无须建立cDNA文库，可以在很短的时间内获得有利用价值的信息。RACE是基于PCR技术基础上由已知的一段cDNA片段，通过往两端延伸扩增从而获得完整的3'端和5'端的方法。
RACE的扩增原理图
RACE技术-主要分类： 一般分5-和3-RACE两种。
3-RACE较简单，首先将mRNA或总RNA用PolyT引物反转录，根据一般基因具有polyA尾巴的特点，选用特异引物(根据已知序列设计)和PolyT引物PCR即可。大多实验者反映一次PCR可以搞定。
5-RACE相对较难，目前流行几种5-RACE。其一为加接头(传统)，根据接头引物和自己设计特异引物PCR，可以设计巢式PCR二次扩增。另外，有利用反向PCR技术，连接成环在PCR。还有，GENE公司一种smartRACEPCR，利用反转酶末断加C特点,直接加上多G接头，转换模板而无需用连接酶加接头。 RACE技术-发展历史：
RACE技术
经典的RACE技术是由Frohman等(1988)发明的一项技术，主要通过RT-PCR技术由已知部分cDNA序列来得到完整的cDNA5‟和3‟端，包括单边PCR和锚定PCR。该技术提出以来经过不断发展和完善，克服了早期技术步骤多、时间长、特异性差的缺点(Frohman等，1995：Schaefer，l995：Chen，1998：Bespalova等，1998：Matz等1999)。对传统RACE技术的改进主要是引物设计及RT-PCR技术的改进：改进之一是利用锁定引物((lockdockingprimer)合成第一链cDNA,即在oligo(dT)引物的3′端引入 两个简并的核苷酸【5′-Oligo(dT)16_30MN-3′,M=A/G/C;N=A/G/C/T】，使引物定位在poly(A)尾的起始点，从而 消除了在合成第一条cDNA链时oligo(dT)与poly(A)尾的任何部位的结合所带来的影响；改进之二是在5„端加尾时，采用poly(C)，而不是poly(A)；改进之三是采用RNaseH一莫洛尼氏鼠白血病毒(MMLV)反转录酶或选择嗜热DNA聚合酶可能在高温h(60度-70度)有效地逆转录mRNA，从而消除了5„端由于高CC含量导致的mRNA二级结构对逆转录的影响；改进 之四是采用热启动PCR(hotstartPCR)技术和降落PCR(touchdownPCR)提高PCR反应的特异性。
随着RACE技术日益完善，目前己有商业化RACE技术产品推出，如CLONTECH的MarathoTM技术和SMARTTMRACE技术术。邢桂春等(2001)先后使用上述两种试剂盒进行RACE反应，结果发现使用MarathonTM所得到的片断总是比采用
SMARTsup]TMRACE试剂盒到所得到的片断短。其原因在于 MarathonTM技术反转录反应往往不能真正达到mRNA的5‟末端。所以认为，进行RACE反应应当优选SMARTTMRACE试剂盒。
随着生物技术的不断发展，出现了许多克隆新基因的方法和手段，如图转座子标签技术、mRNA差异显示技术二基因组减法技术以及cDNA文库筛选技术,谱克隆技术、等。但上述方法人多具有实验周期长、技术步骤烦琐且工作量大等特点。cDNA末端快速扩增技术(rapid amplification of cDNA ends, RACE)是一种基于PCR从低丰度的转录本中快速扩增cDNA的5'和3’末端的有效方法，以其简单、快速、廉价等优势而受到越来越多的重视。
经典的RACE技术是由Frohman等(1988)发明的一项技术，主要通过RT-PCR技术由已知部分cDNA序列来得到完整的cDNA5’和3’端，包括单边PCR和锚定PCR。该技术提出以来经过不断发展和完善，克服了早期技术步骤多、时间长、特异性差的缺点(Frohman等,1995:Schaefer,l995: Chen,1998: Bespalova等,1998: Matz等11999)。对传统RACE技术的改进主要是引物设计及RT-PCR技术的改进:改进之一是利用锁定引物((lock docking primer)合成第一链cDNA,即在oligo(dT)引物的3'端引入两个简并的核苷酸【5'-Oligo(dT)16_30MN-3', M=A/G/C;N=A/G/C/T】，使引物定位在poly(A)尾的起始点，从而消除了在合成第一条cDNA链时oligo(dT)与poly(A)尾的任何部位的结合所带来的影响;改进之二是在5‘端加尾时，采用poly(C)，而不是poly(A);改进之三是采用RNase H一莫洛尼氏鼠白血.病毒(MMLV)反转录酶或选择嗜热DNA聚合酶可能在高温h (60 度 -70度 )有效地逆转录mRNA，从而消除了5‘端由于高CC含量导致的mRNA 二级结构对逆转录的影响;改进之四是采用热启动PCR (hot start PCR)技术和降落PCR(touch down PCR)提高PCR反应的特异性。 随着RACE技术日益完善，目前己有商业化RACE技术产品推出，如CLONTECH的MarathoTM技术和SMART TM RACE技术术。邢桂春等(2001)先后使用上述两种试剂盒进行RACE反应，结果发现使用Marathon TM所得到的片断总是比采用SMARTsup]TMRACE试剂盒到所得到的片断短。其原因在于Marathon TM技术反转录反应往往不能真正达到mRNA的5’末端。所以认为，进行RACE反应应当优选SMARTTM RACE试剂盒。以下就国内目前应用最广的SMART TM RACE试剂盒为例，简要概述RACE技术的原理和操作过程。 SMARTTM 3‘-RACE的原理是:利用mRNA的3‘末端的poly(A)尾巴作为一个引物结合位点，以连有SMART寡核营酸序列通用接头引物的
Oligo(dT)30MN作为锁定引物反转录合成标准第一链cDNA。然后用一个基因特异引物GSP1(gene specific primer,GSP)作为上游引物，用一个含有部分接头序列的通用引物UPM(universal
primer,UPM)作为下游引物，以cDNA第一链为模板，进行PCR循环，把目的基因3‘末端的DNA片段扩增出来。
仅扩增全长cDNA末端的高级RACE方法
为了获得全长的cDNA 5‟及3‟末端序列，许多研究人员使用了称之为cDNA末端快速扩增，或RACE的方法。传统的RACE方法得到的PCR产物含有全长及断裂的cDNA产物。GeneRacer™试剂盒确保您只得到含有全长cDNA末端的完整序列，是您得到更高效的结果并节省您的时间 GeneRacer™的优点：
能确定一个基因的全长序列对于研究异源转录起始和得到用于蛋白表达的开放阅读框至关重要。GeneRacer™是一种高级RACE技术，提高了扩增全长cDNA末端序列的效率。使用GeneRacer™试剂盒，您可以得到：
完整序列： 克隆基因片段的全长5'和3'末端以构建完整的cDNA序列。 灵敏： 得到每个细胞中拷贝数低至30的稀有转录本的全长5‟和3‟末端。 长度： 可以由长度至少为9kb的转录本得到cDNA。
仅通过一轮PCR反应就可以得到这些结果。一般不需进行巢式PCR，所以仅试一次就可以得到结果。全长5‟末端选择传统的RACE会得到多个PCR结果，因为其所使用的cDNA来源于断裂及全长mRNA。研究人员必须鉴定每一个PCR产物以获得带有全长5‟末端序列的产物。GeneRacer™只针对全长的5‟加帽mRNA，从而节省了花费在筛选大量PCR产物上的时间。图一 示意GeneRacer™的工作原理。RNA样品经CIP和TAP处理，保证GeneRacer™寡聚RNA仅同全长转录本连接。然后使用SuperScriptⅡ逆转录酶对这些转录本逆转录，得到的cDNA做为PCR的模板。GeneRacer™寡聚RNA序列做为GeneRacer™ 5‟引物结合位点，这样，只有具有全长5‟末端的cDNA才会被扩增。使用GeneRacer™步骤及高保真度Platinum® Taq DNA聚合酶，就可以确保得到最高效的实验结果。
敏感性和扩增长度：
为了说明GeneRacer™试剂盒获取全长5‟末端的能力，我们扩增了带有已知转录起始位点的基因的5‟末端。使用总RNA，遵循GeneRacer™步骤，我们扩增了一个长转录本（9kb）和一个浓度为0.01%，即30拷贝/细胞的稀有mRNA（见图2 ）。
图二 稀有转录本和长转录本的扩增结果
3.5μg Hela总RNA经GeneRacer™步骤处理，利用GeneRacer™的Oligo dT引物和
SuperScriptⅡ™得到cDNA，然后使用GeneRacer™ 5‟引物和基因特异性的引物PCR扩增。基因经过30-35个循环的一轮PCR扩增。50μl PCR扩增产物中的15μl在1.2％E-Gel®琼脂糖凝胶电泳检测，在光下观察。
泳道1：HPRT（次黄嘌呤磷酸核糖转移酶），1.3kb，30拷贝/细胞 泳道2：SMAP（胸腺激素受体共激活蛋白），3.1kb
泳道3：Cleavage and polyadenylation specificity factor，4.5kb 泳道4：TFRC（转铁蛋白受体），5.0kb
泳道5：IGFⅡR（类胰岛素生长因子Ⅱ受体），9kb，5‟末端GC含量90% 长度超过GenBank序列：
除了可以获得已知转录起始位点基因的全长5‟末端，GeneRacer™还可以获得未知转录起始位点基因的5‟末端。将GeneRacer™所得到的序列同GenBank列出的mRNA序列相
比较，GenBank的序列一般来源于使用传统方法构建的文库中的cDNA，这导致末端核苷酸的缺失。从表1 可以明显看出，使用GeneRacer™得到的5‟cDNA末端要比GenBank中列出的序列长16到116碱基。 表一 sequence beyond GenBank Gene GeneRacer™ Sequence GenBank Size(kb) Number(mRNA) Beyond GenBank 2.3 3.1 2.8 1.5 4.5 2.6 3.1 +62 +38 +16 +116 +49 +81 +52 Heterogeneous nuclear ribonuclear protein complex S74678 K protein(hnRNP K) Subunit for coatomer complex X70476 Muscle M26066 phosphofructokinase(PFKM) ADP-ribosylation factor 4 (ARF4) Isoleucil-tRNA synthetase Putative tumor suppressor(LUCA 15) Thyroid hormone receptor coactivating protein(SMAP） Cleavage and polyadenylation specificity factor Human insulin-like growth factor 2 receptor M36341.1 U04953 U23946.1 NM_006696.1 U37012.1 NM000876 4.5 9.0 +57 +44 表1说明 列出的基因使用GeneRacer™步骤扩增。PCR产物使用S.N.A.P.凝胶回收柱回收并克隆至pCR®4-TOPO®载体（Invitrogen）。对每一个基因都随机挑选了12个克隆并测序。序列同GenBank数据库中的序列相比较，确定5‟末端超出的序列。使用每个基因所获得的最长序列比较统计超出GenBank序列第一个碱基的多余碱基的数目。 获得全长的cDNA序列 GeneRacer™试剂盒确保您成功获得mRNA转录本的全长5‟和3‟序列。每个GeneRacer™试剂盒中包含CIP、TAP、RNA连接酶、SuperScriptⅡ™逆转录酶等酶类及其缓冲液，GeneRacer™寡聚RNA，GeneRacer™ Oligo dT引物，GeneRacer™ PCR引物及RNase抑制剂。同时试剂盒中还包括S.N.A.P.凝胶纯化柱以纯化PCR产物，还有TOPO Cloning®试剂盒以进行下游测序。使用GeneRacer™试剂盒，您可以高效地得到全长的cDNA 5‟和3‟末端序列，而不必浪费时间筛选部分缺失或断裂的序列。 RACE 技术在钓取白血病相关基因LRP16
[摘要] LRP16 是我们应用甲基化敏感的限制性界标基因组扫描( rest riction landmark genomicscanning , RL GS) 技术时发现的一个与白血病复发相关的新基因。为钓取这一新基因的全长cDNA ,本实验采用了cDNA 末端快速扩增法( rapid amplification of cDNA end , RACE) 。通过对RACE 法若干步骤进行优化,克隆得到了LRP16 基因cDNA 的5′2 与3′2 非翻译区,进而获得其全长及完整的开放阅读框架,并作为新基因被GenBank 收录。上述结果表明,RACE 技术是钓取未知基因全长cDNA 敏感而快速的方法,尤其是对5′2 及3′2 非翻译区的钓取更具有实用性。
关键词 白血病相关基因 LRP16 基因 cDNA RACE 技术。
LRP16 是我们用甲基化敏感的限制性界标基因组扫描( rest riction landmark genomic scanning ,RL GS) 技术时发现的一个与白血病复发相关的新基因[ 1 ] 。从该基因现有的一段DNA 碱基序列出发,通过与表达的序列标志(expressed sequence tag ,EST)库电子杂交并进行重叠片段的组装“, 克隆”得到一段870 bp 的序列。本研究采用了cDNA 末端快速扩增的方法( rapid amplification of cDNA end ,RACE) , 钓取了白血病相关基因LRP16 的全长cDNA。 材料与方法 实验材料：
标本 来源于健康男性外周血。引物及试剂 PCR 引物其中: 3′2 GSP1 的序列为
5′CCCTGC2AGAGCTGTAAGACTG 3′; 3′2 GSP2 的序列为5′GATCACCGGCGGCTATCG 3′; 5′2 RT2P 为5′GGAGCTCGGCAGCCTGACT 3′; 5′2 GSP1 为
5′GGAGCTGTTGGCGGCGTTGA 3′; 5′2 GSP2 为5′CCTCCCGCTGCTTGTCACT 3′; 5′2 GSP3 为5′CCAGTCGGTGGAGGTGCTCA 3′。RACE 试剂盒和TRIZOL Reagent 购于Gibco BRL , LifeTechnologies , Inc. Taq plus ⅠDNA 聚合酶。 方法：
总RNA 的提取 TRIZOL 一步法提取外周血单个核细胞总RNA ,1 %琼脂糖凝胶电泳证明其完整性且无DNA 污染。紫外分光光度计测OD260POD280= 1. 88 。3′末端cDNA 扩增(3′2 RACE) cDNA 合成:取总RNA 1μg ,锚定引物10 pmolPL (序列为
5′GGC2CACGCGTCGACTAGTACTTTTTTTTTTTTTTT2 TT3′) ,加SUPERSCRIPT ⅡRNase H- 反转录酶(200 U)于42 ℃反转录合成cDNA 后,RNase H 消化RNA。聚合酶链反应( PCR) : 用3′2 GSP1 ( 10 μmolPL ) 与AUAP 引物( 10 μmolPL , 其序列为5′GGCCACGCGTCGACTAGTAC 3′) 进行第一次扩增。反应条件分两步: ①94 ℃预变性4 分钟,55 ℃2分钟,72 ℃ 40 分钟; ② 94 ℃ 1 分钟,60 ℃ 1 分钟,72 ℃2 分钟,33 个循环,最后72 ℃延伸10 分钟。将第一次产物稀释后作为模板用3′2 GSP2 与AUAP(各10 pmolPL) 引物进行第二次扩增,条件为94 ℃预变性3 分钟,94 ℃1 分钟,60 ℃1 分钟,72 ℃2 分钟,33 个循环,72 ℃再延伸10 分钟。5′末端cDNA 扩增(5′2 RACE) 其方法:cDNA 合成及加尾: 取总RNA1μg , 5′2 RT2P2. 5 pmolPL 于70 ℃孵育15 分钟, 加反转录酶SUPERSCRIPT Ⅱ RT ( 200 U) 于50 ℃反转录合成cDNA后, RNase Mix 消化RNA。用GLASSMAXDNA
Isolation Spin Cart ridge 柱纯化cDNA。将纯化的cDNA 分成等体积2 份,分别加5 pmolPL 的dATP 与dCTP ,94 ℃孵育3 分钟后,置冰水中1 小时,在末端脱氧核苷酸转移酶( TdT) 作用下分别在cDNA 的3′端加入脱氧腺嘌呤( dA) 和脱氧胞嘧啶(dC) 多聚核苷酸尾。加A 尾
cDNA(dA2cDNA) 的PCR 扩增:用引物AP ,AUAP 与5′2 GSP1 对dA2cDNA 分两步进行第一次扩增。用引物AP (3 pmolPL) 合成cDNA 第二条链:96 ℃预变性5 分钟后加Taq plus ⅠDNA 聚合酶,于51 ℃退火2 分钟, 72 ℃孵育40 分钟; dA2cDNA的第一次扩增: 于上述反应基础上各加20pmolPL 的AUAP 及5′2 GSP1 ,扩增条件为96 ℃1 分钟,首次于68 ℃退火50 秒,以后每5 个循环降低1 ℃,64 ℃退火10 个循环,延伸条件为72 ℃ 1. 5 分钟,30 个循环结束后72 ℃继续延伸10 分钟。取第一次扩增产物为模板, 用5′2 GSP2 ( 10 pmolPL ) 及AUAP(10 pmolPL) 进行dA2cDNA 的第二次扩增,用引物5′2 GSP3 (10 pmolPL) 及AUAP (10 pmolPL) 第三次扩增,第二次与第三次扩增的条件均为96 ℃1分钟,64 ℃50 秒,72 ℃1. 5 分钟,共30 个循环。加C 尾cDNA ( dC2cDNA) 的PCR 扩增: 用引物AAP( 10 pmolPL , 序列为5′ GGCCACGCGTCGAC2TAGTACGGGⅡGGGⅡGGGⅡG 3′) 与5′2 GSP1
(10pmolPL) 对dC2cDNA 进行第一次扩增, 条件为96 ℃1 分钟,60 ℃ 50 秒,72 ℃ 1. 5 分钟,共30 个循环。用5′2 GSP2 (10 pmolPL) 及AUAP (10 pmolPL) 进行dC2cDNA 的第二次扩增,条件同dA2cDNA 的第二次扩增。 实验结果：
3′ RACE钓取cDNA 的结果首轮PCR 未见明显的特异带,半巢式PCR 结果显示在约530 bp 处有一亮带(图1) 。5′2 RACE钓取cDNA 的结果dA2cDNA 的PCR 扩增 首轮扩增有多条片段,与未加尾cDNA 扩增带谱相比较,在约400 bp的位置有明确的带的差异,第二次扩增在约180 bp处有一差异带,第三次PCR 的目的带在130 bp 的位置(图2) 。dC2cDNA 的PCR 扩增 首轮PCR 扩增未见明显的特异带,二次扩增可见一条约180 bp 的特异带,见图3 。
3种5’RACE技术的比较与优化 (1, 2, 3)
【摘要】 目的研究环化法、末端脱氧核糖核酸转移酶法和SMART反转录酶法3种常用5'RACE的技术的特点，并对它们进行了优化。方法 以播娘蒿RNA为模板，先按文献标准方法进行5'RACE，然后通过增加反应时间，提高部分反应物浓度等方法进行优化。结果 未优化前环化法和TdT酶法条带几乎不可见，SMART反转录酶法隐约可见条带，但不清晰。优化条件后，环化法出现弥散条带，TdT酶法胜之，但条带依旧弥散，而SMART反转录酶法最佳，获得清晰特异性条带。结论 SMART 5'RACE效果最好，其次为TdT酶法，环化法效果有待改进，同时通过优化条件可以明显增加产物的特异性，为实验研究中5'RACE方法的选择提供了依据。 【关键词】 5'RACE；比较；优化
Abstract：Objective To study the characters of Cycling 5'RACE,TdT 5'RACE and SMART 5'RACE methods and optimize them.Methods Standard 5'RACE ways were done at first with RNA templet of Descurainia sophia.Then they were optimized with delaying the reaction time and increasing the concentrations of some reactants.Results Before optimized,the gel-straps in Cycling 5'RACE and TdT 5'RACE were invisible.The gel-strap in SMART 5'RACE could be found but not clear.After
optimized,dispersed gel-straps appeared in Cycling 5'RACE,the result of TdT 5'RACE was better and still dispersed.The best was SMART 5'RACE,which got the clear and specific strap.Conclusion The result of SMART 5'RACE was best,TdT 5'RACE was better,and Cycling 5'RACE way was still under improving.With optimization,the specificity of the results could be obviously improved.It provided bases for choosing of 5'RACE methods in research.
Key words:5'RACE;comparison;eptimization
经典克隆未知基因的方法比如通过筛选文库等有个共同的弊病，即实验操作繁琐，周期较长、工作量繁重，且不易得到全长cDNA序列。近年来随着PCR技术的快速兴起和成熟，cDNA末端快速扩增技术(Rapid Amplification of cDNA Ends,RACE)为简洁方便的基因克隆发展道路指出了新的方向。RACE是利用PCR技术由已知的部分cDNA序列来获得完整cDNA末端的方法，又称为锚定或单边PCR，一般有两种RACE方法，分别用于扩增3'端或5'端。5'RACE比3'RACE更具有挑战性，其特异性较低，产物可能是单一产物、多个产物，甚至是不能分辨的连续条带。最终质量取决于扩增所使用锚定引物的特异性、目的mRNA 5端结构的复杂度和丰度及产物的长度等因素。可利用巢式引物扩增（最多进行三轮巢式扩增），增加逆转录保温温度和PCR退火温度，降低扩增反应中的镁离子浓度等方法增加5'RACE的特异性。本试验通过利用5'RACE技术获得播娘蒿CBF基因的5'端序列，对常用的环化法、末端脱氧核糖核酸转移酶法［1］及SMART反转录酶法［2,3］3种5'RACE方法进行比较和优化。 1 试验材料 1.1 模板
播娘蒿在25℃下生长30 d后，将完整植株放置于4℃下冷驯化12 h后，取其叶片提取RNA。 1.2 引物设计与合成
根据已知播娘蒿CBF基因的EST序列，设计5'RACE反。
2 试验方法 2.1 环化法
利用Takara公司的5'- Full RACE Core Set
2.1.1 首链cDNA的合成 反转录体系如下：1.5μl 10×RT Butter，0.5 μl RNase Inhibitor，1 μl AMV Reverse Transcriptase XL，1 μl 5端磷酸标记反转录引物，5 μl总RNA，再加入RNase Free dH2O至总体积15 μl。反应条件为30℃反应10 min，50℃反1h，80℃反应2 min。
2.1.2 RNA的分解 反应体系如下：15μl cDNA反应液，15 μl5×Hybrid RNA
Degeneration Buffer，再加入d H2O至总体积75 μl。将上述反应液加入1μl RNase H，30℃反应1 h；再加入100 μl灭菌蒸馏水，500 μl无水乙醇混匀后-20℃沉降30 min；12000 r离心10 min后去上清，用500 μl 70%乙醇洗涤后干燥。
2.1.3 通过连接反应将单链cDNA环化 向干燥的单链cDNA中加入8 μl的5×RNA(ssRNA)Ligation Buffer和12 μl的d H2O溶解，再加入20 μl的40%PEG#6000均匀混合，再加入1 μl T4 RNA Ligase，16℃反应24 h。
2.1.4 PCR反应 将上述反应液作为模板，以DK09与DK05为引物，用Ex Taq酶PCR，体系与反应条件与2.3相同，反应中退火温度60℃；
将第一次PCR反应液稀释10倍后作为模板，以DK 04与DK 06为引物，用Ex Taq酶进行第二次PCR，反应体系和条件如前，仅条件中的退火温度改为50℃。将第二次PCR产物电泳观察结果。
2.2 末端脱氧核糖核酸转移酶法
利用Takara公司的AMV Reverse Transcriptase
2.2.1 首链cDNA的合成 将14 μl的RNA与0.5 μl的引物DK01和1 μl的RNase inhibitor混合均匀，70℃放置10min后冰浴1min，短暂离心；随后加入2.5 μl的10×RT Buffer，1.25 μl的dNTP Mixture（各10mmol/L）和2.25 μl的DTT(100 mmol/L)，加去RNase水至总体积24 μl，混匀后42℃放置1 min，再加入1 μl的AMV Reverse Transcriptase XL，55℃下反应2 h，再70℃处理15 min后，短暂离心。
2.2.2 RNA的降解和cDNA的纯化 将前一步得到的25 μl cDNA和1 μl的RNase混合，37℃下放置30 min；随后加入80 μl无水乙醇沉降18h，12000 r离心10 min后去上清，加入100 μl的70%乙醇洗涤干燥，加入20 μl ddH2O溶解。
2.2.3 cDNA末端加尾 反应体系如下：5 μl 5×TDT Buffer，15 μl cDNA，2.5 μl
0.1%BSA，0.5 μl dATP（100mmol/L），加入ddH2O至总体积24 μl。将上述反应液94℃处理2～3 min后冰浴1 min，加入1 μl TdT，37℃放置12 h，然后65℃处理10 min，冰上冷却后短暂离心。
2.2.4 PCR反应 以上一步获得的反应液为模板，以DK01和Oligo dT-3sites Adaptor Primer为引物，用Ex Taq酶PCR，反应中退火温度为50℃，扩增15个循环；将第一次PCR的反应液稀释10倍为模板，以DK09与3sites Adaptor Primer为引物，用Ex Taq酶进行第二次PCR，反应中退火温度为60℃，扩增30个循环。将第二次PCR产物电泳观察结果。
2.3 SMART反转录酶法
利用CLONTECH公司的SMART 5'RACE反转录酶PowerScriptTM Reverse Transcriptase特殊的反转录能力进行5末端的扩增。
2.3.1 首链cDNA的合成 将2 μl的RNA与1 μl的5'-CDS Primer、1 μl的SMART II oligo和0.5 μl的RNase inhibitor混合均匀，70℃放置5 min后冰浴2 min，短暂离心；随后加入2 μl的5×First-Strand Buffer，1 μl的dNTP Mix（各10mmol/L）和2 μl的DTT(100 mmol/L)。
，混匀后再加入1 μl的PowerScriptTM Reverse Transcriptase，55℃下反应90min，加入50 μl的Tricine-EDTA Buffer稀释，再72℃处理7 min后，短暂离心。
2.3.2 PCR反应 将前一步获得的反应液为模板，以DK01和UPM为引物，用Ex Taq酶PCR，反应条件如下：94℃变性5 min；94℃反应30 s，72℃反应3 min，进行5次循环；94℃反应30 s，70℃反应30 s，72℃反应2 min，进行5次循环；94℃反应30 s，68℃反应30 s，72℃反应2 min，进行25次循环；然后72℃延伸10 min。
将第一次PCR的反应液用Tricine-EDTA Buffer稀释100倍为模板，以DK09与NUP为引物，用Ex Taq酶进行第二次PCR，反应条件下：94℃变性5 min；94℃反应30 s，68℃反应30 s，72℃反应2 min，进行20次循环；然后72℃延伸10 min。将第二次PCR产物电泳观察结果。 3 结果与分析
3.1 环化法5‟RACE
利用环化法5'RACE技术PCR的结果如图 1 中的A道，在1%琼脂糖凝胶电泳中几乎看不见目的大小条带，甚至是成型条带的出现，仅仅能够模糊的观察到一些弥散的扩增产物。没有出现目的大小扩增片段的原因可能是播娘蒿CBF mRNA反转录出的首链cDNA自身形成了高级结构，不适合RACE反应中关键的环化反应的进行，从而导致后期的特异引物扩增无法进行下去。至于模糊的弥散扩增产物可能是由于模板使用的总RNA中包含了播娘蒿几乎全部的遗传信息，特异性引物与其它基因非特异性退火扩增造成的。
3.2 末端脱氧核糖核酸转移酶(TDT酶)法5‟RACE TDT酶法5'RACE技术PCR电泳结果如图2中的A道，在1%凝胶电泳中可以观察到一条弥散的扩增条带，大约在400～500 bp之间的位置可以隐隐约约地分辨出一条较亮的条带，但是由于处在弥散的扩增产物条带中，无法进行胶回收测序。弥散扩增产物的出现可能有多个原因，除了由于模板使用总RNA导致背景较为复杂，Oligo dT退火温度较低易形成错误扩增的因素外，最大的可能是由于mRNA 5'端的结构复杂，GC含量高，易成二级结构，进而导致反转录出的首链
cDNA长短不一，之后TDT酶进行加尾时在所有的cDNA 3'末端都加上了一条ploy A尾。而较短的cDNA相对于较长的cDNA更容易进行PCR扩增，因此导致后面的扩增出现弥散的带。
3.3 SMART反转录酶法5‟RACE
利用SMART反转录酶进行5'RACE技术PCR电泳结果如图3中的A道，在1%凝胶电泳中可以明显观察到450bp左右的扩增条带，同时几乎没有非特异性扩增。导致5'RACE结果良好的原因除了由于SMART反转录酶本身的特性导致反转录到mRNA 5'末端才加上同聚尾的酶活性质外，还因为同聚尾与多聚引物采用G/C配对，这样后期的PCR中可以使用较高的退火温度，从而减少了引物与模板之间发生的非特异性扩增。 4 讨论
4.1 5‟RACE方法的比较
通过分子克隆技术获得未知mRNA的5'端序列不容易取得成功。通常存在于cDNA基因文库中的部分克隆，由于反转录酶未能沿全长mRNA模板延伸完全，或起始mRNA模
板过长或模板二级结构含量过高，导致合成的cDNA第一条链往往5'端不完整［4］。以往研究者们通过调整试验条件反复筛选cDNA文库来获得全长的cDNA克隆，但经常试验结果令人失望。这种技术的唯一出路在于重新构建与筛选额外的cDNA文库，复杂又
繁琐。1988年Frohman等提出了RACE技术，为获得mRNA的5'端序列提供了新的方法。 利用环化法5'RACE技术的原理即反转录后先用基因特异性引物PCR 扩增目的cDNA，接着在T4 RNA连接酶催化下使第一条cDNA 链环化，将得到的单链DNA做为模板， 用基因特异性引物进行PCR扩增5'端。因为这种方法的引物都是基因特异性的，所以非特异PCR产物基本上不会产生。但是在这种方法至关重要的关键性的环化中，可能由于mRNA的5端结构复杂，导致合成的第一条单链cDNA的3'端易形成高级结构，从而很容易导致环化反应失败。
末端脱氧核糖核酸转移酶法5'RACE技术原理即利用序列特异性引物1反转录总RNA，然后分离纯化反转录产物，用脱氧核糖核酸末端转移酶(TDT)给反转录的首链cDNA加上polyA尾，以Oligo(dT)-Adaptor为引物合成第二条cDNA链。然后用接头引物Adaptor和位于延伸引物序列上游的序列特异性引物2进行PCR扩增。
SMART反转录酶法的5'RACE技术原理基本上与末端脱氧核糖核酸转移酶法相似，如图4。利用3'末端序列引物5'-CDS Primer反转录总RNA，与TDT法不同的是，SMART反转录酶自身有个特性，即当反转录到末端的时候，也就是RNA/DNA双链结构末端的时候，它会自动在DNA链末端加上3个G。然后通过与接头引物SMART II-oligo结合继续延伸。以SMART II接头部分的引物的Long UP扩增第二条cDNA链，随后再以序列特异性引物GPS1和与Long UP接头部分互补的引物Short UP进行PCR的扩增阶段。
三种方法比较而言，除了RACE的共通优势和缺陷外，各有各自的好处和不足。环化法5'RACE技术的优点在于得到的非特异性PCR产物会比较少，因为它采用的引物都是序列特异性的。但是它有个最大的缺点就在于环化反应，如果扩增基因的5'端结构复杂或者二级结构比较多，会导致环化反应的失败，无法扩增目的条带。末端脱氧核糖核酸转移酶法5'RACE技术不存在环化的问题，整个方法经济便宜，但是也有不足。因为它使用的是TDT来进行poly dA加尾技术，一来poly dA与oligo dT的结合温度不高，PCR过程中容易出现错误扩增；二来TDT的连接效率很差，不容易加上poly dA尾。SMART反转录酶法5'RACE技术克服了上述缺点，它用G/C配对替代了A/T配对，利用反转录酶自身加上末端多聚体，但是它的缺点就在于价格过于昂贵，试验成本增加，而且对RNA质量要求很高。我们在具体试验中可以通过模板不同的性质和要求，选用不同的方法并对其进行适当的改进。
4.2 5’RACE技术的优化改进
尽管5'RACE的方法很有实用价值，但是许多研究中都观察到，要成功地应用这项技术还是很困难的。RACE技术的整个操作过程虽然非常简单，但是每个步骤都可能使其受到影响导致扩增失败。一般说来，失败的主要原因有两个。第一是反转录、加尾和PCR这三个连续的酶反应过程；第二是即使酶反应步骤能顺利进行，但常常会产生大量的非特异性或截短的产物背景。因此，自RACE技术出现及发展，一直都伴随着对RACE的各个步骤的改良。
反转录失败原因是因为在5'RACE过程中，有时候会产生截短的cDNA，它具有与全长分子同样的末端，如一条引物在它们的3'末端，而同聚物尾在它们的5'末端。由于截短的cDNA在后继的PCR中会优先扩增，因此反转录应尽量避免产生不完整的cDNA。解决方法有二：第一，尽量保证
获得高质量RNA，提高RNA的质量，为反转录提高良好的模板。第二，如果模板有较高的GC/AU比值，那么它比较容易在反转录过程中形成二级结构产生截短的cDNA。最好的解决方法是利用能在高温下进行有效反转录的嗜热DNA多聚酶进行反应。后期PCR结果失败的主要原因则是因为反转录的模板是总RNA，理论上它包括了试验材料所有的基因信息，导致扩增引物错误配对，导致扩增出不相干条带信息。因此我们常常在注意设计高退火温度扩增引物同时，还在第一次PCR后采用巢式PCR以减少非特异性产物的产生。
以上是RACE技术所需要的共同的常用改良方法，针对此三种RACE技术，针对它们不同的特点进行了不同的改进。
环化法5'RACE技术中最关键的一步就在于通过连接酶使单链cDNA环化。由于T4 RNA连接酶连接效率很低。因此，在试验中延长了连接酶的连图4 SMART反转录酶法5’RACE技术原理
Fig.4 Detailed mechanism of SMART 5'RACE reactions接时间，从16 h增加到24 h，希望能通过这样来提高环化的效率，结果如图1，其中的B道是技术改进前的结果，A道是改进后的结果。但可以看到无论改进前还是改进后都没有出现明显的扩增条带，可能由于二级结构太多或者连接酶优先连接了截短的cDNA，导致PCR产物凝胶电泳中无法分辨出目的大小片段。因此在找到更合适的改进方法前，此技术可能不适合于播娘蒿CBF基因的5'末端扩增。
末端脱氧核糖核酸转移酶法5'RACE技术中，能否在首链cDNA末端加上poly dA显得非常重要。由于TDT的连接能力很差，因此进行了几点改进：首先，将dATP的浓度从标准的0.5 mmol/L增加到了2 mmol/L；其次，在加入TDT前进行94℃变性3 min，使DNA的双链结构尽量变成单链；最后延长了TDT的作用时间，将它从标准的30 min延长到12 h。其结果如图2，技术改进前的B道与技术改进后的A道形成明显对比。可以清楚地看出技术改进几乎没有出现扩增产物，改进后虽然扩增产物较为弥散，但还是可以隐约分辨出目的大小的扩增条带。因此可以说明，以上三项改进成功得提高了TDT的连接效率，使的cDNA末端连上了poly dA。
SMART反转录酶法5'RACE技术比较而言是三种技术中最为成熟的。但是对于不同的试验对象仍然需要一定的改进。DTT是一种蛋白质保护剂，此外还有解开mRNA链5'端高级结构的作用。由于根据试验手册首次预试验结果不好，故对其DTT浓度进行改进，将它的浓度由2 mmol/L提高到4 mmol/L，结果如图3，改进前的B道与改进后的A道变化不大，但改进后目的条带的亮度显著增加了。说明提高DTT的浓度有效地减少了mRNA链的高级结构，使更多的反转录酶可以进行到mRNA链末端加上poly dC,使得RACE模板的含量增加，促使反应顺利进行。
RACE技术的成功应用已经显示出它是一种高效简便的技术手段。它除了在获得全长cDNA序列方面的应用外，随着生物学各项技术的交叉利用，对RACE技术的改良和发展，伴随着优化条件下PCR扩增效率和忠实度的提高以及PCR产物克隆技术的进步，相信RACE技术在基因克隆以及RNA剪接、基因家族和基因表达变化等多项领域研究中将会表现出大的应用价值。 【参考文献】
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